Determinação de área óptica transversal muscular dos músculos de voo indirecto adulto de Drosophila Melanogaster

Summary

Nós relatamos um método para quantificar a área do músculo, que é um método indireto para determinar a massa muscular em adultos de Drosophila . Demonstraremos que a aplicação de nossa metodologia, analisando o voo indirecto musculares em um modelo de drosófila de doença distrofia miotônica.

Abstract

Massa muscular, perdendo, conhecida como atrofia muscular, é um fenótipo comum em Drosophila modelos de doenças neuromusculares. Nós usamos os músculos de voo indirecto (IFMs) de moscas, especificamente os músculos dorso-longitudinal (DLM), como o experimental sujeito a medida que o fenótipo atrófico provocado por causas genéticas diferentes. Neste protocolo, descrevemos como incorporar os músculos do tórax voar para corte fino de semi, como obter um bom contraste entre o músculo e do tecido circundante e como processar imagens de microscópio ótico para aquisição semi-automática de dados quantificáveis e análise. Nós descrevemos três aplicações específicas do pipeline metodológica. Primeiro, mostramos como o método pode ser aplicado para quantificar a degeneração muscular em um modelo de distrofia miotônica voar; em segundo lugar, a medição da área transversal do músculo pode ajudar a identificar genes que promovem ou evitem a atrofia muscular e/ou degeneração muscular; em terceiro lugar, este protocolo pode ser aplicado para determinar se um candidato composto é capaz de modificar significativamente um determinado fenótipo atrófico induzido por uma doença-causando mutaçãoou por um gatilho ambiental.

Introduction

O tórax de mosca da fruta contém duas classes diferentes dos músculos de voo, que são funcionalmente, fisiologicamente e anatomicamente distintas. Estes músculos são: os músculos de voo indirecto (IFM), que são compostos de dorso-longitudinal (DLM) e músculos dorso-ventral (DVM) (Figura 1) e o voo síncrono controlam músculos^1,2. Estes músculos juntos geram a elevada potência mecânica necessária para o voo. O tamanho, a distribuição e a disposição rostro-caudal dos IFMs permitam uma fácil orientação para corte transversal³ (Figura 2A). Por esta razão, nós selecionamos estes músculos para estudar a atrofia muscular em Drosophila melanogaster.

Figura 1. Diagrama do tórax da mosca da fruta, mostrando os músculos de voo indirecto (IFMs) disposição. (Esquerda) representa uma vista lateral e (direita) representa uma seção transversal do tórax. Os IFMs são compostas dos músculos Dorso-longitudinal (DLM) (em vermelho) e o Dorso-ventral (DVM) músculos (em verde).

Preservação da estrutura do tecido e o controle sobre a orientação do eixo dorso-ventral dos cortes histológicos são críticos para garantir uma avaliação adequada da área transversal do músculo. Para preservar a estrutura muscular, usamos uma mistura de fixação modificada de Tomlinson et al ⁴ . Além disso, porque os músculos são tecidos internos, a impermeabilidade da drosófilado exoesqueleto é um problema como fixação misturas não podem penetrar os tecidos-alvo. Para contornar este problema, nós removemos a cabeça voar, pernas, asas e os dois últimos segmentos do abdome para criar buracos que permitiram a mistura de fixação entrar. Como parte do protocolo de fixação, que incluímos o tratamento com tetróxido de ósmio (OsO₄)⁵, que é amplamente utilizado devido à sua capacidade de corrigir as gorduras, incluindo os triglicerídeos. OsO₄ preserva a maioria das estruturas extremamente bem, particularmente a nível citológico e ao mesmo tempo proporciona o contraste da imagem. Após a fixação, Drosophila thoraces foram embutidos em resina para transversal semi fina corte (1,5 µm). Para melhor contraste, tecido pode ser adicionalmente manchado com toluidina azul. Imagens de thoraces completas foram tiradas em 10 X e área muscular foi quantificada por binarizing imagens (de dimensões iguais) e quantificar a percentagem de pixels correspondente ao tecido muscular (pixels pretos) total, com software ImageJ.

