Optisk tværsnit muskel område bestemmelse af Drosophila Melanogaster voksen indirekte flyvning muskler

Summary

Vi rapporterer en metode til at kvantificere muskel område, som er en indirekte metode til at bestemme muskelmasse i Drosophila voksne. Vi demonstrere anvendelsen af vores metodik ved at analysere den indirekte flyvning musklerne i Drosophila model af født dystrofi sygdom.

Abstract

Muskelmasse spilde, er kendt som muskelatrofi, en fælles fænotype i Drosophila modeller af neuromuskulære sygdomme. Vi har brugt de indirekte flyvning muskler (IFMs) af fluer, specielt de dorso-langsgående muskler (DLM), som den eksperimentelle under foranstaltning atrofisk fænotype som følge af forskellige genetiske årsager. I denne protokol, vi beskriver hvor hen til indkapsle flyve thorax muskler for semi tynde skæring, hvordan du kan få en god kontrast mellem muskel og det omgivende væv og sådan behandle optisk mikroskop billeder for semiautomatisk erhvervelse af kvantificerbare data og analyse. Vi beskriver tre specifikke anvendelser af metodologiske rørledningen. Først, vi viser, hvordan metoden kan anvendes til at kvantificere muskel degeneration i født dystrofi flyve model. andet, måling af muskel tværsnitsareal kan hjælpe med at identificere gener, der enten fremmer eller forhindrer muskelatrofi og/eller muskel degeneration; for det tredje, denne protokol kan anvendes til at afgøre, om en kandidat sammensatte er købedygtig væsentligt ændre en given atrofisk fænotype induceret af en sygdomsfremkaldende mutationeller af en miljømæssige udløser.

Introduction

Thorax af frugtflue indeholder to forskellige klasser af flyvningen muskler, som er funktionelt, fysiologisk og anatomisk adskilte. Disse muskler er: indirekte flyvning musklerne (IFM), som er sammensat af dorso-langsgående (DLM) og dorso-ventrale (DVM) muskler (figur 1) og synkrone flyvningen kontrollere musklerne^1,2. Disse muskler skabe sammen den forhøjede mekaniske strøm, der kræves for flyvningen. Størrelse, distribution og rostro-caudale disponeringen af IFMs tillader en nem orientering for tværgående skæring³ (figur 2A). Derfor har vi valgt disse muskler til at studere muskelatrofi i Drosophila melanogaster.

Figur 1. Diagram af thorax af frugtflue viser de indirekte flyvning muskler (IFMs) arrangement. (Venstre) repræsenterer en lateral udsigt og (til højre) repræsenterer et tværsnit af brystkassen. IFMs er sammensat af Dorso-langsgående (DLM) muskler (i rødt) og Dorso-ventrale (DVM) muskler (i grønt).

Bevarelse af væv struktur og kontrol over dorso-ventrale akse orientering af histologiske sektioner er afgørende for at sikre korrekt vurdering af muskel tværsnitsareal. At bevare muskelstruktur vi brugte en fiksering blanding ændret fra Tomlinson et al. ⁴ . Desuden, fordi musklerne er indre væv, uigennemtrængelighed af Drosophilaexoskeleton er et problem som fiksering blandinger ikke kan trænge igennem til målvæv. For at omgå dette problem, vi har fjernet den flyve hoved, ben, vinger og de sidste to segmenter af maven til at skabe huller, der tillod fiksering blandingen ind. Som en del af fiksering protokollen vi inkluderet behandling med osmium dinitrogentetraoxid (OsO₄)⁵, som er flittigt brugt på grund af dens evne til at løse fedtstoffer, herunder triglycerider. OsO₄ bevarer de fleste strukturer ekstremt godt, især på den cytologiske niveau og samtidig står i kontrast til billedet. Efter fiksering, var Drosophila thoraces indkapslet i harpiks for tværgående semi-tynd skæring (1,5 µm). For forbedret kontrast, kan væv desuden farves med toluidin blå. Billeder af komplet thoraces blev taget på 10 X og muskel område var kvantificeres ved binarizing billeder (af samme dimensioner) og kvantificere procentdel af pixels svarende til muskelvæv (sort pixel) af i alt, med ImageJ software.

