Optiska tvärsnittsdata muskel område bestämning av Drosophila Melanogaster vuxen indirekta flygmuskler

Summary

Vi rapporterar en metod för att kvantifiera muskel område, som är en indirekt metod att bestämma muskelmassa i Drosophila vuxna. Vi visar tillämpningen av vår metod genom att analysera indirekta flygningen muskler i Drosophila modell av internationellt dystrofi sjukdom.

Abstract

Muskelmassa slösa, kallas muskelatrofi, en gemensam fenotyp i Drosophila modeller av neuromuskulära sjukdomar. Vi har använt de indirekta flygmuskler (innovativa) av flugor, specifikt dorso-längsgående musklerna (DLM), som den experimentella omfattas av åtgärd atrofisk fenotypen som åstadkommits genom olika genetiska orsaker. I detta protokoll, beskriver vi hur till bädda in flyga bröstkorgens muskler för semi tunn snittning, skaffa en bra kontrast mellan muskel och den omgivande vävnaden och hur att behandla optiska mikroskopbilder för halvautomatisk förvärv av kvantifierbara data och analys. Vi beskriver tre specifika tillämpningar av metodologiska rörledningen. Först, vi visar hur metoden kan användas för att kvantifiera muskel degeneration i internationellt dystrofi flyga modell; för det andra, mätning av muskel tvärsnittsarea kan hjälpa till att identifiera gener som antingen främjar eller hindrar muskelatrofi eller muskel degeneration; för det tredje, detta protokoll kan tillämpas för att avgöra om en sökande förening kunna avsevärt ändra en viss atrofisk fenotyp som induceras av en sjukdomsframkallande mutationeller av en miljö-utlösare.

Introduction

Bröstkorgen av bananflugan innehåller två olika klasser av flygningen muskler, som är funktionellt, fysiologiskt och anatomiskt distinkta. Dessa muskler är: indirekta flyg musklerna (IFM), som består av dorso-längsgående (DLM) och dorso-ventrala (DVM) muskler (figur 1) och synkrona flygningen styra musklerna^1,2. Dessa muskler generera tillsammans den förhöjda mekanisk kraft som krävs för flygning. Storlek, distribution och rostro-kaudala disposition av innovativa tillåta en enkel orientering för övergripande snittningen³ (figur 2A). Därför har vi valt dessa muskler att studera muskelatrofi på Drosophila melanogaster.

Figur 1. Diagram över bröstkorgen av bananflugan visar indirekta flyg musklerna (innovativa) arrangemang. (Vänster) representerar sidoutsikt och (höger) representerar ett tvärsnitt av bröstkorgen. Innovativa består av Dorso-längsgående (DLM) muskler (i rött) och de Dorso-ventrala (DVM) muskler (i grönt).

Bevarandet av vävnad struktur och kontroll över dorso-ventrala axis orientering av histologiska sektioner är avgörande för att säkerställa korrekt bedömning av muskel tvärsnittsarea. Att bevara muskel struktur vi använde en fixering blandning modifierad från Tomlinson o.a. ⁴ . Eftersom musklerna är inre vävnader, är ogenomtränglighet av Drosophilaexoskelett dessutom ett problem som fixering blandningar inte kan tränga in till målvävnaderna. För att kringgå problemet, vi tog bort flyga huvud, ben, vingar och de två sista segmenten av buken att skapa hål som tillät fixering blandningen att ange. Som en del av protokollet fixering vi ingår behandling med osmium vanligtvis (OsO₄)⁵, som används flitigt på grund av dess förmåga för att fixa fetter, inklusive triglycerider. OsO₄ bevarar de flesta strukturer mycket väl, särskilt på nivån cytologiska och samtidigt ger kontrast i bilden. Efter fixering bäddades Drosophila thoraces i harts för övergripande semi tunna snittning (1,5 µm). För förbättrad kontrast, kan vävnad dessutom färgas med toluidinblått blå. Bilder på komplett thoraces togs på 10 X och muskel område kvantifierades genom binarizing bilder (av samma dimensioner) och kvantifiera andelen pixlar motsvarar muskelvävnad (svarta pixlar) av totalt, med ImageJ programvara.