Modificações no tecido preparação e fixação misturas, como o aumento da concentração da solução de₄ e glutaraldeído OsO, introduzida no presente protocolo, permitido exclusiva preservação do tecido muscular. Isso ocorre porque o protocolo evita a degradação e a deformação do tecido, tornando a análise posterior das amostras mais confiável, mesmo em condições altamente atróficas associadas com doenças degenerativas neuromusculares tais como distrofia miotônica (DM). Na sua forma mais comum, DM tipo 1, esta desordem genética rara é provocada pela expandido CUG repetições em transcrições de proteína quinase de distrofia miotônica (DMPK). Mutante DMPK RNA agrega focos de ribonuclear de forma que sequestram as Muscleblind como nuclear RNA-proteínas (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) em Drosophila)⁶. Geramos um modelo de drosófila de distrofia miotônica expressando 250 repetições CTG sob o promotor de cadeia pesada de miosina muscular (Mhc-Gal4). Modelo moscas foram incapazes de voar com um fenótipo típico 'up-realizado asas' e tinham muscular grave atrofia em seus IFMs (Figura 2B). Estudos anteriores realizados em nosso laboratório mostraram que a determinação da área muscular do IFMs é um método confiável para quantificar os efeitos de diferentes modificadores químicos ou genéticos o atrofiamento muscular nestas moscas modelo⁷. Como exemplo, superexpressão de Mbl isoforma C em moscas, expressando o CTG 250 se repete no músculo, alcançado um resgate da área do músculo, como Mbl depleção por sequestro é o fator desencadeante em DM1 patogênese⁸ (Figura 2). Área do músculo também foi resgatada depois de alimentar o modelo DM voa com Abp1, um Hexapeptídeo com anti-DM1 comprovada atividade⁹ (Figura 2D).

Figura 2. Quantificação das secções dorsoventral da resina-incorporado thoraces adultos. Músculos de voo indireta (A-D) de Drosophila melanogaster com os genótipos relevantes indicados. (A) controle de moscas (yw). (B) a expressão de 250 não-codificantes CTG se repete no músculo (UAS-CTG(250)x) causou uma redução da área de músculo na webcam em comparação com o controle de moscas. (C) este fenótipo de atrofia muscular foi resgatado pela superexpressão de Muscleblind (MblC) (UEA-CTG (250) x UAS-MblC) e (D) alimentando as moscas de modelo com o Hexapeptídeo Abp1 (UEA-CTG (250) x Abp1). Em todas as imagens do lado dorsal está no topo. Transgenes foram impulsionadas a muscle usando um promotor de cadeia pesada de miosina (Mhc)-Gal4. (E) a quantificação da percentagem de área muscular relativo para as controle de moscas confirmou que as diferenças foram significativas. O histograma mostra meios ± no MEV mostrou * *p< 0,01 e * p < 0,05 (Student´s t-teste). Barra de escala: 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O método aqui relatado será de interesse para pesquisadores, com foco no desenvolvimento muscular, manutenção e envelhecimento, patologia da doença e teste de drogas, pois fornece informações confiáveis sobre como o tecido muscular responde a fatores endógenos e externos.

