Summary
Polymères semi-flexibles affichent des propriétés mécaniques uniques qui sont largement appliquées par les systèmes vivants. Toutefois, des études systématiques sur les biopolymères sont limitées puisque les propriétés telles que la rigidité de polymère sont inaccessibles. Ce manuscrit décrit comment cette limitation est contournée par programmable ADN nanotubes, permettant des études expérimentales sur l’impact de la rigidité du filament.
Abstract
Les propriétés mécaniques de la matière molle complexe, à base de polymères, tels que les cellules ou les réseaux de biopolymère, peuvent être comprises dans ni le cadre classique des polymères flexibles, ni de tiges rigides. Filaments sous-jacente restent tendus en raison de leur rigidité de la colonne vertébrale non-en voie de disparition, qui est quantifiée par la longueur de persistance (l,p), mais ils sont également soumis à fortes fluctuations thermiques. Leur rigidité en flexion finie mène à mécanique collective unique, non trivial de réseaux en vrac, ce qui permet la formation d’échafaudages stables à des fractions de faible volume, tout en offrant des tailles de mailles larges. Ce principe est répandu dans la nature (p. ex., dans les cellules ou les tissus), pour réduire le contenu moléculaire élevé et ce qui facilite diffusive ou transport actif. En raison de leurs implications biologiques et des applications technologiques potentielles dans les hydrogels biocompatibles, semi-flexibles polymères ont fait l’objet de nombreuses études. Cependant, enquêtes compréhensibles est resté difficiles puisqu’ils s’appuyaient sur des polymères naturels, tels que les filaments d’actine, qui ne sont pas librement réglables. Malgré ces limites et en raison du manque de polymères synthétiques et mécaniquement accordables semi-flexibles, filaments d’actine ont été établis sous le régime de modèle commun. Une limitation majeure est que la quantité central lp ne peut pas être librement à l’écoute afin d’étudier son impact sur les structures macroscopiques en vrac. Cette limitation a été résolue en employant des nanotubes ADN structurellement programmables, permettant la modification contrôlée de la raideur du filament. Elles sont constituées par des conceptions basées sur les carreaux, où un ensemble discret de brins partiellement complémentaires s’hybrident dans une structure d’anneau avec une circonférence de discrète. Ces anneaux disposent les extrémités cohésives, permettant la polymérisation efficace en filaments de quelques microns de longueur et affiche similaires cinétique de polymérisation sous forme de biopolymères naturels. En raison de leur mécanique programmable, ces tubes sont polyvalents, de nouveaux outils pour étudier l’impact de lp sur la molécule unique ainsi que l’échelle en vrac. Contrairement aux filaments d’actine, ils restent stables au cours des semaines, sans dégénérescence notable, et leur manipulation est relativement simple.
Introduction
En raison des comportements complexes activés par leurs propriétés mécaniques uniques, polymères semi-flexibles sont les blocs constitutifs de la matière vivante. À la différence des polymères flexibles, semi-flexibles polymères adoptent une configuration tendue en raison de leur rigidité d’épine dorsale non-en voie de disparition, tout en restant soumis à fortes fluctuations thermiques1. Ainsi, des modèles stochastiques purement impossible d’appliquer à leurs comportements, comme avec les extrêmes de polymères entièrement flexibles ou rigides. Le modèle de ce que l'on appelle ver-comme chaîne2,3,4 a été développé afin de quantifier cette rigidité via la lp, qui est la constante de désintégration de la corrélation de tangente tangente le long du filament4. Si lp est comparable à la longueur du contour (lc) du filament, le polymère est considérée comme semi-flexibles1. Analogue aux pôles d’une tente, leurs arrangements en réseaux ou bottes stabilise l’ensemble du système collectif à des fractions de faible volume, conduisant à une inhabituelle viscoélastique propriétés5,6,7, 8,9. Ces structures fournissent au grand haute élasticité mesh tailles10, maintien de l’intégrité mécanique tout en facilitant la diffusion et les processus de transport actif. Cette propriété est particulièrement adaptée aux systèmes biologiques comme le cytosquelette ou de la matrice extracellulaire, mais il est également employé couramment en nourriture génie1,11,12.
Au-delà de leur signification avec la matière vivante, il est crucial d’examiner globalement les propriétés physiques de ces structures afin d’avoir les outils pour développer des matériaux biomimétiques ou roman hydrogels. En ce qui concerne les polymères semi-flexibles, ceci implique la détermination systématique des propriétés collectives des réseaux résultant des propriétés de single-filament comme lp et l’élaboration d’un cadre théorique descriptive. Pionnier dans l’étude, l’actine cellulaire biopolymère a été établi comme un système modèle pour polymères semi-flexibles et est toujours considéré comme l’étalon-or5,13,14,15 , 16 , 17. Cependant, les études exhaustives sont limités avec ce système car ils sont liés aux propriétés intrinsèques de cette protéine. Différentes approches théoriques ont visant à donner une description des comportements mécaniques non négligeables au niveau de single-filament et ont entraîné notamment mise à l’échelle des prévisions différentes pour la dépendance de la module de cisaillement de plateau élastique linéaire, G 0 (c'est-à-dire, le « élasticité » du réseau), en ce qui concerne la concentration (c) et lp6,7,13,14, 15,18,19,20,21,22,23. Alors que l’échelle de concentration est facilement accessible dans les expériences avec axée sur l’actine ou autres systèmes modèles et que les prédictions théoriques ont été rigoureusement vérifiés13,16,24, 25, la mise à l’échelle en ce qui concerne lp est resté expérimentalement inaccessible. Ceci, cependant, est une limitation majeure puisque lp est également une variable indépendante qui est la quantité déterminante de polymères semi-flexibles.
Cette limitation centrale, naturelle, imposée par le fixe lp de l’actine ou autres polymères d’origine biologique comme le collagène a récemment été résolue en employant basé sur l’ADN tubes qui sont accordables dans leurs propriétés mécaniques 9 , 26 , 27 , 28. légères variations dans les architectures des tubes (par exemple, un nombre différent de l’ADN constituant chapelets dans l’anneau d’unité) donnent des valeurs distinctes pour lp, qui peut être évaluée par l’intermédiaire de la microscopie de fluorescence, en analysant un tube fluctuant ou en évaluant les configurations de courbes de plusieurs tubes collés, comme décrit précédemment9,28. Ces analyses ont révélé que lp valeurs des populations différentes tube varient au cours de plus d’un ordre de grandeur, et que les techniques d’évaluation différentes donnent des résultats cohérents9,28.