Ändringar på vävnad förberedelse och fixering blandningarna, som ökningen av koncentrationen av OsO₄ och glutaraldehyd lösning, införs i detta protokoll, tillåtna unika bevarande av muskelmassa. Detta beror på att protokollet undviker nedbrytning och deformation av vävnad, vilket gör den bakre analysen av proverna mer tillförlitlig även i mycket atrofisk villkor som är förknippade med neuromuskulära degenerativa sjukdomar såsom internationellt dystrofi (DM). I sin vanliga form, DM typ 1, sker detta sällsynt genetisk sjukdom genom utökad CUG repetitioner i internationellt dystrofi proteinkinas (DMPK) betyg. Mutant DMPK RNA aggregerar form ribonuclear foci att binda Muscleblind-liknande nuclear RNA-bindande proteiner (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) i Drosophila)⁶. Vi genereras en Drosophila modell av internationellt dystrofi av uttrycker 250 CTG repetitioner under muskulös myosin heavy chain arrangören (Mhc-Gal4). Modellen flugor var flygoförmögna med en typisk 'upp-hölls wings' fenotyp och hade allvarliga muskel atrofi i deras innovativa (figur 2B). Tidigare studier som utförts i vårt laboratorium har visat att bestämning av området muskel i innovativa är en tillförlitlig metod för att kvantifiera effekterna av olika kemiska eller genetiska modifierare av muskelatrofi i dessa modell flugor⁷. Som ett exempel uppnås överuttryck av Mbl isoform C i flugor att uttrycka den 250 CTG repetitioner i muskeln, en räddning av muskel område, som Mbl utarmning av kvarstad är den utlösande faktorn i DM1 patogenes⁸ (figur 2 c). Muskel område räddades också efter utfodring DM modellen flyger med Abp1, en hexapeptid med beprövade anti-DM1 aktivitet⁹ (figur 2D).

Figur 2. Kvantifiering av dorsoventral delar av harts-embedded vuxen thoraces. (A-D) indirekta flyg musklerna i Drosophila melanogaster med de angivna relevanta genotyperna. (A) kontroll flyger (yw). (B) uttryck för 250 icke-kodande CTG repetitioner i muskel (UAS-CTG(250)x) orsakade en minskning av muskel område i DLM jämfört med kontroll flugor. (C) denna muskel atrofi fenotyp räddades av överuttryck av Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS-MblC) och (D) utfodring modell flugor med hexapeptid Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). Ryggsidan är på topp i alla bilder. Transgener kördes till muskel med hjälp av Myosin heavy-kedjan främjare (Mhc)-Gal4. (E) kvantifiering av andelen muskel område i förhållande till kontroll flugorna bekräftade att skillnaderna var signifikanta. Histogrammet visar medel ± S.E.M. **p< 0,01 och * p < 0,05 (Students t-test). Skalstapeln: 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Metoden här rapporterade kommer att vara av intresse för forskare med fokus på muskelutveckling, underhåll och åldrande, sjukdom patologi och drogtester eftersom det ger tillförlitlig information om hur muskelvävnaden svarar på både kroppsegna och externa faktorer.

