Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Forbedre anvendelsen av høy molekylvekt Biotinylated dekstran Amin for Thalamocortical projeksjon sporing i rotte

Published: April 12, 2018 doi: 10.3791/55938
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en raffinert protokoll for å effektivt avsløre biotinylated dekstran Amin (BDA) merking med et fluorescerende flekker metoden ved hjelp av en gjensidig nevrale sti. Det er egnet for analyse av fine strukturen av BDA merking og skille den fra andre nevrale elementer under en AC confocal laserskanning mikroskop.

Abstract

Høy molekylvekt biotinylated dekstran Amin (BDA) har blitt brukt som en svært følsom nevroanatomi tracer i mange tiår. Siden kvaliteten på sin merking ble påvirket av ulike faktorer, her gir vi en raffinert protokoll for anvendelse av høy molekylvekt BDA for å studere optimal nevrale merking i sentralnervesystemet. Etter stereotactic injeksjon av BDA i ventrale posteromedial kjernen (VPM) i thalamus med rotta gjennom en delikat glass pipette, var BDA farget med fluorescerende streptavidin-Alexa (AF) 594 og counterstained med fluorescerende Nissl flekk AF500/525. På bakgrunn av grønne Nissl flekker, ble den røde BDA merking, inkludert neuronal cellen legemer og axonal terminaler, mer tydelig demonstrert i somatosensory cortex. Videre doble fluorescerende flekker for BDA og kalsium-bindende protein parvalbumin (PV) ble utført for å observere korrelasjon av BDA merking og PV-positive interneurons i kortikale målet, gir mulighet til å studere lokalt nevrale kretser og deres kjemiske egenskaper. Dermed dette raffinert metoden er ikke bare egnet for å visualisere høykvalitets nevrale merking med høy molekylvekt BDA gjennom gjensidige nervebaner mellom thalamus og hjernebarken, men også tillater samtidig demonstrasjon av andre nevrale markører med fluorescerende histochemistry eller immunochemistry.

Introduction

Høy molekylvekt BDA (10.000 molekylvekt), en svært følsom tracer, har blitt brukt for å spore nervebaner i sentralnervesystemet for over 20 år1. Selv om bruken av BDA er en vanlig nevrale traktat sporing teknikk, kan kvaliteten på BDA merking påvirkes i dyr av ulike faktorer1,2,3. Våre siste studie viste at den optimale strukturen av BDA merking er ikke bare forbundet med riktig etter injeksjon overlevelse tid, men også korrelert med flekker metode4. Inntil nå, konvensjonelle avidin-biotin-peroxidase kompleks (ABC), streptavidin-fluorescein isothiocyanate og streptavidin-AF594 ble flekker metodene brukt for å avsløre BDA merkingen i tidligere studier2,3, 4,5. Sammenligning kan fluorescerende flekker for BDA enkelt utføres.

For å utvide bruken av høy molekylvekt BDA, ble en raffinert protokoll introdusert i studien. Etter injeksjon av BDA i VPM i thalamus med rotte hjernen ble BDA merking avslørt den vanlige metoden for standard ABC flekker og dobbel fluorescerende flekker, som ble gjennomført for å observere korrelasjon av BDA merking og grunnleggende nevrale elementer eller interneurons i kortikale målet med streptavidin-AF594 og fluorescerende Nissl histochemistry eller PV-immunochemistry, henholdsvis. Gjennom de gjensidige nervebaner mellom VPM og den primære somatosensory cortex (S1)6,7,8fokuserer vi vår observasjon på BDA merking i thalamocortical anslått axons og corticothalamic anslått celle somas i S1. Ved denne prosessen forventet vi å gir ikke bare en detaljert protokoll for å få den høye kvaliteten på neural merking med høy molekylvekt BDA, men også en raffinert protokoll på kombinasjonen av fluorescerende BDA merking og andre fluorescerende nevrale markører med Histochemistry eller immunochemistry. Denne tilnærmingen er å foretrekke å studere lokal nevrale kretser og deres kjemiske egenskaper under en AC confocal mikroskopi for laserskanning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne studien ble godkjent av den etiske komiteen ved den Kina kinesisk medisinsk vitenskapsakademi (referansenummer 20160014). Alle prosedyrer ble utført i samsvar med den nasjonale institutter for helse Guide og bruk av forsøksdyr (National Academy Press, Washington, DC, 1996). Fire voksen mannlig rotter (vekt 250-280 g) ble brukt i denne studien. Alle dyrene ble plassert i en 12t lys/mørke syklus med kontrollert temperatur og fuktighet, og gratis tilgang til mat og vann. Instrumentene og materialer som brukes i studien var viste i figur 1.  Før kirurgi, ble alle instrumenter, slik som stereotaxic ramme og glass pipette, renset med 70% etanol.

