Summary
ここでは、効果的に相互神経経路を通じて染色蛍光ラベリング ビオチン標識デキストラン アミン (BDA) を明らかにする洗練されたプロトコルを提案します。微細構造の解析に適しています bda ラベル付けおよび共焦点レーザー走査型顕微鏡の下で他の神経要素からそれを区別します。
Abstract
ビオチン標識デキストランの高分子量アミン (BDA) は多くの長年に渡って非常に敏感な神経解剖学的トレーサーとして使用されています。ラベルの記載事項の品質が、ここでは、さまざまな要因によって影響を受けるので、中枢神経系における最適なニューラル ラベリングを勉強するため高分子量 BDA のアプリケーション我々 には、洗練されたプロトコルが提供します。繊細なガラス製ピペットによるラット視床の後内側腹側核 (VPM) に BDA の定位注射後 BDA 蛍光ストレプトアビジン-Alexa (AF) 594 で染色、蛍光ニッスル染色 AF500/525 counterstained。ニッスル染色緑の背景には、体性感覚野における赤 BDA ラベル付け、神経細胞の細胞体や軸索の端末を含むは示されたよりはっきりと。さらに、BDA の蛍光染色を倍増し、BDA のラベリングと皮質のターゲットでは、ローカルの神経を研究する機会を提供する太陽光発電肯定的な介在との相関を観察するカルシウム結合蛋白質パルブアルブミン (PV) を行った回路とその化学特性。したがって、この洗練されたメソッドだけは適していませんが高品質高分子量 BDA 視床と大脳皮質の間の相互の神経経路を介して標識神経を可視化するための同時デモを許可するも蛍光組織化学や免疫と他の神経マーカー。
Introduction
高分子量 BDA (10,000 の分子量)、高感度トレーサーは、20 年以上1中枢神経系の神経の経路をトレースするために使用されています。BDA の使用は一般的な神経路追跡法が、BDA のラベリングの品質を受けます動物の様々 な要因1,2,3。私たちの最近の研究では、BDA のラベルの最適な構造は、適切な投与後の生存時間に関連付けられているだけでなく、染色方法4とも相関を示されています。今、従来のアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体 (ABC)、ストレプトアビジンかに、ストレプトアビジン AF594 まで染色法は以前研究2,3、BDA のラベル付けを明らかにするため使用されました。 4,5。比較では、BDA の蛍光染色を簡単に実行できます。
高分子量 BDA のアプリケーションを拡張するために洗練されたプロトコルは本研究で導入されました。ラット脳における視床 VPM に BDA の注入、BDA ラベリングした二重蛍光染色による、BDA のラベリングの相関関係を観察するため実施しただけでなく、正規標準 ABC 染色法によって明らかにされた、基本的です神経素子または介在ニューロン PV-免疫蛍光ニッスル組織化学やストレプトアビジン AF594 の皮質のターゲットにそれぞれ。VPM と一次体性感覚野 (S1)6,7,8間相互の神経経路を重点的に投影視床皮質軸索で視床ラベリング BDA の着眼点S1 で投影された細胞細胞体。これにより、高分子量 BDA、ニューラル ラベルの高品質を取得するための詳細なプロトコルだけでなく、BDA の蛍光標識の組み合わせと他の蛍光神経マーカーと洗練されたプロトコルを提供する予想組織化学や免疫。この方法は、局所神経回路と共焦点レーザ走査型顕微鏡の下で、化学的性質を研究することが望ましいです。
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Protocol
本研究は倫理委員会で、中国中国医学科学院 (参照番号 20160014) によって承認されました。すべてのプロシージャは、ケアおよび実験動物の使用 (国立アカデミー出版、ワシントン d. c.、1996) 国立の機関健康ガイドにしたがって運営しました。4 成熟雄ラット (重量 250 280 g) は、この研究で使用されました。すべての動物は制御温度と湿度、12 h 明暗サイクルで収容され、食料や水への無料アクセスを許可しました。楽器と本研究で使用される材料は、図 1に示しただった。 手術前に脳定位固定装置フレーム、ガラス ピペットなど、すべての楽器は、70% エタノールを使用してクリーニングされました。
1. 手術
- VPM 定位アトラス9 (図 2 a) を使用して対象の座標エリアを決定します。
- ガラス マイクロ ピペット (約 10-20 μ m の先端径) と装備 1 μ L マイクロ シリンジを準備 (図 1) と流動パラフィンをテストします。
- 7% 抱水クロラール (0.7 mL/100 g) をラットの腹腔内投与による麻酔します。
- 深い麻酔が確認されればピンチの尾を持つと逃避反射をペダル、電気かみそりを持つ動物の頭の上を剃る、70% エタノールをそれぞれ続いて 10% ポビドン ヨードと手術部位の 3 回をスクラブします。