Protocol

1. fixação e incorporação de resina

1. Anestesia as moscas com dióxido de carbono (CO₂) ou através de hipotermia, usando um bloco de gelo. Use um microscópio dissecação (com baixa ampliação para ver toda mosca) e tesoura para remover as pernas, asas, cabeça e a parte terminal do abdômen para facilitar a penetração do fixador. Cuidado, manipulação das carcaças é necessário nesta etapa para evitar a deformação do tórax.
   Nota: Comece com pelo menos 12 moscas por genótipo para garantir um número suficiente de indivíduos devidamente processados no final do procedimento.
2. Transfira as carcaças para um tubo de 1,5 mL no gelo (colocando um máximo de 6 pessoas por tubo) contendo 200 µ l de solução 1.
   Nota: As carcaças não podem permanecer na solução 1 para mais de 20 min.
   1. Para a solução 1, misturar componentes nessas proporções de volume: ¼ paraformaldeído 4%, ¼ de 8% de glutaraldeído, ¼ 0,2 M Na₂HPO₄ e 0,2 M ¼ NaH₂PO₄.
3. Adicionar 200 µ l de solução 2 e incubar no gelo por 30 min.
   1. Solução 2: Misture a solução 1 e OsO₄ em uma proporção de 1:1 (v/v).
      Cuidado: OsO₄ é extremamente tóxico. Manipulá-lo em uma coifa com medidas adequadas de segurança e de reciclagem.
4. Retire todo o líquido. Adicionar 200 µ l de solução 2 e incubar no gelo por 1-2 h.
5. Remover a solução e desidratar as amostras através de uma série de etanol classificados da seguinte forma: uma vez em 30%, 50%, 70%, 90% e duas vezes em etanol absoluto; 5 min cada. Adicione 1 mL de etanol para cobrir as amostras.
   Nota: Uma vez que o tecido é colocado em etanol a 90%, as etapas subsequentes podem ser executadas em temperatura ambiente.
6. Incube as amostras duas vezes em óxido de propileno por 10 min cada incubação.
   Atenção: O óxido de propileno é tóxico, usá-lo em uma coifa.
7. Substituir o óxido de propileno por uma mistura de 1:1 (v/v) de óxido de resina e propileno de epóxi e incubar à temperatura ambiente durante a noite.
   Cuidado: A resina é extremamente tóxica em estado líquido. A resina está disponível como um conjunto de quatro componentes (A, B, C e D).
   1. Para resina epóxi, adicione num copo descartável de 54 g de resina (A), 44,5 g de endurecedor (B), 2,5 g de accelerator (C) e 10 g de plastificante (D). Combine todos os componentes de resina em uma coifa. Armazene a resina em alíquotas a-20 ° C (por até 6 meses) ou a-80 ° C (por vários anos).
   2. Para descartar a resina, asse a 70 ° C por 24 h porque resina sólida não é tóxica. Descarte todas as soluções anteriores no grupo de metais pesados, de acordo com os procedimentos internacionais adequados, porque soluções podem conter vestígios de OsO_4.
8. Substitua a mistura anterior com 100% de resina e incubar as amostras para 4 h.
9. Transferi as carcaças para moldes de plástico que contém a nova resina (uma carcaça em cada poço do molde). Usar uma vara afiada de madeira ou agulha para transferir e orientar as carcaças dos poços e deixar a resina para polimerizar durante a noite em um forno de Pasteur a 70 ° C.
   Nota: Para garantir orientação adequada das carcaças para posterior desbaste e de corte, as carcaças devem ser deitado no seu lado comprido, com a parte anterior da carcaça muito perto da borda do poço.

2. limpeza e corte de blocos

1. Remova os blocos de resina polimerizada os moldes. Use lâminas de barbear para aparar a resina, uma forma trapezoidal em torno da carcaça e dar orientação adequada no micrótomo. Comece todas as carcaças de corte após a sutura transversal para obter resultados comparáveis.
   Nota: A seção deve ser perpendicular ao eixo ântero-posterior da webcam para aparar a amostra corretamente ( Figura 3).

Figura 3 . Dorsoventral seções de thoraces adultos resina-incorporado a distrofia miotônica modelo moscas. Em (A), o corte da amostra não era correto, conforme a seção na parte dorsal direita da imagem não foi completamente transversal aos músculos. Como consequência, os pacotes de três músculos do lado direito superior parecem maiores do que os do lado esquerdo. Este erro resultaria em uma superestimação da área muscular. (B) seção de um bloco de resina corretamente aparadas. Barra de escala: 200 µm.

1. Corte 1,5 µm seções espessas com um ultramicrotome e transferir as seções em gotas de água sobre slides gelatinizadas.
   1. Obter as seções do segmento mesothorax para todas as amostras obter resultados comparáveis.
2. Coloque as lâminas contendo as seções em um bloco de aquecimento a 70-80 ° C, até que se evapore o H₂O. Neste ponto, as amostras podem ser observadas com o contraste de₄ OsO (Figura 4A).