1. kirurgiske prosedyrer

  1. Bestemme koordinere området av interesse i VPM bruker en stereotaxic atlas9 (figur 2A).
  2. Forberede en 1 µL mikro-sprøyte utstyrt med glass brønnene (med tips diameter ca 10-20 µm) (figur 1 d) og teste det med flytende parafin.
  3. Bedøve rotter med 7% chloral hydrat (0,7 mL/100 g) av intraperitoneal injeksjon.
  4. Når dyp anestesi er bekreftet med hale knip og pedal uttak refleks, barbere toppen av dyrets hodet med en elektrisk barberhøvel og skrubbe kirurgiske området 3 ganger med 10% povidon jod etterfulgt av 70% etanol henholdsvis.
  5. Plasser rotta i stereotaxic enheten ved å plassere sløv øret barer ører og plassere rottas øvre fortenner inn i munnen holderen (figur 1E), og deretter bruke ophthalmica salve på øynene.
  6. Rengjør hodet huden av kirurgiske området igjen med 70% etanol. Bruk sterilt kirurgiske hansker og håndklær for å opprettholde operasjonen under sterile forhold.
  7. Lage et sagittal snitt i huden med en skalpell langs det sagittal suture (figur 1F).
  8. Skrape muskel- og periosteum fra skull bruke steril bomull-tipped påføring gjennom kirurgi for å kontrollere blødning (figur 1F).
  9. Bruke forhåndsdefinerte koordinater fra en atlas (figur 2A), finne hvor (-3.3 mm Bregma punkt, 2.6 mm rett til midtlinjen) craniotomy (figur 1G).
  10. Utføre en craniotomy med en burr drill med litt runde-tip (#106) (figur 1 H), og fortsette boring til om en 1 mm dybde innen få minutter fram meninges (figur 1I).
  11. Avgiftsdirektoratet dura mater bruker microforceps for å avsløre hjernebarken over injeksjonsstedet (figur 1I).
  12. Endre flytende parafin i mikro-sprøyten med 10% BDA (10.000 molekylær vekt i destillert vann) løsning (figur 1J).
  13. Monter sprøyten i microinjection apparatet og koble med mikro-pumpe (figur 1 K).
    Merk: Volumet injisert er avhengig av hastigheten på mikro-pumpen. Her ble det justert til 30 nL/min (figur 1 L).
  14. Under en stereomicroscope, inn glass brønnene manuelt med microinjection apparatet VPM gjennom kortikale overflaten av hjernen på dybden på 5,8 mm (figur 1 M).
  15. Trykk-injisere en 100 nL 10% BDA i VPM over en periode på 3 min (35 nL/min) med en mikro-pumpe (figur 1 L, M).
  16. Etter injeksjon, holde Pipetter i stedet for en ekstra 5 minutter og deretter trekke sakte.
  17. Sutur såret med sterilt tråden (figur 1N). Følg retningslinjene dine lokale dyr pleie-komiteen for pre- og post-kirurgiske analgesi.
  18. Sett rotta i et varmt utvinning før den gjenvinner bevisstheten og er fullstendig gjenopprettet.
  19. Returnere gjenopprettede rotta tilbake til buret sitt.