Ændringer på væv forberedelse og fiksering blandinger, som forøgelse af koncentrationen af OsO₄ og glutaraldehyd løsning, indført i denne protokol, tilladt unikke bevarelse af muskelvæv. Dette skyldes, at protokollen undgår forringelse og deformation af væv, gøre den posteriore analyse af prøverne mere pålidelige selv under meget atrofisk forhold forbundet med neuromuskulære degenerative sygdomme såsom født dystrofi (DM). I sin mere almindelige form, DM type 1, er denne sjældne genetiske lidelse forårsaget af udvidet LBC gentagelser i født dystrofi protein kinase (DMPK) udskrifter. Mutant DMPK RNA aggregater form ribonuclear foci, at udskille Muscleblind-lignende nukleare RNA-bindende proteiner (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) i Drosophila)⁶. Vi genereret en Drosophila model af født dystrofi udtrykke 250 CTG gentager muskuløs myosin heavy chain promotor (Mhc-Gal4). Model fluer var flightless med en typisk 'op-holdt vinger' fænotype og havde alvorlig muskel atrofi i deres IFMs (figur 2B). Tidligere undersøgelser udført i vores laboratorium har vist, at bestemmelsen af muskel arealet af IFMs er en pålidelig metode til at kvantificere virkningerne af forskellige kemiske eller genetisk modificering af muskelatrofi i disse model flyver⁷. Som forbillede opnåede overekspression af Mbl isoform C i fluer udtrykker de 250 CTG gentager i musklen, en redning af muskel område, som Mbl udtynding af binding er den udløsende faktor i DM1 patogenese⁸ (figur 2 c). Muskel område blev også reddet efter fodring DM model flyver med Abp1, en hexapeptide med dokumenteret anti-DM1 aktivitet⁹ (figur 2D).

Figur 2. Kvantificering af dorsoventral dele af harpiks-embedded voksne thoraces. (A-D) indirekte flyvningen muskler af Drosophila melanogaster med de anførte relevante genotyper. A kontrol flyver (yw). (B) udtryk for 250 ikke-kodende CTG gentager i muskel (UAS-CTG(250)x) forårsaget en reduktion af muskel areal i DLMs i forhold til kontrol fluer. (C) denne muskel atrofi fænotype blev reddet af overekspression af Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS-MblC) og (D) fodring model flyver med hexapeptide Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). I alle billeder er den dorsale side på toppen. Transgener blev drevet til muskel ved hjælp af en Myosin heavy chain promotor (Mhc)-Gal4. (E) kvantificering af procentdel af muskel område i forhold til kontrol fluer bekræftet, at forskellene var betydelig. Histogrammet viser middel ± S.E.M. **p< 0,01 og * p < 0,05 (Student´s t-test). Skalalinjen: 200 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Metoden her rapporteret vil være af interesse for forskere med fokus på muskel udvikling, vedligeholdelse og aldring, sygdom patologi og test af lægemidler, da det giver pålidelige oplysninger om, hvordan muskelvæv reagerer på både endogene og eksterne faktorer.