- 耳に鈍耳バーを配置することによってラットに脳定位固定装置とラットの上顎中切歯口ホルダー (図 1E) に置き、目に眼軟膏を適用します。
- 70% のエタノールを使用して再度手術部位の頭の肌をクリーンアップします。無菌条件下で手術を維持するために、滅菌手術用手袋とタオルを使用します。
- 矢状縫合 (図 1 f) に沿ってメスで皮膚の矢状切開を行います。
- 筋肉や骨膜出血 (図 1 f) コントロールに手術中の滅菌綿棒を使用して頭蓋骨からをこすり。
- アトラス (図 2 a) からあらかじめ定義された座標を使用して、開頭術 (図 1) の場所 (-3.30 mm 前ポイント、2.6 mm 右正中線) を決定します。
- ラウンド先端ビット (#106) (図 1 H) とバリ ドリルを使用して開頭手術を行い (図 1I) 髄膜に到達するまでわずか数分約 1 mm の深さにドリルを続行します。
- 注射部位 (図 1I) 経由で大脳皮質を公開する microforceps を用いた硬膜を切除します。
- 10 %bda (蒸留水で分子重量の 10,000) ソリューション (図 1 j) とマイクロ注射器で液体パラフィンを変更します。
- マイクロインジェクション装置の上に注射器をマウントし、マイクロ ポンプ (図 1 K) で接続します。
注: 注入ボリュームはマイクロ ポンプの速度に依存します。ここでは 30 nL/min (図 1 L) を調整します。 - 、顕微鏡下で 5.8 mm (図 1 M) の深さで脳の皮質表面を通って VPM にマイクロインジェクション装置と手動でガラス マイクロ ピペットを挿入します。
- 圧力注入、100 nL 10% のマイクロ ポンプ (図 1 L, M) で 3 分 (35 nL/min) の期間にわたって VPM に BDA。
- 注入後、さらに 5 分間位でピペットを維持し、ゆっくりと引き出します。
- 滅菌のスレッド (図 1 n) に傷を縫合します。前と手術後の鎮痛のため、ローカル動物の世話委員会ガイドラインに従います。
- それは意識を取り戻すは完全に回復するまで、温かみのあるリカバリ領域にラットを配置します。
- そのケージに戻って回復したラットを返します。
2. perfusions とセクション
- 通常 10 日間の生存期間後、安楽死を誘導するために腹腔内投与による 10% ウレタン (2 mL/100 g) の過剰摂取で動物を注入します。
- フード (図 1O) 実験的ラットを灌流します。
- 呼吸が止まればははさみや鉗子を使用して中心部にアクセスするラットの胸腔を開きます。左心室、大動脈の方に静脈カテーテルを挿入し、右の耳介を開きます。
- 最初 0.9% リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 生理学的温度 (37 ° C) での灌流心臓から出る血になるまで約 1-2 分をオフに、0.1 M のリン酸バッファー (PB, pH 7.4) の 250-300 mL 4% パラホルムアルデヒドを続行します。
- 灌流後、頭部の皮膚を切開、頭蓋骨を開き、ラットの脳を解剖します。後 2 時間室温 (26 ° C)、30% のショ糖 0.1 M PBS (pH 7.4) 脳はソリューション (図 1 P) に浸漬されるまで 4 ° C で 3 日間で cryoprotect で 4% パラホルムアルデヒドで切り裂かれた脳を修正します。
- 脳は溶液中浸漬、一度脳を脳行列 (図第 1 四半期) の歯冠方向に 3 つのブロックに分割します。中央ブロックには、VPM と S1 が含まれています。
- 歯冠方向にスライディング ミクロトーム凍結段階で 40 μ m で脳の中央部をカットします。(数字 1 rS) 0.1 M PBS (pH 7.4) と 6 も皿に整然としたこれらのセクションを収集します。
3. 標準 ABC 染色
注: 標準 ABC 手順10と BDA の分類を可視化する、脳のすべての 3 番目のコロナ セクションから無料浮動セクションが使用されました。
- 約 1 分の 0.1 M PBS でセクションをすすいでください。
- インキュベートの 0.1 M PB で 1 %abc ソリューションのセクション (pH 7.4) 含む 0.3% トリトン X-100 室温で 1 時間。
- 3 倍 50 mM Tris バッファー (pH 7.4) のセクションを洗います。
- 0.02 %3、tetrahydrochloride 3'-ジアミノベンジジン (軽打)、室温で約 2-5 分の 50 mM Tris バッファーの 0.01% H2O2を含むソリューション内のセクションを染色します。
- 3 倍 50 mM Tris バッファー (pH 7.4) のセクションを洗います。
- 標準の組織化学的手法 (図 1 t;補足動画ファイル III、血流とのセクションを参照してください) を使用して顕微鏡のスライドのセクションをマウントします。
- 一晩常温空気中セクションを乾燥させます。