3. coloração de seções IFM

1. Cobrir as seções com suficiente toluidina azul para aproximadamente 30 s no bloco de aquecimento.
   1. Para a solução de azul de toluidina, dissolver 1% de azul de toluidina e 1% de bórax em H₂O.
2. Enxaguar com H₂O e deixar os slides sobre uma chapa quente para evaporar a água. Repita a coloração com toluidina azul se o contraste precisa ser reforçada (Figura 4B).

Figura 4 . Dorsoventral seções de resina-incorporado thoraces adultos com contraste diferentes colorações. Ambos os painéis mostram imagens de DM1 modelo moscas alimentadas com Abp1 como na Figura 2D. (A) a imagem de uma seção com o contraste de₄ OsO. (B) seção manchada de toluidina azul permite melhor visualização dos pacotes musculares. Barra de escala: 200 µm.

4. montagem seções IFM

1. Seca as lâminas com o bloco de aquecimento até que se evapore o H₂O.
2. Coloque 1 ou 2 gotas de meio de montagem nas secções e coloque sobre uma lamela.
   Atenção: Realizar esta etapa em uma coifa, porque o meio de montagem é tóxico.

5. aquisição de imagens e quantificação da área muscular

1. Com as imagens em baixa ampliação para que todo o conjunto de músculos DLM está em foco. Normalmente usamos 10 X.
   1. Para análise estatística leva pelo menos 5 imagens seriais por mosca e analisar pelo menos 5 moscas por grupo experimental.
2. Selecione a imagem que contém os músculos inteiro (Figura 5A). Verifique o eixo ou a orientação da seção e descartar as amostras com orientação inadequada, o que distorceria os resultados (comparar figuras 3A / 3B para distinguir entre o mal e seções bem orientadas, respectivamente).
3. Use o software ImageJ para selecionar uma área (em pixels) que contém apenas a webcam (Figura 5A/5B). Para comparação entre diferentes grupos experimentais, a área de referência a ser usado seria sempre a voar com os músculos maiores. Em todas as imagens de diferentes genótipos de comparar, selecionar uma área contendo webcam de dimensões iguais à área de referência (Figura 5B).
4. Binarize as imagens com o comando imagem-J: Processo/binário/fazer binário e excluir as áreas ou pixels que não correspondem aos músculos de interesse (Figura 5).
   1. No caso de artefactual manchas pretas aparecem em outras áreas além do músculo, excluí-los com o comando ferramentas de desenho e selecione o símbolo de borracha.

Figura 5 . Procedimento de análise para determinação de área do músculo de imagem. (A) seção transversal da distrofia miotônica tipo 1 modelo voar do tórax com um retângulo que contém a DLM. (B) área selecionada com apenas os músculos de voo indirecto e o intestino (*). (C) Binarized imagem. As áreas pretas correspondem aos músculos de interesse. O intestino foi apagado por uma quantificação precisa da área do músculo. Barra de escala: 200 µm.

5. Quantificar a percentagem de pixels correspondente ao tecido muscular (pixels pretos) total com o comando: Analyze/medição e selecione a opção fração de área. Esta percentagem de área é uma estimativa da massa muscular de cada mosca DLM.

Representative Results

Para quantificar se a superexpressão de MblC ou a administração de Abp1 tiveram qualquer efeito no fenótipo atrófica do modelo mosca distrofia miotônica que enfocamos a webcam, que fazem parte do IFMs (Figura 1). Determinamos que o modelo voa, que expresso 250 repetições CTG não-codificante em toda a musculatura conduzido pelo promotor cadeia pesada de miosina (Mhc)-Gal4, teve uma redução de 50% da área muscular comparado com o controle de moscas. Em contraste, expressão co de MblC e repetições CTG expandidas com o mesmo motorista, fortemente suprimida tal fenótipo e crossectional área de músculo foi de 70% das moscas (normal) de controle. Administração do Abp1 hexapeptide na mídia nutritiva suprimida da mesma forma o fenótipo atrófico e moscas de modelo que tinham tomado o composto mostrou aproximadamente 60% da área muscular normal (em vez de 50% que é típico da DM1 moscas; Figura 2E). Para a quantificação destas amostras, foi utilizado seções manchadas de toluidina azuis para melhorar o contraste (figuras 4 e 5).