2. perfusions og inndelinger

  1. Etter en overlevelse tid vanligvis 10 dager, injisere dyret med en overdose av 10% uretan (2 mL/100 g) av intraperitoneal injeksjon å indusere euthanasia.
  2. Perfuse eksperimentell rotter i panseret (figur 1O).
    1. Når pusten stopper, saks og tang, åpne bryst hulrom av rotte til hjertet. En intravenøs kateter inn venstre ventrikkel mot aorta, og åpne deretter høyre auricle.
    2. Første perfuse med 0,9% fosfat-bufret saltvann (PBS) fysiologiske temperatur (37 ° C) ca 1-2 min til blodet ut fra hjertet er fjerner, og fortsett deretter med 250-300 mL 4% paraformaldehyde inne 0.1 M fosfatbuffer (PB, pH 7.4).
  3. Etter perfusjon, incise hodet huden og åpne skallen, og deretter analysere ut rotte hjernen. Etter fikse dissekert hjernen 4% paraformaldehyde for 2 timer ved romtemperatur (26 ° C), deretter cryoprotect i 30% sukrose i 0.1 M PBS (pH 7.4) for 3 dager på 4 ° C til hjernen er nedsenket i løsningen (figur 1 P).
  4. Når hjernen er nedsenket i løsningen, dele hjernen i tre blokker i koronale retning på hjernen matriser (figur 1U). Sentrale blokken inneholder VPM og S1.
  5. Kuttet sentrale blokken av hjernen på 40 µm på en frysing scene glidende mikrotom systemet i koronale retning. Samle avsnittene ryddig i en 6-vel rett med 0.1 M PBS (pH 7.4) (tall 1R, S).

3. standard ABC flekker

Merk: Gratis flytende inndelinger fra hver tredje koronale delen av hjernen ble brukt for å visualisere BDA merkingen med standard ABC prosedyren10.

  1. Skyll avsnittene i 0.1 M PBS i ca 1 min.
  2. Inkuber avsnittene i 1% ABC løsning i 0.1 M PB (pH 7.4) med 0,3% Triton X-100 1t ved romtemperatur.
  3. Vask delene tre ganger i 50 mM Tris buffer (pH 7.4).
  4. Stain delene i en løsning som inneholder 0.02% 3, 3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) og 0,01% H2O2 i 50 mM Tris bufferen for ca 2-5 min ved romtemperatur.
  5. Vask delene tre ganger i 50 mM Tris buffer (pH 7.4).
  6. Montere delene på objektglass ved hjelp av histochemical (figur 1T, se Supplerende Video fil IIIperfusjon og deler).
  7. Tørre delene i luften over natten i romtemperatur.
  8. Tørke delene kort i en serie av alkohol (50%, 70%, 95%, 100%) løsninger. Senk lysbildene i hver løsning for 15 s. Tillat ikke lysbildene for å tørke ut mellom hvert trinn.
  9. Fjern avsnittene i xylen tre ganger, ca 20 min.
  10. Sette 2 eller 3 dråper balsam skiver og plasser coverslips på delene.

4. dobbel fluorescerende flekker for BDA og nevrale hovedelementer i hjernebarken

Merk: derimot dobbel fluorescerende flekker ble gjennomført for å observere korrelasjon av BDA merking og nevrale grunnelementene på tilstøtende deler til ovennevnte brukes med streptavidin-AF594 og counterstained med fluorescerende Nissl flekk AF500/525.

  1. Skyll avsnittene i 0.1 M PBS i ca 1 min.
  2. Inkuber delene i en blandet løsning av streptavidin-AF594 (1:500) og AF500/525 grønne fluorescerende Nissl flekk (1:1, 000) i 0.1 M PBS (pH 7.4) med 0,3% Triton X-100 for 2 timer ved romtemperatur.
  3. Vask avsnittene tre ganger i 0.1 M PB (pH 7.4).
  4. Montere delene på objektglass ved hjelp av histochemical. Tørre delene i luften i ca 1 time.
  5. Coverslips gjelde fluorescerende avsnittene med 50% glyserin i destillert vann før observasjon.

5. dobbel fluorescerende flekker for BDA og Interneurons i hjernebarken

Merk: Dobbelt fluorescerende flekker ble gjennomført for å observere korrelasjon av BDA merking og interneurons på delene representant i kortikale målet med streptavidin-AF594 og PV-immunochemistry.

  1. Skyll avsnittene representant i 0.1 M PBS (pH 7.4) i ca 1 min.
  2. Inkuber avsnittene i en sperring løsning som inneholder 3% normal geit serum og 0,3% Triton X-100 i 0.1 M PBS i 30 min.
  3. Overføre delene i en løsning av musen monoklonale anti-PV IgG (1:1, 000) i 0.1 M PBS (pH 7.4) som inneholder 1% normal geit serum og 0,3% Triton X-100 for overnatting på 4 ° C.
  4. Vask avsnittene tre ganger i 0.1 M PBS (pH 7.4) på dagen.
  5. Utsette delene blandede løsninger av geit mouse-AF488 sekundære antistoff (1:500), streptavidin-AF594 (1:500), og 4', 6-diamidino-2-phenylindole-dihydrochloride (DAPI, 1:40, 000) i 0.1 M PBS (pH 7.4) som inneholder 1% normal geit serum og 0,3% Triton X-100 1t.
  6. Gjenta 4.3 til 4,5.