Protocol

1. fiksering og harpiks indlejring

1. Bedøver fluer med kuldioxid (CO₂) eller via hypotermi ved hjælp af en isblok. Bruge en saks og dissekere mikroskop (med lav forstørrelse at se hele flue) til at fjerne benene, vingerne, hoved og den terminale del af maven til at fremme udbredelsen af fiksativ. Omhyggelig håndtering af kroppe er påkrævet på dette trin for at undgå deformering af brystkassen.
   Bemærk: Start med mindst 12 fluer per genotype at sikre et tilstrækkeligt antal korrekt forarbejdede enkeltpersoner i slutningen af proceduren.
2. Overføre kroppe til en 1,5 mL tube på is (placere et maksimum på 6 personer pr tube) indeholdende 200 µL af løsning 1.
   Bemærk: Kroppe kan ikke forblive i løsning 1 for mere end 20 min.
   1. Løsning 1, blande komponenter i disse volumen proportioner: ¼ 4% PARAFORMALDEHYD, ¼ 8% glutaraldehyd, ¼ 0,2 M Na₂HPO₄ og ¼ 0,2 M NaH₂PO₄.
3. Tilføje 200 µL af løsning 2 og der inkuberes i isbad i 30 min.
   1. Løsning 2: Bland løsning 1 og OsO₄ i en 1:1 (v/v) andel.
      Forsigtig: OsO₄ er ekstremt giftigt. Manipulere det i et stinkskab med passende sikkerhed og bortskaffelse foranstaltninger.
4. Fjerne al væsken. Tilføje 200 µL af løsning 2 og der inkuberes i isbad i 1-2 h.
5. Fjerne løsningen og dehydrere prøver gennem en gradueret ethanol serie som følger: en gang i 30%, 50%, 70%, 90% og to gange i absolut ethanol; 5 min hver. Der tilsættes 1 mL ethanol til at dække prøverne.
   Bemærk: Når vævet er placeret i 90% ethanol, de efterfølgende trin kan udføres ved stuetemperatur.
6. Inkuber prøver to gange i propylenoxid for 10 min hver inkubation.
   Forsigtig: Propylenoxid er giftigt, bruge det i et stinkskab.
7. Erstatte propylenoxid med en 1:1 (v/v) blanding af epoxy harpiks og propylen oxid og inkuberes ved rumtemperatur natten over.
   Forsigtig: Harpiksen er ekstremt giftigt i en flydende tilstand. Harpiksen er tilgængelig som et sæt af fire komponenter (A, B, C og D).
   1. Epoxyharpiks, tilføje i en engangs bægerglas 54 g af harpiks (A), 44,5 g hærder (B), 2,5 g speeder (C) og 10 g af blødgører (D). Kombinere alle harpiks komponenter i et stinkskab. Opbevares Ionbytteren opbevares i alikvoter ved-20 ° C (for op til 6 måneder) eller ved-80 ° C (i flere år).
   2. For at kassere harpiks, bage det ved 70 ° C i 24 timer fordi solid harpiks ikke er giftigt. Kassér alle de tidligere løsninger i gruppen tungmetaller efter passende internationale procedurer, fordi løsninger kan indeholde spor af OsO_4.
8. Erstatte den tidligere blanding med 100% resin, og Inkuber prøver for 4 h.
9. Overføre kroppe til plast forme indeholdende nye harpiks (én slagtekroppen i hver brønd af mug). Brug en skærpet træpind eller nål til at overføre og orientere slagtekroppe i brøndene og forlade harpiks til at polymerisere natten over i en Pasteur ovn ved 70 ° C.
   Bemærk: For at sikre passende orientering af slagtekroppe for posterior trimning og skæring, slagtekroppene skal ligge på deres lange side, med den forreste del af slagtekroppen meget tæt på kanten af brønden.

2. trimning og skæring af blokke

1. Fjerne polymeriseret resin blokke fra formene. Bruge barberblade til at trimme væk harpiks, danne en trapezform omkring slagtekroppen og give passende orientering i mikrotomen. Begynde at skære alle slagtekroppe efter den tværgående sutur at opnå sammenlignelige resultater.
   Bemærk: Afsnittet skal være vinkelret på anteroposterior akse DLMs til trim prøven korrekt ( figur 3).

Figur 3 . Dorsoventral dele af harpiks-embedded voksen thoraces af det myoton dystrofi model fluer. (A) var trimning af prøven ikke korrekt, da sektionen i den dorsale højre del af billedet ikke var helt tværgående til musklerne. Som følge heraf synes tre muskel bundter i øverste højre side større end dem på den venstre side. Denne fejl medfører en overvurdering af området muskel. B afsnit fra en korrekt trimmet harpiks blok. Skalalinjen: 200 µm.

1. Skær 1,5 µm tykt sektioner med en ultramicrotome og overføre sektionerne i vanddråber over forklistres dias.
   1. Hente afsnittene fra mesothorax-segmentet for alle prøver at opnå sammenlignelige resultater.
2. Marker de dias, der indeholder sektioner på en varme blok på 70-80 ° C, indtil H₂O fordamper. På dette tidspunkt kan prøver observeres med OsO₄ kontrast (figur 4A).