Notamos que, durante o procedimento, um número de falhas técnicas significativamente pode interferir com a quantificação final. Uma comum é que blocos de resina não são corretamente aparados, que pode misorient a amostra e levar até a corte oblíquo da webcam. Como consequência, alguns músculos DLM podem parecer maiores de um lado, em relação à contralateral (veja por exemplo a Figura 3), que introduz um erro significativo na quantificação final. Um outro erro que pode ocorrer é penetração inadequada do fixador no tecido muscular (Figura 6), que parece deformado, tornando impossível a quantificação exata da área muscular e degradadas.

Discussion

Foi demonstrado que a Drosophila melanogaster é um modelo útil para estudar doenças neuromusculares humanas^7,10,11, incluindo distrofias miotônicas, que se caracterizam pelo aparecimento de atrofia muscular. O protocolo aqui apresentado é uma ferramenta útil para quantificar a degeneração muscular causada pelo aparecimento ou progressão de uma doença específica em um modelo de voar. Por exemplo, também é possível acompanhar e quantificar a degeneração das fibras musculares, realizando esta análise em moscas de diferentes idades.

Há passos críticos no protocolo. O tempo necessário para dissecar as moscas antes que sua fixação deve ser minimizada para evitar a degradação do tecido. Para a penetração da solução fixador nos músculos (Figura 6), é importante remover a cabeça, asas e pernas das moscas para garantir o acesso das soluções para o interior de uma mosca. É essencial para obter as seções transversais em que os músculos de interesse são totalmente visíveis. A binarização das amostras para quantificação é crítica para que nota que os pixels selecionados (pixels pretos) correspondem do tecido de interesse e toda a área de interesse é selecionada.

Figura 6. Tórax de Drosophila adulto com penetração inadequada do fixador nos músculos (*), que provoca a degradação e a deformação do tecido durante o processamento da amostra. Barra de escala: 200 µm.

Um dos reagentes utilizados neste protocolo é OsO₄, que preserva a maioria das estruturas extremamente bem, particularmente a nível citológico e ao mesmo tempo fornece o contraste com a imagem⁵. No entanto, uma desvantagem importante do método é a toxicidade do OsO₄, que sempre deve ser usado em uma coifa e requer disposição e manuseio seguro. Este protocolo não só permite a quantificação exata do tecido muscular devido à fixação e procedimento de incorporação, também pode ser usada por outro aplicativo como preparação de microscopia de elétron (EM). No entanto, sofre uma limitação intrínseca porque os cortes histológicos resultantes não podem ser usados em ensaios posteriores, tais como a imuno-histoquímica.

Finalmente, esse método também é otimizado para detectar diferenças de área pequeno músculo, permitindo a identificação fiável de modificadores em genética ou química telas^8,9. No entanto, desde que a área de aumento muscular não implica necessariamente a melhor função do músculo, determinação de área de seção transversal do músculo deve ser idealmente correlacionada com ensaios funcionais tais como ensaios de voo¹².

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-J software	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/
Ultramicrotome	Leica	Leica UC6
Microscope	Leica	Leica MZ6	Bright field technique.
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	71970	Several alternative providers exist.
Scissors	World Precision World	14003	Several alternative providers exist.
Embedding molds	Electron Microscopy Sciences	70900	Several alternative providers exist.
Glutaraldehyde	Fluka (Sigma)	49624	Toxic.
OsO4	Polyscience	0972A	Extremely toxic.
Propylene oxide	Sigma Aldrich	82320-250ML	Extremely toxic.
resin (Durcupan)	Sigma Aldrich	44611-44614	Carcinogenic when it is unpolymerized.
Toluidine blue	Panreac	251176	Toxic.
Mountant Medium (DPX)	Sigma Aldrich	44581	Dangerous.
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-500G	Harmful.
Na2HPO4	Panreac	122507	0.2 M dilution.
NaH2PO4	Panreac	121677	0.2 M dilution.
Borax	Panreac	3052	Toxic.