- アルコール (50%、70%、95%、100%) ソリューションのシリーズに簡単にセクションを脱水します。約 15 のための各ソリューションのスライドを水没 s。各ステップの間を乾燥させるスライドできないようにします。
- キシレンのセクションをオフに 3 回、約 20 分。
- スライスのバルサムの 2 または 3 滴を置くのセクション coverslips を配置します。
4. 二重蛍光染色 BDA と大脳皮質における基本的な神経要素
注: 一方、二重蛍光染色を行った BDA ラベリングの相関関係を観察するためして蛍光ニッスル染色 AF500/525 counterstained 上記に隣接するセクションの基本的な神経要素ストレプトアビジン AF594 で使用します。
- 約 1 分の 0.1 M PBS でセクションをすすいでください。
- インキュベート ストレプトアビジン AF594 (1: 500) と 0.1 M PBS の AF500/525 緑蛍光ニッスル染色 (1:1, 000) の混合溶液中のセクション (pH 7.4) 含む 0.3% トリトン X-100 室温で 2 時間。
- 3 回で 0.1 M PB (pH 7.4) セクションを洗います。
- 標準的な組織化学的手法を用いた顕微鏡のスライドのセクションをマウントします。約 1 時間のための空気の部分を乾燥させます。
- Coverslips を観察する前に蒸留水で 50% グリセリンで蛍光のセクションに適用されます。
5. 二重蛍光染色 BDA と大脳皮質における介在ニューロン
注: 二重蛍光染色 BDA ラベリングとストレプトアビジン AF594 と PV 免疫血清皮質ターゲットの代表的なセクションの介在との相関を観察するため行った。
- 約 1 分の 0.1 M PBS (pH 7.4) の代表的なセクションをすすいでください。
- 3% ヤギ血清および 0.3% を含むブロック ソリューションのセクションを孵化させなさい 30 分の 0.1 M PBS でトリトン X-100。
- マウス モノクローナル抗-PV IgG (1:1, 000) 0.1 M PBS (pH 7.4) 含有 1% ヤギ血清と 0.3% の溶液にセクションを転送 4 ° C で一晩トリトン X-100
- 次の日に 3 回で 0.1 M PBS (pH 7.4) セクションを洗います。
- ヤギ抗 mouse AF488 二次抗体 (1: 500)、ストレプトアビジン AF594 (1: 500) と 4', 6-diamidino-2-phenylindole 塩酸 (DAPI、1:40, 000) 0.1 M PBS (pH 7.4) 含有 1% ヤギ血清 0.3 の混合液にセクションを公開 % トリトン1 h の X-100。
- 4.3 から 4.5 の手順を繰り返します。
6. 観察
- VPM、視床皮質軸索および視床ニューロンの画像を取る。
- 対物レンズを備えた共焦点イメージング システムと蛍光試料を観察 (4 x、NA: 0.13; 10 x、NA: NA 0.40; 40 x: 0.95)。405 (青)、488 (緑) の励起・発光波長と 559 (赤) nm を使用します。
注: ここでは、共焦点ピンホールは 152 μ m (4 x、10 x) および 105 μ m (40 倍)。イメージ キャプチャの空間解像度は 1024 × 1024 ピクセル (4 x、10 x)、640 × 640 ピクセル (40 倍)。 - 各セクションからの厚さ 40 μ m (Z シリーズ)、2 μ m の連続するフレームの 20 の画像を取る。
- 共焦点画像処理三次元を次のように分析するためのソフトウェア システムと単一焦点のイメージ画像に統合: 開始フォーカル プレーン セット end フォーカル プレーン セット ステップ サイズ → → 深パターン → イメージ キャプチャ → Z シリーズを選択します。
- 対物レンズを備えた共焦点イメージング システムと蛍光試料を観察 (4 x、NA: 0.13; 10 x、NA: NA 0.40; 40 x: 0.95)。405 (青)、488 (緑) の励起・発光波長と 559 (赤) nm を使用します。
- デジタル カメラを搭載した光顕微鏡による明視野画像を撮影 (4 x、NA: 0.13; 10 x、NA: NA 0.40; 40 x: 0.95 レンズ)。明るさとコントラスト画像の調整し、ラベルを追加する 500 さん使用の写真編集ソフトウェアの露光時間を使用します。
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Representative Results
VPM に BDA の 10 日間のポスト注入の生存は強烈なニューラル ラベル対応する皮質領域に注入側 (図 2) に同側の生産のために十分だった。従来の ABC、蛍光染色し、BDA の手順同様 anterogradely を含む、S1 の神経ラベリングの視床皮質軸索をラベルし、逆行性標識視床細胞 (図 2、D を明らかにしました。).