6. observasjon

  1. Ta bilder av VPM, thalamocortical axons og corticothalamic neurons.
    1. Observere fluorescerende prøvene med en AC confocal tenkelig system utstyrt med mål linser (4 x, NA: 0,13, 10 x, NA: 0.40; og 40 x, NA: 0,95). Bruk eksitasjon og utslipp bølgelengder av 405 (blå), 488 (grønn) og 559 (rød) nm.
      Merk: Her AC confocal hullet er 152 µm (4 x, 10 x) og 105 µm (40 x). Den romlig oppløsningen på image fange er 1024 × 1024 piksler (4 x, 10 x) og 640 × 640 pikslers (40 x).
    2. Ta 20 bilder i påfølgende rammer på 2 µm fra hver del på tykkelsen av 40 µm (Z-serien).
    3. Integrere bilder i en enkelt i fokus bilde med AC confocal bildebehandlingen programvaresystem for tredimensjonale analyse som følger: Angi start fokalplanet → sett slutten fokalplanet → sett trinn størrelse → Velg dybden mønster → bildet fange → Z serien.
  2. Ta brightfield bilder av lys mikroskop utstyrt med et digitalt kamera (4 x, NA: 0,13, 10 x, NA: 0.40; og 40 x, NA: 0,95 linser). Bruk en eksponeringstid på 500 ms. bruk et bilderedigeringsprogram til å justere lysstyrken og kontrasten bilder og legge til etiketter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overlevelse av 10 dager innlegget injeksjon av BDA i VPM var tilstrekkelig for å produsere intens nevrale merking på tilsvarende kortikale områder ipsilateral til injeksjon siden (figur 2). Både konvensjonell ABC og fluorescerende flekker prosedyrer for BDA avslørt lignende mønster av nevrale merking på S1, inkludert anterogradely merket thalamocortical axons og retrogradely corticothalamic neurons (figur 2C, D ).

Anterogradely merket axons, de var observert fra lag 2 laget 6 med høyere tetthet på lag 4 og typisk typen thalamocortical axons ble observert i området fat (figur 2C, D). I visningen høyere forstørrelse presentert BDA merking klart på axonal bagasjerommet, greiner, materiell og små varicosities (figur 3A). Under merket thalamocortical axons vises, de retrogradely merket kortikale pyramidale nevroner ble vist og sine cellen legemer fordelt på lag 5/6, men deres apikale dendrites utvidet til lag 2 (figur 2C, D). BDA merkingen ikke bare presentert i neuronal cellen legemer og dendrites, men også i dendrittiske spines, vises som Golgi-lignende oppløsning (figur 3B).

I tillegg ble dobbel fluorescerende flekker også utført for å observere korrelasjon av BDA merking og interneurons i kortikale målet med streptavidin-AF594 og PV-immunochemistry. Rundt BDA merking i kortikale målet, ble PV-positive neurons distribuert fra lag 2 laget 6 med høy konsentrasjon i laget 4 (figur 4A). Det var ingen PV-positive neurons å merkes med BDA, men BDA-merket axonal terminaler ble funnet rundt overflaten av PV-positive cellen legemer og PV-positive axonal terminaler rundt BDA-merket kortikale pyramidale nevroner (figur 4B, C ).