Étonnamment, la mise à l’échelle globale du cisaillement module Gplateau élastiques linéaire0 en ce qui concerne la concentration et lp a été signalée est incompatible avec toutes les précédentes approches théoriques 9, montrant en particulier une bien plus forte que prévue tributaire de lp. Ces résultats mettent l’accent sur la valeur d’un nouveau système modèle pour étudier les propriétés centrales de polymères semi-flexibles. Employant des n-tubes à hélices ADN élargit considérablement la portée de ces enquêtes. Non seulement lp librement réglable sans changer le matériel de base, mais la nature inhérente programmable d’ADN peut permettre l’examen systématique des éléments supplémentaires, tels que les croisements ou processus de commutation cinétiques. En outre, ces tubes sont solubles dans l’eau et, contrairement à la plupart des protéines, stable au pH adéquat et des conditions ioniques pendant plusieurs semaines, sans dégradation détectable9.
Pour assembler ces tubes, sert un ensemble discret d’oligonucléotides d’ADN, dont chacune contient deux domaines qui partagent des séquences de base complémentaires à deux brins voisins (due à des séquences spécifiques, un seul brin ne peuvent pas constituer des structures telles que les épingles à cheveux). Les séquences complémentaires s’hybrident de façon cyclique, formant des anneaux fermés, moitié-chevauchement de segments double hélice n interconnectés (Figure 1 a et B). Ces forment des anneaux à un diamètre discrète (Figure 1) et leur configuration se chevauchent moitié expose les extrémités cohésives axiales complémentaires aux extrémités collantes d’une autre bague. Cet ajout sélectif des correspondants des oligonucléotides déclenche un empilement des anneaux, conduisant à la polymérisation efficace des tubes à hélices ADN filamenteux de taille n (nHT). Leurs longueurs contours mesurent généralement de quelques microns de longueur, et la distribution de leur longueur est comparable à celle des filaments d’actine9,26,27,28. Il a été démontré pour les nanotubes d’ADN similaires qu’ils présentent en effet cinétique de polymérisation semblable à celles des microtubules et des filaments d’actine
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Protocol
1. préparation des n HTs
Remarque : ici, n désigne le nombre de brins d’ADN unique différents impliqués dans la formation des tubes hélice d’une certaine taille. Pour n = 8, huit différents simples brins d’ADN forment un anneau unité.
- Des séquences d’ADN de l’achat (qualité HPLC pureté ou supérieur) d’une synthèse de l’ADN appropriée de service ou d’effectuer la synthèse de haute qualité et de la purification (exemplaires séquences indiquées au tableau 1).
- Remettre lyophilisé oligonucléotides dans l’eau purifiée et suivre la remise en suspension supplémentaire étapes figurant dans le manuel correspondant de la société. Ajuster la quantité d’eau pour obtenir une concentration finale de 200 µM.
- Déterminer les concentrations de l’ADN simple brins pour vérifier les valeurs indiquées par le distributeur (par exemple, via la spectroscopie UV-visible à 260 nm) puisque la stoechiométrie exacte est cruciale pour le processus d’assemblage. Calculer la concentration des oligonucléotides, en tenant compte du poids spécifique molaire et le coefficient d’extinction pour chaque oligonucléotides d’ADN monocaténaire.
Remarque : Les valeurs de coefficient d’extinction intrinsèquement varient pour les différentes séquences et sont précisées dans la documentation de l’ADN acheté dans le commerce. Il peuvent aussi être calculées selon le modèle du plus proche voisin à l’aide d’un certain nombre d’outils en ligne disponibles gratuitement. Pour se conformer à la gamme linéaire du spectromètre, envisager de diluer l’échantillon utilisé pour la détermination de la concentration. - à l’aide d’une micropipette, mélanger l’ADN chaque brins à la même concentration-dans un récipient qui convient pour le thermocycleur (p. ex., un tube de PCR de 200 µL) former la désirée n HTs (conditions de tampon final : 1xTE (10 mM Tris et 1 mM EDTA, pH 8) et 12,5 mM MgCl 2).
Remarque : Des échantillons ADN Final n HT consistent en n - 1 brins, U 1 − U n − 1 et un brin de n T. La concentration / chapelet peut varier de sub-micromolaires à plus de 10 µM, selon les besoins de l’utilisateur (p. ex., < 1 µm par fil à la dilution subséquente d’observer des filaments simples ou des concentrations plus élevées pour l’examen des mécanique de réseau dense). - Hybrider le n HTs dans un thermocycleur (dénaturation pendant 10 min à 90 ° C, avec une baisse rapide subséquente à 65 ° C ; température lente diminution de 65 ° C à 55 ° C, avec une synchronisation base complémentaire en 20 étapes de température de K-0,50 pendant 30 min chaque ; (et une baisse rapide de 55 ° C à 20 ° C) ; Voir la Figure 2 a.
Remarque : Les étapes de la lente diminution de 65 ° C peuvent être rallongés pour augmenter la longueur du tube moyen ; Toutefois, la baisse rapide subséquente à 20 ° C est cruciale pour éviter l’agrégation des tubes polymérisés. - Stocker l' hybride n HTs jusqu'à 3 semaines à 4 ° C sans dégradation détectable.
NOTE : Pour la fluorescence microscopy, étiqueté n HTs sont hybridés en substituant (en partie) U1 avec la mis à jour le U1-Cy3 (tableau 1). Pour plus longues périodes d’observation, l’ajout d’agents anti-blanchiment établis est conseillé. - Diluer soigneusement l’échantillon à la concentration finale souhaitée (par exemple, 4 µM pour les réseaux ou 20 nM pour les observations de single-filament) à l’aide de la solution tampon, si nécessaire. Pour minimiser les sources d’erreur possibles, assembler des échantillons à la concentration finale souhaitée.
2. Rhéologie de cisaillement
- choisir une bonne géométrie (plaque plaque ou plaque de cône) pour le rhéomètre à cisaillement dynamique. Pour les petits volumes (c'est-à-dire au-dessous de 200 µL), utiliser la géométrie de cône-plaque.
- Charger l’échantillon sur le rhéomètre à cisaillement dynamique.
- Passiver l’interface air-eau de l’échantillon et l’environnement en utilisant les étapes suivantes afin d’éviter les effets potentiels d’évaporation.
- Entourent l’échantillon avec 2,5 mL de la baignoire de tampon échantillon.
- Ajouter un surfactant juste en dessous de la concentration micellaire.
- Utiliser une seringue de Hamilton à entourer l’échantillon avec un lipide d’éviter le contact direct de l’échantillon avec de l’air.
- Sceller la chambre de l’échantillon avec un plafond avec des éponges humides et, si possible, avec un bain d’eau supplémentaire (pas au contact de l’échantillon) pour mieux réprimer évaporation.
- Démarrer la mesure en utilisant le logiciel spécifique rhéomètre à température ambiante, vous pouvez également effectuer la mesure à des températures différentes, tels que les 37 ° C (si conditions physiologiques sont nécessaires).
Remarque : L’échantillon de refroidissement est souvent accompagnée par la condensation de vapeur d’eau de l’air ambiant, tandis que chauffage conduit à une évaporation accrue. Les deux effets peuvent changer incontrôlable de la concentration de l’échantillon, donc toutes les mesures dans une série doivent être effectuées à une température constante. - Laisser l’échantillon s’équilibrer pendant 2 h à température ambiante. L’évolution temporelle peut être surveillée avec un balayage de temps (un données point par minute ; déformation γ = 5 % ; fréquence f = 1 Hz).
- Mesure les propriétés mécaniques avec les protocoles de test désiré. Partir d’une série de fréquences balayages (f-balaie) parce qu’elles quittent l’échantillon intact et permettent des mesures plus.
NOTE : En outre, court f-balayages devraient être effectuées avant et après les mesures plus (comme long f-balaie avec une résolution beaucoup plus élevée) pour vérifier que l’échantillon ne varia pas dans tout le protocole de mesure complet.- Effectuer un court f-balayage (p. ex., γ = 5 % ; f = 0,01 Hz à 30 Hz ; points de 5 données par décennie).
- Effectuer un long f-balayage (p. ex., γ = 5 % ; f = 0,001 Hz à 30 Hz ; 21 points de données par décennie) ; le régime de basse fréquence peut être omis si pas nécessaire de réduire les temps de mesure.
- Effectuer un court f-balayage.
- Effectuer un balayage de γ (p. ex., f = 1 Hz ; γ = 0,0125 % à 100 % ; points de 20 données par décennie).
Remarque : Utilisez le court f - balayer tout d’abord, comme c’est généralement incompatible avec le précédent f - balaie parce que les réseaux habituellement se rompent au cours de la γ-coupe-bise ou détachent les plaques. Vous pouvez également utiliser γ-rampe (par exemple, = 0.025 s -1, t = 60 s) ; Toutefois, les rampes habituellement oblige à modifier le mode moteur, court donc ultérieurs f-balayages serait être falsifiées.
- Bin et/ou lisse les données brutes avec un noyau gaussien.
3. assistée par fluorescence analyse d’ADN recuit
- 8 préparer des aliquotes de 12 µL de chaque échantillon à l’aide de 1 à 4 µM ADN par brin, 12,5 mM MgCl 2 en 1 x tampon TE et 1 x gel d’acide nucléique taches provenant d’un DMSO 10 000 x stock. Faire un contrôle négatif avec aucun ADN, mais incluent des acides nucléiques gel teinté.
- Transférer les aliquotes dans une plaque PCR en temps réel et sceller avec un film adhésif (par exemple, une plaque de 96 puits réaction).
Remarque : Les hautes températures utilisées dans le thermique recuit protocoles seront évaporera échantillons. Par conséquent, assurez-vous que les puits sont bien scellées avec un film adhésif pour empêcher l’augmentation d’évaporation et la concentration de l’eau, en particulier au cours d’expériences à long terme. - Centrifuger la plaque à 100 x g pendant 1 min à température ambiante pour enlever les bulles de gaz ; si les bulles de gaz élargir, les puits ne peuvent pas être analysés.
- Charger la plaque scellée dans un système PCR quantitatif en temps réel.
- Exécuter un programme de recuit. Dénaturer l’ADN à 90 ° C pendant 10 min. baisse la température rapidement à 72 ° C. Ensuite, diminuer la température lentement de 0,5 ° C toutes les 30 minutes. Après que le signal a décru, accélérer la rampe de température.
Remarque : 72 ° C est suffisamment au-dessus de la température réelle de l’hybridation ; ainsi, le signal est enregistré sur une plage de température large pour déterminer l’intervalle de température nécessaire. - S’assurer que le couvercle de la cycler chauffe au moins 100 ° C pour éviter la condensation d’échantillon évaporé sur la pellicule adhésive.
- Au cours de l’Assemblée, excite les échantillons avec un laser argon-ion à 488 nm et détecter la fluorescence à 550 nm lors de l’utilisation d’une tache de gel d’acide nucléique (ou spectralement similaire). Pour les autres colorants, choisir une combinaison appropriée d’excitation/émission. Mesurer le signal de fluorescence aussi souvent que possible afin d’accroître l’ensemble la qualité du signal à l’aide de l’appareil photo intégré.
NOTE : Ici, on a mesuré chaque 9 s. - Si fusion prédéfinis et recuit de programmes sont appliqués, utilisez le logiciel fourni pour analyser les données. Si non, soustraire la valeur moyenne antérieure de la valeur moyenne pour chaque étape de la température obtenir la variation relative du signal fluorescent.
4. AFM Imaging
- Cleave mica (p. ex., mica " V1 ") en joignant un ruban adhésif disponible dans le commerce et arrachant ; la couche superficielle du mica doit être retirée.
- À l’aide d’une micropipette, déposer pré-formé n HT en Mg 2 + contenant un tampon pliant sur le mica fraîchement clivé et laissez-le se contenter de 10 min.
- Tourner les échantillons à intervalles courts 3 s à 2 000 x g sur une centrifugeuse de petite table pour enlever le liquide restant. Plusieurs n HTs doit toujours être attaché à la surface de mica.
- Utiliser un embout de cantilever avec une rigidité élevée (p. ex., 54 Nm -1) et de déterminer sa fréquence de résonance avec le logiciel interne de l’AFM.
- Enregistrement du profil de hauteur avec l’AFM dans l’air en tapant mode à balayage faible taux (par exemple, 1 ligne/s) pour éviter d’endommager ou de déplacer la n HTS.
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Representative Results
L’Assemblée des nanotubes d’ADN via une rampe de température (Figure 2) est une méthode très fiable pour former ces polymères artificiels semi-flexibles. Ces polymères ont des caractéristiques comparables à leurs homologues naturels, tels que les filaments d’actine, mais fournissent un cadre expérimental beaucoup plus large, puisque leurs propriétés mécaniques peuvent être contrôlable modifié9,27 . Comme les biopolymères, ils peuvent être organisés en réseaux (Figure 3) et spécifiquement permettent de tester l’impact de la raideur de filaments sur des structures en vrac et les propriétés. Comme illustré à la Figure 4, ces réseaux d’affichage à un régime de déformation linéaire pour les souches jusqu'à 10 %, ce qui rapproche les caractéristiques des réseaux de filaments d’actine. Au sein de ce régime, rhéologie de cisaillement linéaire peut être facilement appliqué, par exemple, pour déterminer la réponse élastique et visqueuse des réseaux de nanotube ADN sondé à différentes fréquences,9. Ces tests ne révèlent que ces réseaux principalement se comportent élastiquement (Figure 5). Contrairement aux mesures avec les protéines, ces tubes ne pas dénaturer à l’interface air-eau de l’échantillon et sophistiquée donc, passivation des stratégies sont nécessaires (Figure 6). Par conséquent, la manipulation des échantillons est assez simple et s’est avéré pour être très robuste, ce qui donne des résultats cohérents avec faible échantillon de variations.
Toutefois, la question de savoir si les extrémités libres « collant » des non-appariés simple brin ADN aux deux extrémités de chaque tube peut induire des indésirable, stochastique hybridation événements est restés. Pour apaiser cette inquiétude, séquences complémentaires « end cap » couvrant les extrémités du tube ont été ajoutés à l’échantillon après que le processus d’hybridation était complet. Cependant, la Figure 7 illustre que les extrémités des filaments de forme n’a aucune influence détectable et que les extrémités des tuyaux ne pas provoquent d’effet transitoire de réticulation dans le réseau9. Collage des événements seulement jouent un rôle important lorsque l’échantillon est géré trop grossièrement et les tubes Rodez en raison de pipetage sévère. En effet, ces points de rupture semblent induire des effets de réticulation, conduisant à des réponses non linéaire du système, comme la souche des raidisseurs (Figure 8).
Si les échantillons sont préparés avec soin, ils peuvent servir à tester l’impact ayant soit la concentration de filament (Figure 9 a), soit le filament raideur (Figure 9 b)9 sur les propriétés mécaniques des réseaux constitués de semi-flexibles polymères. Pour la première fois, le lien quantitatif entre la rigidité du filament et l’élasticité de réseau a été étudié expérimentalement et systématiquement, ce qui donne un comportement de loi de puissance linéaire, qui est en contradiction avec les prédictions théoriques prédominantes. Ces résultats illustrent que les nanotubes d’ADN sont un nouvel outil polyvalent pour étudier les effets des polymères semi-flexibles, qui étaient autrefois expérimentalement inaccessible9,27. Maintenant, diverses théories peuvent être expérimentalement testés, mettant en cause des déclarations sur les dépendances sur la longueur de persistance lp des filaments. En outre, des effets très fondamentaux, tels que la reptation (Figure 10), peuvent être étudiées sous différents angles en utilisant des tubes qui varient de rigidité.
| Nom | Séquence | ||
| U1 : a1 *-* b1-a2-b2 | GGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U1-Cy3 : a1 *-* b1-a2-b2 | Cy3-TTGGCGATTAGG-ACGCTAAGCCA-CCTTTAGATCC-TGTATCTGGT | ||
| U2 : a2 *-* b2-a3-b3 | GGATCTAAAGG-ACCAGATACA-CCACTCTTCC-TGACATCTTGT | ||
| U3 : a3 *-b3 *-a4-b4 | GGAAGAGTGG-ACAAGATGTCA-CCGTGAGAACC-TGCAATGCGT | ||
| U4 : a4 *-b4 *-a5-b5 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCGCACGACC-TGTTCGACAGT | ||
| U5 : a5 *-b5 *-a6-b6 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCAACGATGCC-TGATAGAAGT | ||
| U6 : a6 *-b6 *-a7-b7 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-ATGCACCTCC-AGCTTTGAATG | ||
| U7 : a7 *-b7 *-a8-b8 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-AACGGTAACTA-TGACTTGGGA | ||
| U8 : a8 *-b8 *-a9-b9 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-AACACTAGAC-ACATGCTCCTA | ||
| U9 : a9 *-b9 *-a10-b10 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CGAGACTACAC-CCTTGCCACC | ||
| U10 : a10 *-b10 *-a11-b11 | TGTAGTCTCGG-GTGGCAAGGG-TACTACCGCT-CCATTAAGAAT | ||
| U11 : a11 *-b11 *-a12-b12 | AGCGGTAGTA-ATTCTTAATGG-ATCCGTCTATC-TACACTATCA | ||
| U12 : a12 *-b12 *-a13-b13 | ATAGACGGATT-GATAGTGTAG-AGACGAAATC-AGCAGAACTAA | ||
| U13 : a13 *-b13 *-a14-b14 | GATTTCGTCT-TTAGTTCTGCT-CTGCGAAGTAA-TCAGCCGAGC | ||
| T4 : a4 *-b4 *-a1-b1 | GGTTCTCACGG-ACGCATTGCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T5 : a5 *-b5 *-a1-b1 | GGTCGTGCGG-ACTGTCGAACA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T6 : a6 *-b6 *-a1-b1 | GGCATCGTTGG-ACTTCTATCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T7 : a7 *-b7 *-a1-b1 | GGAGGTGCAT-CATTCAAAGCT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T8 : a8 *-b8 *-a1-b1 | TAGTTACCGTT-TCCCAAGTCA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T9 : a8 *-b8 *-a1-b1 | GTCTAGTGTT-TAGGAGCATGT-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T10 : a10 *-b10 *-a1-b1 | GTGTAGTCTCG-GGTGGCAAGG-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| T14 : a14 *-b14 *-a1-b1 | TTACTTCGCAG-GCTCGGCTGA-CCTAATCGCC-TGGCTTAGCGT | ||
| capuchon d’extrémité A1 | CCTAATCGCC | ||
| capuchon d’extrémité A2 | CCTTTAGATCC | ||
| capuchon d’extrémité A3 | CCACTCTTCC | ||
| capuchon de protection A4 | CCGTGAGAACC | ||
| capuchon d’extrémité A5 | CCGCACGACC | ||
| capuchon d’extrémité A6 | CCAACGATGCC | ||
| capuchon d’extrémité A7 | ATGCACCTCC | ||
| capuchon d’extrémité A8 | AACGGTAACTA | ||
| capuchon d’extrémité B1 * | ACGCTAAGCCA | ||
| capuchon d’extrémité B2 * | ACCAGATACA | ||
| capuchon d’extrémité B3 * | ACAAGATGTCA | ||
| capuchon de protection B4 * | ACGCATTGCA | ||
| capuchon d’extrémité B5 * | ACTGTCGAACA | ||
| capuchon d’extrémité B6 * | ACTTCTATCA | ||
| capuchon d’extrémité B7 * | CATTCAAAGCT | ||
| capuchon d’extrémité B8 * | TCCCAAGTCA | ||
Tableau 1 : Exemple de l’ADN de séquences pour l’hybridation du nHTs affichés dans Figure 1, qui étaient également utilisés dans des études précédentes sur nHTs9, Class = « xref » > 26,27,28. Le jeu de séquences permet l’assemblage de sept architectures tube différents (par exemple, a1 s’hybride avec la séquence complémentaire a1 *). Autres architectures de tube ne pas donnés ici peuvent également se former par l’addition ou la soustraction de brins accompagné par la cyclisation selon du chapelet n U1.
Figure 1 : Tube d’assemblage et l’architecture. (A) schéma de l’Assemblée d’un 4HT formé de quatre 42-mers distinctes. Des brins d’ADN simple brin adjacentes s’hybrider à travers les domaines alternance continues des bases de 10-11, indiqués par les noirs tiques (les tiques noirs courts indiquent des bases hybridées). Ce motif de moitié-décalés dispose des extrémités cohésives des deux côtés le long de l’axe, ce qui permet une croissance axiale, indiqué par la flèche. Les brins de limite U1 et T4 disposent également de domaines complémentaires et ainsi forment un anneau fermé, tel qu’indiqué par la flèche droite. Notez que ce dessin est une représentation 2D ; dans l’État hybride, les brins forment double hélices et toutes les bases sont jumelés. (B) schéma Quasi-3D d’un tétramère 4HT avec deux doubles hélices couverts dans la couche ombragée lointaine. Double hélices forment des domaines complémentaires et sont liées à deux hélices doubles adjacents du tube une fois par élément de longueur unitaire. Un brin de U2 est attiré plus épais pour plus de clarté. (C) exemples de sept architectures différentes tube sont donnés, avec un nombre de brins allant de 4 HT à 14 HT et lp allant de 1,2 à 26 µm. (D et E) images Epi-fluorescentes Cy3-étiqueté, adsorbé 5 HT et 10 HT illustrent les différentes raideurs via les contours courbes différemment. L’overlay rouge est le contour de filament trouvé par analyse d’image, avec bout-à distance R et l longueur contourC. Figure adaptée de Schuldt et al.9. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : rampe de température et assembly correspondant d’ADN nanotubes. (A) les nanotubes d’ADN sont assemblés dans un thermocycleur via un protocole contenant que plusieurs températures distinctes étapes sur à peu près 11 h. (B) dans un système PCR quantitatif en temps réel, la variation relative du signal fluorescent de mèches colorées est une mesure pour l’ADN double-brin nouvellement formé en passant par la rampe de température. Selon le type de nanotubes d’ADN, le taux de l’Assemblée peut différer. Le plus complexe le formant structure, plus l’Assemblée, sans doute depuis plusieurs brins (et donc plus les segments avec des séquences distinctes et températures locales de recuit) doivent s’hybrider aux endroits appropriés, un processus qui est entraîné par fluctuations thermiques stochastiques. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : image AFM représentant un réseau enchevêtré de 8HTs à 4 µM. Le profil de hauteur d’un réseau préformé de 8HTs absorbée sur une surface de mica a été enregistré à l’aide de mode de puiser dans l’air. Images de l’AFM visualiser une projection 2D du réseau mais ne permettent pas d’extraction de données (p. ex., maillage) pour le cas 3D fiable puisque les tubes ainsi que les réseaux sont compressés dans une configuration 2D. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : gamme linéaire. Mesures de la souche (G' = 1 Hz) révèlent un large plateau élastique linéaire, sans signes de réticulation des effets tels que le comportement non linéaire se manifestant comme le durcissement de la souche. Au-dessus une souche caractéristique (différente pour chaque nHT), le module élastique de plateau se détache irrémédiablement. Les barres d’erreur chaque représentent l’écart-type de la valeur moyenne de toutes les mesures effectuées. Figure adaptée de Schuldt et al.9. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : dépendance en fréquence typique d’un réseau enchevêtré 6HT. Réseaux de tubes d’ADN montrent un plateau large élasticité quatre ordres de grandeur, selon la fréquence appliquée. Comme prévu pour un réseau de polymère, l’élément élastique (G') du cisaillement complex module est significativement plus élevée que la partie visqueuse (G''). Figure adaptée de Schuldt et al.9. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Aucun effet de l’interface air-liquide. Fréquence de balayage (f-balayages ; γ = 5 %) de 8HT échantillons à 8 µM a révélé que l’influence des effets de l’évaporation et gélification à l’interface air-eau sont négligeables. Temps d’établissement différents, ainsi que deux méthodes connues pour réduire drastiquement les protéines de clustering à l’interface (agents tensio-actifs et lipides), ont été utilisés. Aucune indication d’influences drastiques par évaporation ou élasticité surface, indépendamment de la méthode ont été enregistrés. Ici, G' représente le module d’élasticité et G'' représente le module visqueux (lignes pointillées). Figure adaptée de Schuldt et al.9. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : aucune influence de la modification de la fin. Le module élastique plateau reste constant lors de la limitation des extrémités libres collantes de la 8HTs avec leurs séquences complémentaires respectives. Figure adaptée de Schuldt et al.9. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Influence les procédures de manipulation de l’ADN préformé networks sur la mesure. Selon la façon dont les réseaux préformés sont traitées après hybridation, les mesures peuvent varier. Dans cet exemple, le flux de cisaillement pendant le pipetage des nanotubes ADN a été considérablement varié et tubes cassé si manipulées sans trop de précaution. Rupture conduit à des interactions indésirables entre les exposés, simple-brins complémentaires corrélant aux segments cassées ou ruptures, ce qui conduit à une augmentation de l’élasticité et induit des effets non linéaires, sUCH comme souche durcissement (augmentation de l’élasticité pour courbe de grandes déformations, vert). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Nanotubes d’ADN permettent l’étude des dépendancesp l. (A) étudier les réseaux de polymères semi-flexibles avec nHTs permet l’étude de la réponse mécanique du système avec l’augmentation de la concentration (balayage de concentration), analogue aux études basées sur les biopolymères comme l’actine. (B) en outre, les différentes architectures des tubes facilitent la détermination de la réponse mécanique en ce qui concerne la variablep l, des filaments sous-jacente, qui est infaisable contenant naturellement semi-flexibles polymères. À cette fin, les données de A sont reloties pour régler la mise à l’échelle du module élastique plateau en ce qui concerne lp. Les barres d’erreur chaque représentent l’écart-type de la valeur moyenne de toutes les mesures effectuées. Figure adaptée de Schuldt et al.9. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 10 : taille de maillage et de Reptation. Enregistrer des images de fluorescence des filaments reptating (seule l’ADN 8HT intégré dans un réseau sans étiquette ; c = 14 µM) peut être utilisé pour vérifier la nature enchevêtrée des filaments dans le réseau. Aucun effet de réticulation ferait obstacle à cette diffusion unidimensionnelle. En médaillon : Analyse de Reptation peut être utilisée pour déterminer la taille de la maille d’échelle avec des concentrations, qui se compare bien aux mesures de l’actine et est d’accord avec les prédictions théoriques30. Les barres d’erreur chaque représentent l’écart-type de la valeur moyenne de toutes les mesures effectuées. Figure adaptée de Schuldt et al.9. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Pour obtenir des réseaux correctement formés, assembler les nanotubes d’ADN est une étape cruciale. Erreurs lors du processus de synthèse des effets négatifs sur la qualité du tube ; par conséquent, il est recommandé que HPLC ou un processus plus rigoureux servir à purifier les oligonucléotides. Étant donné que la formation de discrètes plutôt qu’agrégées nanotubes d’ADN, ainsi que leur répartition, leur longueur dépend de la stoechiométrie équimolaire des oligonucléotides constitutifs n dans l’ensemble, il est nécessaire de mesurer les concentrations des brins achetés, depuis certaines valeurs peuvent varier sensiblement de la concentration réelle. Cela peut être effectuée, par exemple, par spectroscopie UV-visible à une longueur d’onde d’absorbance de 260 nm. Nous tenons à noter que les poids moléculaires et des coefficients d’extinction varient entre les différentes séquences ; par conséquent, les valeurs à traduire l’absorbance à la concentration doivent être déterminées pour chaque oligonucléotides d’ADN. Lors de l’utilisation de matériel optimisé pour des petits échantillons, comme un NanoDrop, chaque point de mesure devrait être pris plusieurs fois et en moyenne. Se conformer à la gamme linéaire de détection du spectromètre. Diluer la fraction utilisée pour la détermination de la concentration si nécessaire. Légères imprécisions peuvent avoir une incidence importante sur la stoechiométrie correcte et la qualité de la formation du tube ; par conséquent, le pipetage des brins unique doit être le plus précis possible. Par la suite, la solution de l’échantillon final doit être bien mélangée par lentement pipetage l’échantillon de haut en bas avant de le placer dans le thermocycleur. Si brins ont été modifiés avec des colorants fluorescents pour la visualisation, toutes les mesures devraient être effectuées dans un environnement à l’abri de la lumière directe et l’addition ultérieure d’agents anti-blanchiment-établis (c.-à-d. l’oxygène nettoyage systèmes, tels que glucose oxydase/catalase) est recommandé. Après que les simples brins ont été mélangés dans les conditions de la droite tampon, une rampe de température est appliquée pour hybrider les structures (Figure 2 a). Cette tendance de la température suit la température d’hybridation critique préalablement déterminée, où l’ADN double forme d’hélices. Plusieurs méthodes ont été développées pour analyser la cinétique d’hybridation ADN (c.-à-d., native ADN UV absorbance31, calorimétrie32ou colorants fluorescents33). Dans cette dernière méthode, colorants intercaler dans l’ADN double hélices, formant des complexes très fluorescents plus lumineux que les colorants non liés. Ils se lient partiellement bicaténaire mais pas d’ADN simple brin34. Par conséquent, ces colorants ont été appliqués pour surveiller les ADN nanostructure auto-assemblage dans le système35 et peuvent être utilisés pour identifier les conditions de montage idéal.
Au départ, aucun ADN bicaténaire dans l’échantillon, comme le duplex prédéfinis et imprévue, dénaturés à une haute température (90 ° C) pour éviter l’appariement base involontaire. Une diminution progressive ultérieure (semblable à la Figure 2 a) de la température réduit le mouvement thermique des brins d’ADN, permettant aux événements de synchronisation de base. En raison de la minimisation de l’énergie libre, brins d’ADN s’hybrident préférentiellement à leurs séquences complémentaires. Lorsqu’on applique un colorant intercalant dsDNA spécifiques, la luminosité augmente avec la formation de complexes très fluorescents, qui est à son tour une mesure quantitative pour nouvellement formé d’ADN double-brin34. La variation relative du signal de fluorescence pour la formation de 4HTs et 8HTs est représentée dans la Figure 2 b. Cette modification relative est calculée par une moyenne de l’intensité de fluorescence pour chaque température et par la suite en soustrayant la valeur moyenne de la température précédente. Lorsque la température diminue, une fluorescence élevée peut être détectés (Figure 2 b), et le sommet de cette courbe met en évidence la température où se produisent les événements d’hybridation massive. La baisse des courbes se réfère à des valeurs d’intensité pour atteindre un plateau. Selon la construction de l’ADN et sa complexité (par exemple, un ensemble de petit ou grand d’ADN brins), le sommet peut être sharp (Figure 2 b, courbe bleue) ou large (Figure 2 b, courbe verte). Lorsque cela est possible, cela doit être testé pour chaque structure nouvellement conçu pour vous assurer que la partie progressivement décroissante de la rampe de température contienne l’intervalle où la formation des tubes par l’intermédiaire de la formation des segments d’ADN hybridée est en cours. Après la bonne température, régime est déterminé, nanostructures peut être assemblé avec succès dans des gammes de température très étroite (Figure 2 b, courbe bleue), ou même Isotherm35. Notez que l’hybridation de l’ADN de plusieurs brins en treillis périodiques induit coopérative effets recuit35,36, supportant un autre ADN recuit. On devrait considérer que les colorants intercalants étirement hélices d’ADN au-delà de leurs standards 10,5 paires de bases par configuration hélicoïdale tournant, altérant ainsi la géométrie globale des tubes. Par conséquent, il n’est pas conseillé d’augmenter la concentration de colorant sur une molécule par 900 de paires de bases ADN35. En outre, la température de l’Assemblée de pointe peut s’écarter de la température de recuit optimale. Pour atteindre la haute précision et de déterminer les meilleures conditions pour la formation des tubes, hybridation de l’ADN doit être étudiée au cours de nombreuses étapes de température variation lente, ce qui devraient être un double contrôle par électrophorèse sur gel d’agarose. Dans le cas des nanotubes ADN, nous avons établi un protocole de trois étapes. Tout d’abord, l’échantillon est chauffé à 90 ° C pour dénaturer l’ADN torons. Par la suite, une gamme de température large (autour de la crête de l’Assemblée du signal de fluorescence) est couvert. Dans notre cas, une gamme de 10 ° C est couverte, allant de 65 ° C à 55 ° C, avec une étape de-0,50 ° C toutes les 30 minutes. Dans la dernière étape, la température doit descendre rapidement à la température ambiante - ou, comme dans notre cas, 20 ° C - pour empêcher toute interaction défavorable à des températures intermédiaires (Figure 2 a). Habituellement, les thermocycleurs chauffent les échantillons provenant des températures plus froides. Par conséquent, il est important d’ajuster la température du couvercle en conséquence afin de limiter l’évaporation du liquide contenu dans l’échantillon pendant l’assemblage, ce qui augmente la concentration de l’échantillon final.
Si le nHTs est formés correctement, ils se chargent en réseaux purement intriqués (Figure 3), sans interactions causant des effets de réticulation entre tubes distincts. Crosslinks résulterait vraisemblablement des segments d’ADN non appariés s’étendant de défauts sur un tube ou aux extrémités cohésives, qui seraient libres de pair avec des segments simple brin complémentaires sur les tubes voisins. Ces effets induirait des propriétés non linéaires, tels que l’écrouissage (augmentant G' pour les plus grandes souches), mais ils sont absents dans empêtré réseaux (Figure 4). Les γ-balayages affichées révèlent également les régimes de tension linéaire appropriés pour des mesures rhéologiques en général. Dépassant un certain seuil, le réseau se rompt ou perd le contact avec les plaques du rhéomètre, qui endommage irréversible le système. Par conséquent, souches appliquées doivent être dans le régime linéaire pour obtenir des données fiables. En règle générale, une souche de 5 % est suffisante pour produire des données bien au-dessus du régime de bruit. Des souches plus élevées peuvent être appliqués ; Cependant, ils s’approchent facilement le seuil de rupture et résultats peuvent être falsifiEd en raison de la mesure dans le régime non linéaire.
Des mesures rhéologiques nécessitent une préparation minutieuse et cohérente de l’échantillon et un examen attentif des protocoles de mesure pour obtenir des résultats reproductibles et interprétables. Le point central est d’établir un réseau complètement aléatoire, isotrope entre les plaques de rhéomètre étant donné que ces réseaux est principalement la structure uniquement reproductible. Ainsi, le temps d’établissement assez longue (généralement vers 2 h, parfois même plus) sont nécessaires pour disperser toute commandes effets qui se produisent en raison de l’alignement induites par cisaillement lors du pipetage de l’échantillon. Pré-test expériences sont recommandés pour l’évolution temporelle (balayage de temps) du système d’enregistrement au cours de l’équilibration afin de déterminer le laps de temps nécessaire. Une fois les signaux atteignent des plateaux sans autres modifications, le système est équilibré. Une fois l’équilibration des conditions ont été déterminées, les tests souhaités, comme une souche rampe ou f - ou γ-balayages, peut être exécuté. Tester un large éventail de souches peut détruire en fin de compte le réseau ou la connexion avec les plaques. Cependant, si les tests sont limitées aux souches sous le seuil de rupture, rampes de souche et les balayages peuvent être itérative répétées d’enquêter sur les effets potentiels de vieillissement ou hystérésis. Dans le cas de f-balayages, temps peuvent varier considérablement. Tests de basses fréquences considérablement prolonge les expériences, comme une oscillation peut prendre plusieurs minutes. Notez que, dans le cas de nHTs, f-balayages révèlent que le module d’élasticité G' dépasse le module visqueux G'' d’environ un ordre de grandeur, qui illustre la réponse élastique prédominante de ces systèmes ( Figure 5). En règle générale, les différents types d’expériences peuvent être accompagnées de courtes f-balayages avant et après l’expérience principale pour vérifier que le système est resté non perturbé par la mesure elle-même. Toutefois, certaines machines possèdent changer le mode moteur sous-jacent pour les différents types de mesures, surtout lors du remplacement des expériences dynamiques (par exemple, les oscillations de f-balaie) à une rampe d’allongement statique. Ce changement est souvent accompagné de spontanée grandes déformations détruisant le réseau et des mesures ultérieures de trempe. Ainsi, il est recommandé de vérifier les caractéristiques du rhéomètre utilisé.
Rhéologie expériences sur les systèmes d’actine révèlent un effet dramatique de dénaturation de protéines qui se produisent à l’interface air-eau du système. Protéines dénaturées adhèrent besoin entre eux, formant ainsi un gel dense qui peut dominer fortement les propriétés mécaniques de l’ensemble du système. Pour éviter le contact direct de l’échantillon avec l’air ambiant, les techniques de passivation qui suppriment également l’évaporation de la teneur en eau de l’échantillon peuvent être utilisés. Trois méthodes possibles sont : (i) entourant le compartiment de mesure avec le même tampon comme dans l’exemple ; (ii) à l’aide de tensioactifs pour couvrir l’interface en raison de leurs domaines hydrophobes et hydrophiles (faut faire attention, car certains agents tensio-actifs interfèrent avec la conformation du polymère) ; ou (iii) employant des lipides biologiquement plus compatibles, ayant des effets similaires comme agents tensio-actifs. Il est à noter que nHTs ne trouvaient pas d’être soumis à des effets de dénaturation à l’interface, et les résultats sont indépendants de la méthode de passivation (Figure 6), qui élimine une importante source potentielle d’erreur. Généralement, le compartiment de mesure doit toujours être scellé avec un bouchon, qui peut être équipé avec des éponges humides pour augmenter l’humidité dans la chambre, supprimant l’évaporation.