軸索をラベル付け anterogradely、レイヤー 4、高密度層 6 層 2 から観察され、視床皮質軸索の典型的なタイプは樽地域 (図 2D) で観察されました。高い拡大で軸索のトランク、枝、販促物、小さな下肢 (図 3 a) のことを明示 BDA ラベリングします。表示するラベルの付いた視床皮質軸索の下逆行性標識皮質錐体細胞が表示されていたし、5/6 層に分布、細胞体、樹状の拡張レイヤー 2 (図 2D) します。神経細胞の細胞体や樹状突起にはスパイン、ゴルジのような解像度 (図 3 b) として表示されるだけでなく提示 BDA ラベリング。
さらに、蛍光二重染色も行った BDA ラベリングとストレプトアビジン AF594 と PV 免疫血清皮質ターゲット介在ニューロンとの相関を観察するため。皮質のターゲットでラベリング BDA、周り PV 陽性ニューロンは層 6 層 4 (図 4 a) で高濃度にレイヤー 2 から配布されました。BDA でラベル付けされる PV 陽性ニューロンがなかった、PV 陽性細胞体と BDA ラベル皮質錐体細胞 (図 4 b, C の周り PV 陽性軸索端末の表面を軸索端末の BDA ラベルが見つかりましたが、).
図 1。手術の重要なステップ、この実験で使用される主な楽器の写真。
A: 脳定位固定装置です。B: 歯科用ドリル。C: 手術器具(メス、microforceps、等) D: マイクロ注射器ガラス ピペットを装備。E: 脳定位固定装置にラット頭部を配置。F: 手術部位をきれい。G: 前のポイントの確認します。H: 頭蓋骨をドリルします。私: 大脳皮質を公開します。J: 負荷 10% マイクロ シリンジに BDA。K: マイクロ射出成形装置に注射器をマウントします。L: マイクロ ポンプの速度を調整します。M: ガラス マイクロ ピペットを挿入、VPM。N: 滅菌糸で傷口を縫合します。O: ボンネットのラットを灌流します。P: 脳を解剖。Q: 脳の脳行列を 3 ブロックに分割します。R: スライディング ミクロトーム系凍結段階で脳をカットします。S: 6 よく皿に整然とした脳のセクションを収集します。T: 顕微鏡のスライドのセクションをマウントします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。注射部位と体性感覚野における高分子量 BDA の典型的な神経ラベリングします。
A: 脳定位固定装置アトラス注射部位を決定します。B: ニッスル染色緑の背景 (VPM) 視床の後内側腹側核 (赤) BDA の注射部位を示す代表的な顕微鏡写真。C: 蛍光 BDA 標識、視床皮質軸索層 4 層 5/6 の視床のニューロンなどの顕微鏡写真。D: 従来 BDA は、BDA の蛍光標識するニューラル ラベリングの同様のパターンを示す標準アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ手順との分類の顕微鏡写真。VPL、視床の後外側腹側核。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3。高分子量 BDA ニッスル染色緑の背景に神経ラベルの高品質。
A: anterogradely の上位の倍率表示ラベル軸索のアーバーの詳細 (赤)。B: 逆行性標識神経細胞体、樹状突起、および樹状突起スパインの詳細に (赤) を示す高解像度写真。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。BDA のラベリングとカルシウム結合蛋白質 PV 陽性介在ニューロン皮質のターゲットとの相関。
A: BDA ラベリング (赤) の分布と体性感覚野における PV 陽性介在ニューロン (緑)。B: BDA というラベルの付いた軸索とレイヤー 4 の PV 陽性ニューロンの分布の上位の倍率表示。C: 5/6 層の BDA ラベル皮質錐体細胞 (赤) と (緑) で太陽光発電正介在ニューロンの高解像度写真。すべてのサンプルは、DAPI (青) と counterstained いた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足動画ファイル:補足動画は、VPM、灌流、断面、および結果に BDA の注入手術を簡単に表示します。ビデオ ファイルの名前「IV。代表結果"三次元共焦点レーザー スキャン顕微鏡および分析システムの結果が表示されます。高解像度のアニメーションは、くわしく (赤) 逆行性標識神経細胞体、樹状突起、および樹状突起スパインを示します。このファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
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Discussion
成功した神経トレース実験のための重要なステップは、適切なトレースを選択します。BDA、高分子量 BDA の家族で (分子量 10,000) は、低分子量 BDA (分子量 3,000)2,3と対照をなして前向性神経経路を介して運ばれる優先的に推奨されました。,11,12,13。 ただし、多くの研究はまた前向性トレース1,2,3と並行して逆行性経路トレースの BDA かもしれない潜在的使用もその高分子量を示唆。VPM と S1 の間相互の神経経路を介して高分子量 BDA は双方向管トレース4に適している考えを支持するさらなる証拠を提供されます。このドメインで同様の方法で高分子量 BDA も使用された視覚と聴覚における背側の外側膝状体と大脳皮質聴覚野と視覚野内側膝状体の間の相互接続を調べるため3,14。
神経トレース実験で他の重要な考慮事項は神経の分類のための染色の選択です。従来の研究のほとんどは、の従来の ABC プロトコルおよび染色法蛍光ストレプトアビジンの両方されている BDA のラベルを検査するために使用し、同様、明らかに形態1,2,3,4,5。 ここでは、そのストレプトアビジン AF594 はのみ適切な選択肢ではなかったとわかった BDA ラベル、蛍光ニッスルなど太陽光発電-抗原、その他神経マーカーと組み合わせることにも適した BDA の相関関係を観察するための新しい機会を提供します。ラベリングおよび他の神経要素。BDA と他の神経マーカーに対して従来の二重染色法は、2 色塗り手順14,15にもよく行った、下の三次元解析システムを使用して適してではない、共焦点レーザー走査型顕微鏡。技術的な観点からは、本研究は、はっきりと BDA のラベルと他のラベル間を比較する貴重なリファレンスを提供します。
神経管のトレース方法、注射部位と神経システムのターゲット間の神経接続を明らかに最初に使用されました。しかし、研究者は、まだ適切なトレーサー16,17ニューラル ラベリングの理想的な構造を追求していた。西洋ワサビペルオキシダーゼとコレラ毒素の B サブユニットなど他のトレーサーと対照をなして高分子量 BDA 生成ニューラル ラベリング アーバー軸索および樹状16,17 の数を定量化するための高品質.BDA のラベリングの定量分析は、本研究ではない行った、BDA と神経の分類の高品質密接にラベル付き軸索アーバーと神経の形態学的特徴を理解するより多くの機会が用意されています樹状突起。
他の多くのトレーサーのアプリケーションと同様に、一連の重要な問題を考慮すべきこの実験の手順を含む: 濃度と注入、注入の適切なサイト、ガラス ピペットの先端径 BDA のボリューム手術のプロセス、最適な生存期間、灌流、セクション、および顕微鏡下で観察します。それは直接、我々 が期待したものをラベリング BDA の品質に関連付けられています。重要な手順を上記に加えて注入されたサイトからは実験3、で使用されるモデル動物種に依存してラベルのターゲットまでの距離などの注意を必要とする技術的な制限があります。5,18.、つまり成功トレース研究全体の実験の手順ですべてのステップに依存します。
現在の研究では、染色法、蛍光 BDA が、神経のラベルの高品質を得るための効果的な方法であることを実証する洗練されたプロトコルを使用して他の神経マーカーと同時に組み合わせることができますをしてきました蛍光組織化学や免疫。従来 BDA 染色 DAB プロシージャと比較するより簡単に BDA のラベリングの微細構造の分析ができ的存在の蛍光顕微鏡共焦点レーザー トレース対象の他の神経要素と区別するためアプローチ。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は、国家自然科学基金、中国の (プロジェクト コード番号 81373557; 号 81403327) によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotinylated dextran amine (BDA) | Molecular Probes | D1956 | 10,000 molecular weight |
| Streptavidin-Alexa Fluor 594 | Molecular Probes | S32356 | Protect from light |
| 500/525 green fluorescent Nissl stain | Molecular Probes | N21480 | Protect from light |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Confocal imaging | Olympus | FV1200 | |
| system | |||
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Sprague Dawley | Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences | SCKX (JUN) 2012-004 | |
| Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS5 |
References
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