Figure 1
Figur 1. Bilder av kirurgisk hovedtrinnene og instrumentene som skal brukes i dette eksperimentet.
A: stereotaxic enheten. B: tannlege bore. C: kirurgiske redskaper (skalpell, microforceps og etc.) D: Micro-sprøyte utstyrt med glass brønnene. E: plassere rotte hodet i stereotaxic enheten. F: Rengjør kirurgiske området. G: bekrefte Bregma punktet. H: bore skallen. Jeg: utsette hjernebarken. J: laste inn 10% BDA i mikro-sprøyten. K: Monter sprøyten til apparatet for mikro-injeksjon. L: justere hastigheten på mikro-pumpen. M: glass brønnene inn VPM. N: Sutur såret med sterilt tråden. O: Perfuse rotta inne panseret. P: dissekere ut hjernen. Q: dele hjernen i tre blokker med hjernen-matriser. R: kutte hjernen på en frysing scene glidende mikrotom systemet. S: samle hjernen inndelinger ryddig i en 6-vel rett. T: montere delene på objektglass. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Injeksjonsstedet og typisk nevrale merking med høy molekylvekt BDA i somatosensory cortex.
A: injeksjonsstedet var fast bestemt på en stereotaxic atlas. B: Representative photomicrograph viser injeksjonsstedet av BDA (rød) i ventrale posteromedial kjernen av thalamus (VPM) på bakgrunn av grønne Nissl flekker. C: Photomicrograph av fluorescerende BDA merking, inkludert thalamocortical axons i laget 4 og corticothalamic nerveceller i lag 5/6. D: Photomicrograph av konvensjonelle BDA merking med en standard avidin-biotin-peroxidase prosedyre viser lignende mønster av nevrale merking til fluorescerende BDA merking. VPL, ventral posterolateral kjernen i thalamus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Høy kvalitet av nevrale merking med høy molekylvekt BDA på bakgrunn av grønne Nissl flekker.
A: høyere forstørrelse visningen av anterogradely merket axonal arbors (rød) i detalj. B: høyoppløselige bilder viser retrogradely merket neuronal celle kroppen, dendrites, og dendrittiske spines (rød) i detalj. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Korrelasjon av BDA merking og kalsium-bindende protein PV-positive interneurons i kortikale målet.
A: distribusjon av BDA merking (rød) og PV-positive interneurons (grønn) i somatosensory cortex. B: høyere forstørrelse visningen av fordelingen av BDA-merket axons og PV-positive interneurons på lag 4. C: Høyoppløselig bilde av BDA-merket kortikale pyramidale celle (rød) og PV-positive interneurons (grønn) i lag 5/6. Alle prøvene var counterstained med DAPI (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video tilleggsfiler: Supplerende videoene viser kort den kirurgiske prosedyren, injeksjon av BDA i VPM, perfusjon og skjæring og resultater. I videofilen kalt "IV. Representant resultat", tredimensjonale AC confocal laser skanning mikroskopi og analyse system resultatene vises. Høy oppløsning animasjonen viser retrogradely merket neuronal celle kroppen, dendrites, og dendrittiske spines (rød) i detalj. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Velge en riktig tracer er et kritisk punkt for en vellykket nevrale sporing eksperiment. I familien av BDA, høy molekylvekt BDA (10.000 molekylvekt) ble anbefalt transporteres fortrinnsvis gjennom anterograd nevrale sti i motsetning til lav molekylvekt BDA (3000 molekylvekt)2,3 , 11 , 12 , 13. imidlertid mange studier også antydet at høy molekylvekt BDA kan også være potensielt brukt for retrograd veien sporing parallelt med anterograd sporing1,2,3. Gjennom de gjensidige nervebaner mellom VPM og S1 gitt vi ytterligere bevis for å støtte ideen om at høye molekylær vekt BDA er egnet for toveis tarmkanalen sporing4. På samme måte i dette domenet, høy molekylvekt BDA ble også brukt i visuelle og auditive systemet for å undersøke de gjensidige forbindelsene mellom dorsal lateral geniculate kroppen og hjernebarken som mediale geniculate kroppen og auditiv cortex 3 , 14.

I nevrale sporing forsøket er det andre viktig hensynet valg av flekker metode for neural merkingen. I de fleste av de tidligere studiene, både konvensjonell ABC protokollen og fluorescerende streptavidin flekker metoden er brukt for å undersøke BDA merking og avslørte lignende morfologiske mønster1,2,3 , 4 , 5. her, fant vi at streptavidin-AF594 ikke var bare et riktig valg for BDA merking, men også egnet for å kombinere med andre nevrale markør, som fluorescerende Nissl og PV-antigen, gir en ny mulighet for å observere korrelasjon av BDA merking og andre nevrale elementer. Selv om konvensjonell dobbel flekker metoden for BDA og andre nevrale markører ble også ofte utført med to farger DAB prosedyre14,15, det er ikke med en tre-dimensjonal analyse systemet under en AC confocal laser skanning mikroskopi. Fra et teknisk synspunkt gir vår nåværende studien en verdifull referanse tydelig sammenligne mellom BDA merking og andre merking.