Brièvement décrite auparavant, une source potentielle d’erreur dans les systèmes basés sur l’ADN est hybridée ADN, comme l’ADN simple brin non apparié surplombe à défauts ou aux extrémités des nanotubes, susceptible de provoquer des effets supplémentaires de réticulation. Pour pouvoir étudier et/ou éliminer cette possibilité, brins courts complémentaires permet de plafonner ces extrémités cohésives. Cependant, nos propres enquêtes ont montré que l’ajout de plafonner les brins à aucun effet sur l' introduction nHTs et le comportement des réseaux enchevêtrés est resté inchangé (Figure 7). Cependant, il peut être utile pour d’autres systèmes basés sur l’ADN (et plus complexes) supprimer les interactions indésirables de bouchage extrémités cohésives avec séquences complémentaires. En outre, échantillons de nHTs devraient être distribués avec soin (par exemple, pour les étapes de dilution et de préparation de l’échantillon) pour éviter toute rupture ou d’autres dommages aux tubes. Si la solution est reversée, trop gros, les tubes se casser incontrôlable, exposer un grand nombre d’extrémités cohésives à défaut points, menant à indésirés des interactions entre les tubes et la réticulation potentielle dans le système. Cela interfère avec le signal et conduit à des effets de raidissement, ainsi qu’à des effets non linéaires telles que l’écrouissage, qui devient visible en γ-balayages (Figure 8). Ainsi, pipetage la solution intriquée ne doit se faire lentement et à l’aide de pointes de pipette avec un diamètre assez grand (il est conseillé de couper l’extrémité d’un embout de la pipette) pour réduire le cisaillement des forces sur les tubes.
En conclusion, ADN nHTs sont un système de modèle approprié et hautement adaptable pour étudier les polymères semi-flexibles et réseaux formés de ces filaments, qui représentent une nouvelle classe d’hydrogels mécaniquement accordables de vrac. Si les tubes sont préparés avec soin, ils peuvent servir à tester l’impact de la lp des filaments dans différents cas. La mesure rhéologique en vrac d’enchevêtrer les réseaux, par exemple, révèle que les dépendances prédites théoriquement de l’élasticité avec concentration et lp sont incompatibles avec la mise à l’échelle expérimentale dérivée lois (Figure 9)9. Cette étude souligne que l’élasticité d’un réseau peut être augmentée en augmentant la rigidité des polymères sous-jacent. Traditionnellement, augmentant la rigidité d’un hydrogel a été obtenue en ajoutant des polymères plus à la solution ou en induisant des crosslinks (physiques ou chimiques) entre voisins polymères37,38. Cependant, une plus forte teneur moléculaire est également associée à un maillage réduite, ce qui peut limiter les applications telles que la culture cellulaire 3D. Liaisons transversales, en revanche, peuvent induire des changements morphologiques complexes au sein de l’architecture du réseau sous-jacent, qui complique encore le réglage précis des propriétés mécaniques39. À l’aide de réseaux de nHTs, cependant, permet un découplage complet de ces paramètres, par lequel les effets de renfort peuvent être induites en changeant uniquement la rigidité des filaments sous-jacente du maillage en laissant inaltérées. En outre, les architectures de tube peuvent être spécialement modifiés pour intégrer sélectivement des effets supplémentaires comme la réticulation, qui, de même dans les réseaux enchevêtrés, crée plus amples possibilités pour tester expérimentalement des prédictions théoriques pour paramètres tels quel p ou relier la taille et la force pour les réseaux. En règle générale, l’architecture programmable élargit le champ d’applications, permettant l’étude de lp-effets dépendant non seulement en vrac, mais aussi au niveau de la molécule unique. Tubes marqués peuvent être intégrées dans le réseau pour étudier, par exemple, la dépendance de lp sur le mouvement unidimensionnel d’un filament en forme de tube d’isolement, communément reptation (Figure 10)9. Si ce mouvement diffusif est visible, il vérifie également la nature entremêlée du réseau, car il pourrait être supprimée par effets de réticulation. Analyser la dynamique sous-jacente révèle également le maillage du réseau. En outre, ces tubes peuvent être utilisés pour étudier la dépendance de la raideur et la chiralité des tubes sous-jacent sur la formation de faisceaux40,41,42,43, 44 , structures de 45 ou d’ordre supérieur, comme semblable à une étoile asters46,47,48,49,50, qui peut être induite par les effets de la réticulation ou via environnements moléculairement bondé27.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous reconnaissons le financement par la DFG (1116/17-1) et la Faculté des Sciences naturelles de Leipzig « BuildMoNa » (CGC 185). Ce travail a été soutenu par le projet de Fraunhofer Attract 601 683. T. H. reconnaît le financement par le Fonds Social européen (FSE-100077106).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever ACTA | AppNano | ||
| AFM - NanoWizard 3 | JPK Instruments | ||
| CCD camera | Andor | iXon DV887 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DNA oligonucleotides | Biomers.net | For sequences see Table 1 | |
| DNA Cy3-labeled oligonucleotides | Biomers.net | For sequence see Table 1 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-9884 | |
| Epi-fluorescence micro-scope | Leica | DM-IRB | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| Mica "V1", 12 mm round | Plano GmbH | 50-12 | |
| MicroAmp® Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp® Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4306311 | |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 100x objective | Leica5 | 506168 | |
| Purified water | Merk Millipore - Milli-Q & Elix | ||
| Sapphire PCR tubes | Greiner Bio-One | 683271 | |
| TProfessional Standard PCR Thermocycler | Core Life Sciences Inc. | 070- Standard | |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4351405 | |
| Rheometer | TA Instruments | ARES | |
| SYBR® Green I nucleic acid gel stain | Thermo Fisher Scientific Inc. | S7567 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T4661 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich Co. | X-100 | Suppresses evaporation of sample at air-water interface |
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