3. farvning IFM sektioner

1. Dække sektioner med nok toluidin blå til ca 30 s på varme blok.
   1. For toluidin blå løsning, 1% af toluidin blå og 1% af borax i H₂O. opløses
2. Skyl med H₂O og forlade diasene på en varm tallerken til at fordampe vand. Gentag farvning med toluidin blå hvis kontrasten skal være forbedret (figur 4B).

Figur 4 . Dorsoventral dele af harpiks-embedded voksen thoraces med forskellige kontrast stainings. Begge paneler viser billeder af DM1 model flyver fodret med Abp1 som i figur 2D. (A) billede af et afsnit med OsO₄ kontrast. B afsnit farves med toluidin blå giver bedre visualisering af muskel bundter. Skalalinjen: 200 µm.

4. montering IFM sektioner

1. Tørre dias med varme blokken indtil H₂O fordamper.
2. Sætte 1 eller 2 dråber af montering medium på afsnittene og sat på en coverslip.
   Forsigtig: Udføre dette trin i et stinkskab fordi montering medium er giftige.

5. anskaffelse af billeder og kvantificering af muskel område

1. Tag billeder ved lav forstørrelse, således at hele sættet af DLM muskler er i fokus. Vi bruger normalt 10 X.
   1. For statistisk analyse tager mindst 5 serie billeder per fly og analysere mindst 5 fluer per eksperimentelle gruppe.
2. Vælg det billede, der indeholder hele musklerne (figur 5A). Kontrollere akse eller orientering af afsnittet og kassere prøver med upassende orientering, som ville fordreje resultaterne (sammenligne tallene 3A / 3B til at skelne mellem skidt og godt orienteret sektioner, henholdsvis).
3. Brug ImageJ software til at vælge et område (i pixels) indeholder kun DLMs (figur 5A/5B). Til sammenligning mellem forskellige eksperimentelle grupper, ville området reference skal anvendes altid være flyve med de største muskler. I alle billeder af de forskellige genotyper sammenligne, skal du markere et område, der indeholder DLMs af samme dimensioner til området reference (figur 5B).
4. Binarize billeder med kommandoen billede-Jørgensen: Proces/Binary/gøre binære og slette de områder eller pixel, der ikke svarer til musklerne af interesse (figur 5 c).
   1. I tilfælde af at artefactual sorte pletter vises på andre områder end muskel, slette dem med kommandoen Tegnefunktioner og vælg symbolet, viskelæder.

Figur 5 . Billede analyse procedure for muskel område bestemmelse. (A) tværgående del af født dystrofi type 1 model flyve brystkasse med et rektangel, der indeholder DLM. (B) udvalgte område med kun indirekte flyvning musklerne og tarmen (*). (C) Binarized billede. Sorte områder svarer til musklerne i interesse. Tarmen er blevet slettet for en nøjagtig kvantificering af muskel område. Skalalinjen: 200 µm.

5. Kvantificere procentdel af pixels svarende til muskelvæv (sort pixel) ud af alt med kommandoen: Analyze/måling og vælg indstillingen område brøkdel. Denne procentdel af området er et skøn over DLM muskuløs massen af hver flue.

Representative Results

At kvantificere om overekspression af MblC eller administration af Abp1 havde nogen effekt i atrofisk Fænotypen af født dystrofi flyve model vi fokuserede på de DLMs, som er en del af IFMs (figur 1). Vi har besluttet, at modellen flyver, som express 250 ikke-kodende CTG gentager hele muskulaturen drevet af Myosin heavy-kæde promoter (Mhc)-Gal4, havde en 50% reduktion af muskel areal i forhold til at styre fluer. Derimod Co udtryk af MblC og udvidet CTG gentagelser med den samme driver, undertrykt stærkt sådan fænotype og crossectional muskel område blev 70% af kontrol (normal) fluer. Administration af Abp1 hexapeptide i den ernæringsmæssige medier ligeledes undertrykt atrofisk fænotype, og model fluer, der havde taget den sammensatte viste ca 60% af normal muskel område (i stedet for 50%, som er typisk for DM1 fluer; Figur 2E). Til kvantificering af disse prøver brugte vi sektioner farves med toluidin blå til at forbedre kontrast (tal 4 og 5).