Nevrale tarmkanalen sporing teknikken ble opprinnelig brukt for å avsløre nevrale forbindelser mellom injeksjonsstedet og målet i nervesystemet; men var forskere fortsatt på jakt etter den ideelle strukturen av nevrale merking med en skikkelig tracer16,17. I motsetning til andre tracers, som pepperrotperoksidase og delenhet B av kolera toxin, produserer høy molekylvekt BDA høyere kvaliteten på neural merkingsteknikker for kvantifisere axonal arbors og neuronal dendrites16,17 . Selv om kvantitativ analyse av BDA merking ikke er utført studien, gir høyere kvalitet av nevrale merking med BDA flere muligheter til å forstå tett morfologiske kjennetegn på merket axonal arbors og neuronal dendrites.

Ligner anvendelsen av mange andre tracers, en rekke viktige saker skal anses for denne eksperimentelle prosedyren, inkludert: konsentrasjonen og volumet av BDA brukes for injeksjon, riktig område av injeksjon, tips diameteren på glasset pipette, kirurgisk prosess, optimal overlevelse tid, perfusjon, delen og observasjon under et mikroskop. Det er direkte knyttet til kvaliteten på BDA merking hva vi ventet. I tillegg til kritiske trinnene nevnt ovenfor, er det tekniske begrensninger som krever oppmerksomhet, for eksempel avstanden fra injisert området til merket målet, som er avhengig av modell dyrearter brukes i eksperiment3, 5 , 18. i et ord, en vellykket sporing studie avhenger av hvert trinn i hele eksperimentelle prosedyren.

Studien, har vi gitt en raffinert protokoll for å vise at den fluorescerende BDA flekker metoden er en effektiv måte for å få den høye kvaliteten på neural merking, som samtidig sammen med andre nevrale indikatorer ved hjelp av fluorescerende histochemistry eller immunochemistry. Sammenligne den konvensjonelle BDA flekker med DAB prosedyre, kan vi lettere analysere fine strukturen av BDA merking og skille den fra andre nevrale elementer i sporing målet under en AC confocal laserskanning mikroskopi av den nåværende lysstoffrør tilnærming.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble finansiert av National Natural Science Foundation of China (Project kode nr. 81373557, nr. 81403327).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biotinylated dextran amine (BDA) Molecular Probes D1956 10,000 molecular weight
Streptavidin-Alexa Fluor 594 Molecular Probes S32356 Protect from light
500/525 green fluorescent Nissl stain Molecular Probes N21480 Protect from light
Brain stereotaxis instrument Narishige SR-50
Freezing microtome Thermo Microm International GmbH
Confocal imaging Olympus FV1200
system
Micro Drill Saeyang Microtech Marathon-N7
Sprague Dawley Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC Kit Vector Laboratories PK-4000
superfrost plus microscope slides Thermo #4951PLUS-001 25x75x1mm
Photoshop and Illustration Adobe CS5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies. J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).
  2. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).
  3. Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling. PLoS One. 7, e45886 (2012).
  4. Zhang, W. J., et al. Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways. Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).
  5. Han, X., et al. Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract. Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).
  6. Armstrong-James, M., Callahan, C. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical "barrel" neurones. J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).
  7. Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex. J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).
  8. Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O'Dowd, D. K. Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex. J Neurosci. 15, 549-561 (1995).
  9. Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , Academic Press. San Diego. (1998).
  10. Davidoff, M., Schulze, W. Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining. Histochemistry. 93, 531-536 (1990).
  11. Fritzsch, B. Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines. J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).
  12. Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR. J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).
  13. Medina, L., Reiner, A. The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine. Neuroscience. 81, 773-802 (1997).
  14. DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit. J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).
  15. Ojima, H., Takayanagi, M. Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity. J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).
  16. Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).
  17. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).
  18. Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys. J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).

Tags

Nevrovitenskap problemet 134 Biotinylated dekstran Amin tracer neural merking axon Nevron somatosensory cortex
Forbedre anvendelsen av høy molekylvekt Biotinylated dekstran Amin for Thalamocortical projeksjon sporing i rotte
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, D., Cui, J., Wang, J., Zhang,… More

Xu, D., Cui, J., Wang, J., Zhang, Z., She, C., Bai, W. Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat. J. Vis. Exp. (134), e55938, doi:10.3791/55938 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter