Détermination de zone optique transversale musculaire des Muscles de vol Indirect adulte de Drosophila Melanogaster

Summary

Nous présentons une méthode pour quantifier la zone musculaire, qui est une méthode indirecte pour déterminer la masse musculaire chez les adultes de la drosophile . Nous avons démontré que l’application de notre méthodologie en analysant le vol indirect les muscles dans un modèle drosophile de la maladie de la dystrophie myotonique.

Abstract

Masse musculaire, perdre, connu comme l’atrophie musculaire, est un phénotype commun dans des modèles de drosophile de maladies neuromusculaires. Nous avons utilisé les muscles de vol indirect (SIFM) de mouches, spécifiquement les muscles dorso-longitudinal (DLM), comme l’expérimental objet mesure le phénotype atrophique provoqué par des causes génétiques différentes. Dans ce protocole, nous décrivons comment incorporer des muscles thorax mouche pour la coupe fine semi, comment obtenir un bon contraste entre le muscle et le tissu environnant et comment traiter les images de microscope optique pour acquisition semi-automatique des données quantifiables et analyse. Nous décrivons trois applications spécifiques de l’oléoduc méthodologique. Tout d’abord, nous montrons comment la méthode peut être appliquée pour quantifier la dégénérescence musculaire dans un modèle de mouche de dystrophie myotonique ; Deuxièmement, mesure de la surface transversale de muscle peut aider à identifier les gènes qui favoriser ou empêchent l’atrophie musculaire et/ou la dégénérescence musculaire ; en troisième lieu, le présent protocole peut être appliqué pour déterminer si un composé du candidat est en mesure de modifier de façon significative un phénotype donné d’atrophique induit par une mutation pathogèneou par un déclencheur de l’environnement.

Introduction

Le thorax de la mouche à fruit contient deux classes différentes de muscles du vol, qui sont distinctes sur le plan fonctionnel, anatomiquement et physiologiquement. Ces muscles sont : les muscles de vol indirect (IFM), qui sont composées de dorso-longitudinal (DLM) et muscles dorso-ventral (DVM) (Figure 1) et le vol synchrone contrôlent muscles^1,2. Ces muscles génèrent ensemble la puissance élevée requise pour vol. La taille, la distribution et la disposition rostro-caudal du SIFM permettent une orientation facile pour coupe transversale³ (Figure 2 a). Pour cette raison, nous avons sélectionné ces muscles pour étudier une atrophie musculaire chez Drosophila melanogaster.

Figure 1. Diagramme du thorax de la drosophile montrant les muscles de vol indirect (SIFM) arrangement. (À gauche) représente une vue latérale et (à droite) représente une coupe transversale du thorax. Le SIGF se composent des muscles Dorso-longitudinal (DLM) (en rouge) et le Dorso-ventral (DVM) les muscles (en vert).

Préservation de la structure des tissus et la maîtrise de l’orientation de l’axe dorso-ventral de coupes histologiques sont essentielles pour assurer une évaluation correcte des transversale du muscle. Afin de préserver la structure du muscle, nous avons utilisé un mélange de fixation adapté de Tomlinson et al. ⁴ . En outre, parce que les muscles sont les tissus internes, l’imperméabilité de l’exosquelette de drosophileest un problème comme la fixation des mélanges ne peut pas pénétrer dans les tissus de cible. Pour contourner ce problème, nous avons supprimé la tête de la mouche, les jambes, les ailes et les deux derniers segments de l’abdomen pour créer des trous qui ont permis le mélange de fixation entrer. Dans le cadre du protocole de fixation que nous comprenait un traitement avec le tétroxyde d’osmium (OsO₄)⁵, qui est largement utilisé en raison de sa capacité à fixer les graisses, y compris les triglycérides. OsO₄ conserve la plupart des structures extrêmement bien, surtout au niveau cytologique et en même temps offre un contraste de l’image. Après fixation, Drosophila thoraces ont été incorporés dans la résine pour transversale semi-mince sectionnement (1,5 µm). Pour un contraste amélioré, le tissu peut être plus coloré avec toluidine bleu. Images de thoraces complets ont été prises à 10 X et zone musculaire a été quantifié par binarizing des images (de dimensions égales) et de quantifier le pourcentage de pixels correspondant au tissu musculaire (pixels noirs) sur total, avec les logiciels ImageJ.

Modification sur les mélanges de préparation et de la fixation de tissu, comme l’augmentation de la concentration de la solution₄ et glutaraldéhyde OsO, a présenté dans le présent protocole, autorisée unique préservation du tissu musculaire. C’est parce que le protocole permet d’éviter la dégradation et la déformation des tissus, rendant l’analyse postérieure des échantillons plus fiables même dans des conditions très atrophiques associées à des maladies dégénératives neuromusculaires comme la dystrophie myotonique (DM). Dans sa forme la plus commune, DM de type 1, cette maladie génétique rare est provoquée par élargi CUG répétitions dans les transcriptions de la protéine kinase de la dystrophie myotonique (HEPATO). Mutant HEPATO RNA regroupe des foyers de ribonuclear forme qui séquestrent les protéines de liaison à l’ARN nucléaires comme Muscleblind (MBNL1-3 ; MUSCLEBLIND (Mbl) chez la drosophile)⁶. Nous avons généré un modèle drosophile de dystrophie myotonique en exprimant 250 répétitions CTG sous le promoteur de la chaîne lourde de myosine musculaire (Mhc-Gal4). Les mouches de modèle ont été incapables de voler avec un phénotype typique « qui s’est tenue vers le haut les ailes » et avaient musculaire grave atrophie dans leur SIFM (Figure 2 b). Des études antérieures effectuées dans notre laboratoire ont montré que la détermination de l’aire de muscle du SIGF est une méthode fiable pour quantifier les effets de différents modificateurs chimiques ou génétiques de l’atrophie musculaire dans ces mouches de type⁷. Ainsi, la surexpression de la Mbl isoforme C chez les mouches exprimant la CTG 250 se répète dans le muscle, atteint un sauvetage de la zone de muscle, comme Mbl épuisement par séquestration est le facteur déclenchant en DM1 pathogenèse⁸ (Figure 2). Zone de muscle a été également secouru après que alimentant le modèle DM vole avec Abp1, un hexapeptide avec anti-DM1 éprouvée activité⁹ (Figure 2D).

Figure 2. Quantification des sections dorsoventral de thoraces adultes enrobées dans la résine. Muscles de vol Indirect (A-D) de Drosophila melanogaster avec les génotypes pertinentes indiquées. (A) contrôle les mouches (yw). (B) l’expression de 250 non-codantes CTG se répète dans le muscle (UAS-CTG(250)x) a entraîné une réduction de la zone musculaire DLMs comparativement aux mouches de contrôle. (C) ce phénotype d’atrophie musculaire a été secouru par la surexpression de la Muscleblind (MblC) (SAMU-CTG (250) x SAMU-MblC) et (D) alimentant les mouches de modèle avec l’hexapeptide Abp1 (SAMU-CTG (250) x Abp1). Dans toutes les images, la face dorsale est sur le dessus. Transgènes ont été conduits à la musculaire à l’aide d’un promoteur de chaîne lourde de myosine (Mhc)-Gal4. (E) quantification du pourcentage de la surface du muscle par rapport à le mouches de contrôle a confirmé que les différences étaient significatives. L’histogramme montre moyen ± S.E.M. **p< 0,01 et * p < 0,05 (Student´s t-test). Echelle : 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

La méthode mentionnée ici sera d’intérêt pour les chercheurs en se concentrant sur le développement musculaire, entretien et vieillissement, la maladie et le dépistage des drogues car il fournit des informations fiables sur comment le tissu musculaire répond à des facteurs endogènes et externes.

Protocol

1. fixation et résine enrobage

1. Anesthésier les mouches avec du dioxyde de carbone (CO₂) ou par hypothermie en utilisant un bloc de glace. Utiliser un microscope à dissection (avec faible grossissement de voir la volée entière) et des ciseaux pour enlever les pattes, ailes, tête et la partie terminale de l’abdomen pour faciliter la pénétration du fixateur. Une manipulation soigneuse des carcasses est nécessaire à cette étape afin d’éviter la déformation du thorax.
   Remarque : Commencez par au moins 12 mouches par génotype pour assurer un nombre suffisant d’individus correctement traitées à la fin de la procédure.
2. Transférer les carcasses dans un tube de 1,5 mL sur glace (en plaçant un maximum de 6 personnes par tube) contenant 200 µL de la solution 1.
   Remarque : Les carcasses ne peuvent rester dans la solution 1 pendant plus de 20 min.
   1. Pour la solution 1, mélanger les composants dans ces proportions de volume : ¼ de paraformaldéhyde à 4 %, glutaraldéhyde de 8 % ¼, ¼ 0,2 M Na₂HPO₄ et ¼ M 0,2 NaH₂PO₄.
3. Ajouter 200 µL de la solution 2 et incuber sur glace pendant 30 min.
   1. Solution 2 : Mélanger la solution 1 et OsO₄ dans une proportion de 1:1 (v/v).
      ATTENTION : OsO₄ est extrêmement toxique. Manipuler sous une hotte avec des mesures appropriées de sécurité et d’élimination.
4. Retirer tout le liquide. Ajouter 200 µL de la solution 2 et incuber sur glace pendant 1-2 h.
5. Enlever la solution et déshydrater les échantillons à travers une série graduée de l’éthanol comme suit : une fois à 30 %, 50 %, 70 %, 90 % et deux fois en éthanol absolu ; 5 min chacun. Ajouter 1 mL d’éthanol pour couvrir les échantillons.
   Remarque : Une fois que le tissu est placé dans l’éthanol à 90 %, les étapes suivantes peuvent être effectuées à la température ambiante.
6. Incuber les échantillons deux fois dans l’oxyde de propylène pendant 10 min chaque incubation.
   ATTENTION : L’oxyde de propylène est toxique, utilisez-le dans une hotte de laboratoire.
7. Remplacer l’oxyde de propylène par un mélange de 1:1 (v/v) de l’oxyde de propylène et de résine époxy et incuber à température ambiante jusqu’au lendemain.
   ATTENTION : La résine est extrêmement toxique à l’état liquide. La résine est disponible comme un ensemble de quatre composantes (A, B, C et D).
   1. Pour la résine époxy, ajouter dans un gobelet jetable 54 g de résine (A), 44,5 g de durcisseur (B), 2,5 g d’accélérateur (C) et 10 g de plastifiant (D). Combiner tous les composants de la résine sous une hotte. Conserver la résine en aliquotes à-20 ° C (pendant 6 mois) ou à-80 ° C (pendant plusieurs années).
   2. Pour rejeter la résine, cuis au four à 70 ° C pendant 24 h parce que la résine de synthèse n’est pas toxique. Jetez toutes les solutions précédentes du groupe de métaux lourds selon les procédures internationales appropriées, parce que des solutions peuvent contenir des traces d’OsO_4.
8. Remplacez le mélange précédent avec une résine 100 % et incuber les échantillons pendant 4 h.
9. Transférer les carcasses dans des moules en plastique contenant de la résine de nouveau (une carcasse dans chaque puits du moule). Utiliser un bâton de bois aiguisé ou une aiguille pour transférer et orienter les carcasses dans les puits et laisser la résine de polymériser pendant la nuit dans un four de Pasteur à 70 ° C.
   Remarque : Pour assurer une orientation appropriée des carcasses pour tailler postérieure et sectionnement, les carcasses doivent mentir sur leur côté le plus long, avec la partie antérieure de la carcasse très près du bord du puits.

2. coupe et découpe des blocs

1. Retirer les blocs de résine polymérisée de moules. Utiliser des lames de rasoir pour couper la résine, une forme trapézoïdale autour de la carcasse et donner une orientation appropriée dans le microtome. Démarrer tous les carcasses de sectionnement après la suture transversale pour obtenir des résultats comparables.
   Remarque : La section doit être perpendiculaire à l’axe antéro-postérieur des DLMs pour couper l’échantillon correctement ( Figure 3).

Figure 3 . Dorsoventral sections de thoraces adultes enrobées dans la résine de la dystrophie myotonique modèle mouches. (A), la taille de l’échantillon n’était pas correct car la figure dans la partie dorsale à droite de l’image n’était pas complètement transversale aux muscles. En conséquence, les faisceaux trois musculaires sur le côté droit supérieur semblent plus gros que ceux du côté gauche. Cette erreur se traduirait par une surestimation de la zone de muscle. (B) section d’un bloc de résine correctement ajustée. Echelle : 200 µm.

1. Couper 1,5 µm coupes épaisses avec un ultramicrotome et transférer les sections dans gouttes d’eau sur diapositives gélatinisés.
   1. Obtenir les sections du segment du mésothorax, pour tous les échantillons obtenir des résultats comparables.
2. Placez les diapositives contenant les sections sur un bloc de chauffage à 70-80 ° C jusqu'à ce que le H₂O s’évapore. À ce stade, les échantillons peuvent être observés avec le contraste de₄ OsO (Figure 4 a).

3. souillant des sections de l’IFM

1. Couvrir les sections avec assez toluidine bleu pendant environ 30 s sur le bloc de chauffage.
   1. Solution de bleu de toluidine, dissoudre 1 % de bleu de toluidine et 1 % de borax dans H₂O.
2. Rincer avec H₂O et laisser la glisse sur une plaque chaude pour faire évaporer l’eau. Répétez la coloration avec toluidine bleu si le contraste doit être amélioré (Figure 4 b).

Figure 4 . Dorsoventral sections de thoraces adultes enrobées dans la résine avec différents contraste salissures. Les deux panneaux de montrent des images de mouches de modèle DM1 nourries avec Abp1 comme dans la Figure 2D. (A) l’image d’une section avec le contraste de₄ OsO. (B) section colorée au toluidine bleue permet meilleure visualisation des faisceaux du muscle. Echelle : 200 µm.

4. montage sections IFM

1. Sécher les lames avec le bloc de chauffage jusqu'à ce que le H₂O s’évapore.
2. Mettre 1 ou 2 gouttes de milieu de montage sur les sections et mettre sur un lamelle couvre-objet.
   ATTENTION : Effectuer cette étape sous une hotte car le milieu de montage est toxique.

5. l’acquisition d’images et de quantification de la zone de muscle

1. Prendre les images à faible grossissement afin que l’ensemble des muscles DLM est au point. Nous utilisons normalement 10 X.
   1. Pour l’analyse statistique prendre au moins 5 images serial / mouche et analyser au moins 5 mouches chacun des groupes expérimentaux.
2. Sélectionnez l’image contenant les muscles entiers (Figure 5 a). Vérifier l’axe ou l’orientation de la section et de jeter les échantillons avec orientation inappropriée, ce qui fausserait les résultats (comparer les Figures 3 a / 3 b à faire la distinction entre mal et bien orientée, respectivement).
3. ImageJ logiciel permet de sélectionner une zone (en pixels) contenant uniquement les DLMs (Figure 5 a/5B). Comparaison entre les différents groupes expérimentaux, la zone de référence à utiliser serait toujours la mouche avec des muscles plus gros. Dans toutes les images des différents génotypes de comparer, sélectionner une zone contenant DLMs de dimensions égales à la surface de référence (Figure 5 b).
4. Binarize les images avec la commande Image-J : Processus/binaire/Make binaire et supprimer les zones ou les pixels qui ne correspondent pas aux muscles d’intérêt (Figure 5).
   1. Dans le cas où artéfactuelles taches noires apparaissent dans les zones autres que les muscles, les supprimer avec la commande des outils de dessin et sélectionnez le symbole de la gomme à effacer.

Figure 5 . Procédure d’analyse pour la détermination de zone musculaire d’image. (A) section transversale du modèle de la dystrophie myotonique de type 1 fly thorax avec un rectangle contenant le DLM. B zone sélectionnée avec seulement les muscles de vol indirect et l’intestin (*). Image (C) Binarized. Les zones noires correspondent aux muscles d’intérêt. L’intestin a été effacé pour une quantification précise de la zone de muscle. Echelle : 200 µm.

5. Quantifier le pourcentage de pixels correspondant au tissu musculaire (pixels noirs) sur total avec la commande : Analyse/mesure et sélectionnez l' option fraction de la région. Ce pourcentage de superficie est une estimation de la masse musculaire de DLM de chaque volée.

Representative Results

Afin de quantifier si la surexpression de MblC ou l’administration d’Abp1 avait eu aucun effet dans le phénotype atrophique du modèle mouche dystrophie myotonique, nous nous sommes concentrés sur les DLMs, qui font partie du SIFM (Figure 1). Nous avons déterminé que le modèle vole, qui expriment 250 non codantes CTG répétitions tout au long de la musculature entraînée par le promoteur de la chaîne lourde de la myosine (Mhc)-Gal4, présentaient une réduction de 50 % de la zone musculaire par rapport pour contrôler les mouches. En revanche, la co-expression de MblC et élargi CTG répète avec le même pilote, fortement réprimée tel phénotype et crossectional musculaire était 70 % de mouches (normale) de contrôle. Administration de l’hexapeptide Abp1 dans les médias nutritives de même supprimé le phénotype atrophique et mouches de modèle qui avaient pris le composé a montré environ 60 % des surfaces de muscle normal (au lieu de 50 % qui est typique des mouches DM1 ; Figure 2E). Pour la quantification de ces échantillons, nous avons utilisé des sections colorées au toluidine bleues pour renforcer le contraste (Figures 4 et 5).

Notons qu’au cours de la procédure un certain nombre de problèmes techniques peut-être considérablement gêner la quantification finale. Une commune est que les blocs de résine ne sont pas correctement coupées, qui peut misorient l’exemple et conduire à des coupes obliques des DLMs. En conséquence, certains muscles DLM peuvent paraître plus gros sur un côté par rapport à la controlatérale (voir par exemple Figure 3), qui introduit une erreur significative dans la quantification finale. Une autre erreur qui peut survenir est insuffisante pénétration du fixateur dans le tissu musculaire (Figure 6), qui semble dégradée et déformée, ce qui rend la quantification précise de la zone musculaire impossible.

Discussion

Il a été démontré que les Drosophila melanogaster est un modèle utile pour étudier les maladies neuromusculaires humaines^7,10,11, y compris la dystrophie myotonique, qui se caractérisent par l’apparition de atrophie musculaire. Le protocole présenté ici est un outil utile pour quantifier la dégénérescence musculaire causée par l’apparition ou la progression d’une maladie particulière à un modèle de mouche. Par exemple, il est également possible de suivre et de quantifier la dégénérescence des fibres musculaires en procédant à cette analyse chez les mouches d’âges différents.

Il y a des étapes critiques dans le protocole. Le temps nécessaire de disséquer les mouches avant leur fixation doit être réduite au minimum pour éviter la dégradation du tissu. Pour la pénétration de la solution de fixation dans les muscles (Figure 6), il est important d’enlever la tête, les ailes et les pattes des mouches pour garantir l’accès des solutions à l’intérieur de la mouche. Il est essentiel pour obtenir des sections transversales dans laquelle les muscles d’intérêt sont totalement visibles. La binarisation d’échantillons pour la quantification est critique donc remarque que les pixels sélectionnés (pixels noirs) correspondent à du tissu d’intérêt et toute la zone d’intérêt est sélectionné.

La figure 6. Thorax de drosophile adulte avec pénétration insuffisante du fixateur dans les muscles (*), ce qui provoque la dégradation et la déformation du tissu pendant le traitement de l’échantillon. Echelle : 200 µm.

L’un des réactifs utilisés dans le présent protocole est OsO₄, qui conserve la plupart des structures extrêmement bien, surtout au niveau cytologique et en même temps offre un contraste de l' image⁵. Cependant, un inconvénient important de la méthode est la toxicité de l’OsO₄, qui doit toujours être utilisé sous une hotte et exige l’élimination et manipulation sécuritaire. Ce protocole permet non seulement une quantification précise des tissus musculaires en raison de la fixation et l’incorporation de procédure, il peut également être utilisé pour une autre application comme préparation de microscopie électronique (me). Cependant, il souffre d’une limitation intrinsèque parce que les coupes histologiques qui en résulte ne peuvent servir lors d’essais ultérieurs, tels que l’immunohistochimie.

Enfin, cette méthode est également optimisée pour détecter les différences de zone de petits muscles permettant ainsi l’identification fiable des modificateurs en génétique ou chimique écrans^8,9. Néanmoins, puisque la zone musculaire accrue n’implique pas nécessairement la meilleure fonction de muscle, détermination de zone de muscle transversal devrait être idéalement en corrélation avec essais fonctionnels tels que des analyses de vol¹².

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-J software	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/
Ultramicrotome	Leica	Leica UC6
Microscope	Leica	Leica MZ6	Bright field technique.
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	71970	Several alternative providers exist.
Scissors	World Precision World	14003	Several alternative providers exist.
Embedding molds	Electron Microscopy Sciences	70900	Several alternative providers exist.
Glutaraldehyde	Fluka (Sigma)	49624	Toxic.
OsO4	Polyscience	0972A	Extremely toxic.
Propylene oxide	Sigma Aldrich	82320-250ML	Extremely toxic.
resin (Durcupan)	Sigma Aldrich	44611-44614	Carcinogenic when it is unpolymerized.
Toluidine blue	Panreac	251176	Toxic.
Mountant Medium (DPX)	Sigma Aldrich	44581	Dangerous.
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-500G	Harmful.
Na2HPO4	Panreac	122507	0.2 M dilution.
NaH2PO4	Panreac	121677	0.2 M dilution.
Borax	Panreac	3052	Toxic.