Vi konstaterer, at en række tekniske glitches under proceduren betydeligt kan interferere med den endelige kvantificering. Fælles er, at harpiks blokke ikke er korrekt trimmet, som kan misorient prøven og føre til skrå skæring af DLMs. Som følge heraf nogle DLM muskler kan se større på den ene side i forhold til de kontralaterale one (Se for eksempel figur 3), som introducerer en væsentlig fejl i den endelige kvantificering. En anden fejl, der kan opstå er utilstrækkelig gennemtrængning af fiksativ i muskelvæv (figur 6), som ser degraderet og misdannede umuliggør en nøjagtig kvantificering af området muskel.

Discussion

Det er blevet påvist, at Drosophila melanogaster er en nyttig model til at studere menneskets neuromuskulære sygdomme^7,10,11, herunder født Dystrophies, som er karakteriseret ved fremkomsten af muskelatrofi. Protokollen præsenteres her er et nyttigt værktøj for kvantificering muskel degeneration forårsaget af debut eller progression af en bestemt sygdom i en flyve model. For eksempel, er det også muligt at følge og kvantificere degeneration af muskelfibre ved at udføre denne analyse i fluer i forskellige aldre.

Der er kritiske trin i protokollen. Tid til at dissekere fluer før deres fiksering skal minimeres for at undgå nedbrydning af væv. For penetration af Fikseringsvæske løsningen i musklerne (figur 6) er det vigtigt at fjerne hoved, vinger og ben af fluer til sikre adgang af løsninger til indre af fluen. Det er vigtigt at få tværgående sektioner hvor musklerne i interesse er helt synligt. Binarization af prøver til kvantificering er kritisk, så Bemærk at de markerede pixel (sort pixel) svarer til væv af interesse og den hel område af interesse er markeret.

Figur 6. Voksen Drosophila brystkasse med utilstrækkelig gennemtrængning af fiksativ i musklerne (*), der forårsager nedbrydning og deformation af væv under behandling af prøven. Skalalinjen: 200 µm.

En af de reagenser, der anvendes i denne protokol er OsO₄, der bevarer de fleste strukturer ekstremt godt, især på den cytologiske niveau, og samtidig giver kontrast til billede⁵. En vigtig Ulempen ved metoden er imidlertid toksicitet af OsO₄, som altid skal anvendes i et stinkskab og kræver sikker håndtering og bortskaffelse. Denne protokol tillader ikke kun nøjagtig kvantificering af muskelvæv på grund af fastsættelse og indlejring procedure, det kan også bruges til et andet program som elektronmikroskopi (EM) forberedelse. Men det lider en iboende begrænsning fordi de resulterende histologiske sektioner ikke kan bruges i efterfølgende assays, såsom Immunhistokemi.

Endelig, denne metode er også optimeret til at opdage små muskel område forskelle således pålidelig identifikation af modifikatorer i genetiske eller kemiske skærme^8,9. Ikke desto mindre, da øget muskel område ikke betyder nødvendigvis bedre muskelfunktion, tværsnits muskel område bestemmelse bør være ideelt korreleret med funktionelle assays såsom flight-undersøgelser,¹².

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-J software	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/
Ultramicrotome	Leica	Leica UC6
Microscope	Leica	Leica MZ6	Bright field technique.
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	71970	Several alternative providers exist.
Scissors	World Precision World	14003	Several alternative providers exist.
Embedding molds	Electron Microscopy Sciences	70900	Several alternative providers exist.
Glutaraldehyde	Fluka (Sigma)	49624	Toxic.
OsO4	Polyscience	0972A	Extremely toxic.
Propylene oxide	Sigma Aldrich	82320-250ML	Extremely toxic.
resin (Durcupan)	Sigma Aldrich	44611-44614	Carcinogenic when it is unpolymerized.
Toluidine blue	Panreac	251176	Toxic.
Mountant Medium (DPX)	Sigma Aldrich	44581	Dangerous.
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-500G	Harmful.
Na2HPO4	Panreac	122507	0.2 M dilution.
NaH2PO4	Panreac	121677	0.2 M dilution.
Borax	Panreac	3052	Toxic.