Protocol

1. fixering och harts inbäddning

1. Söva flugor med koldioxid (CO₂) eller via hypotermi med hjälp av ett isblock. Använd en sax och dissekera Mikroskop (med låg förstoring att se hela flugan) ta bort benen, vingar, huvudet och den terminala delen av buken för att underlätta penetration av fixeringsvätskan. Varsam hantering av slaktkroppar krävs vid detta steg för att undvika deformation av bröstkorgen.
   Obs: Börja med minst 12 flugor per genotyp att säkerställa ett tillräckligt antal korrekt bearbetade individer i slutet av förfarandet.
2. Överföra slaktkroppar till en 1,5 mL tub på is (placera högst 6 personer per rör) innehållande 200 µL lösning 1.
   Obs: Slaktkroppar kan inte förbli i lösning 1 för mer än 20 min.
   1. För lösning 1, blanda komponenter i dessa volym proportioner: ¼ 4% PARAFORMALDEHYD och ¼ 8% glutaraldehyd, ¼ 0,2 M Na₂HPO₄ ¼ 0,2 M NaH₂PO₄.
3. Tillsätt 200 µL av lösning 2 och inkubera på is i 30 min.
   1. Lösning 2: Blanda lösning 1 och OsO₄ i en 1:1 (v/v) andel.
      FÖRSIKTIGHET: OsO₄ är extremt giftigt. Manipulera det i dragskåp med lämpliga åtgärder för säkerhet och avfallshantering.
4. Ta bort all vätska. Tillsätt 200 µL av lösning 2 och inkubera på is för 1-2 h.
5. Ta bort lösningen och torka proverna genom en graderad etanol serie enligt följande: en gång i 30%, 50%, 70%, 90% och två gånger i absolut etanol; 5 min varje. Tillsätt 1 mL etanol att täcka proverna.
   Obs: När vävnaden är placerad i 90% etanol, de efterföljande stegen kan utföras vid rumstemperatur.
6. Inkubera proverna två gånger i propylenoxid för 10 min varje inkubation.
   FÖRSIKTIGHET: Propylenoxid är giftigt, använda den i ett dragskåp.
7. Ersätta propylenoxid av en 1:1 (v/v) blandning av epoxi harts och propylen oxid och odla i rumstemperatur över natten.
   Varning: Kådan är extremt giftigt flytande. Kådan är tillgänglig som en uppsättning av fyra komponenter (A, B, C och D).
   1. Epoxiharts, lägga till i en engångs bägare 54 g av harts (A), 44,5 g härdare (B), 2,5 g accelerator (C) och 10 g av flytmedel (D). Kombinera alla harts komponenter i dragskåp. Lagra kådan i alikvoter vid-20 ° C (för upp till 6 månader) eller vid-80 ° C (för flera år).
   2. Om du vill ignorera kådan, baka det vid 70 ° C under 24 h eftersom fast harts inte är giftigt. Kasta alla de föregående lösningarna i gruppen tungmetaller enligt lämpliga internationella förfaranden, eftersom lösningar kan innehålla spår av OsO_4.
8. Ersätt tidigare blandningen med 100% harts och inkubera proverna för 4 h.
9. Överföra slaktkroppar till plastformar som innehåller nya harts (ett kadaver i varje brunn av mögel). Använd en vass träpinne eller nål för att överföra och orientera slaktkroppar i brunnarna och lämna hartsen att polymerisera över natten i en Pasteur ugn på 70 ° C.
   Obs: För att säkerställa lämplig orientering av slaktkroppar för bakre trimning och snittning, slaktkroppar bör liggande på sin långsida, med den främre delen av slaktkroppen mycket nära kanten av brunnen.

2. trimning och snittning av block

1. Ta bort polymeriserat harts block från formarna. Använda rakblad att trimma bort kådan, bildar en trapetsoidform kring kadavret och ge lämplig orientering i mikrotomen. Starta snittningen alla slaktkroppar efter tvärgående suturen att jämförbara resultat.
   Obs: Avsnittet måste vara vinkelrät mot de DLM att trimma provet korrekt anteroposterior axel ( figur 3).

Figur 3 . Dorsoventral delar av harts-embedded vuxen thoraces av den internationellt dystrofi modell flugor. (A) var Intrimningen av provet inte korrekt eftersom avsnittet i den dorsala högra delen av bilden inte var helt övergripande till musklerna. Som en följd verkar av tre muskelbuntar på den övre högra sidan större än de vänstra sida. Detta misstag skulle leda till en överskattning av området muskel. (B) avsnitt från ett korrekt trimmade harts block. Skalstapeln: 200 µm.

1. Skär 1,5 µm tjocka sektioner med en ultramicrotome och överför avsnitten till vattendroppar över gelatinized bilder.
   1. Få avsnitten från mesothorax segmentet för alla prover att jämförbara resultat.
2. Placera glasen som innehåller avsnitten om en värmeblocket vid 70-80 ° C tills den H₂O avdunstar. Vid denna punkt, kan proverna observeras med OsO₄ kontrasten (figur 4A).

3. färgning IFM sektioner

1. Täcka avsnitten med tillräckligt toluidinblått blå för cirka 30 s på värmeblocket.
   1. Lös upp 1% av toluidin blå och 1% av borax i H₂O. toluidin blå lösning,
2. Skölj med H₂O och lämna bilderna på en varm tallrik för att avdunsta vattnet. Upprepa färgningen med toluidinblått blå om kontrasten måste förbättras (figur 4B).

Figur 4 . Dorsoventral delar av harts-embedded vuxen thoraces med olika kontrast infärgning. Båda panelerna visar bilder av DM1 modell flugor utfodrats med Abp1 som i figur 2D. (A) bilden av ett avsnitt med OsO₄ kontrasten. (B) avsnitt färgas med toluidinblått blå tillåter bättre visualisering av muskelbuntar. Skalstapeln: 200 µm.

4. Montera IFM sektioner

1. Torka glasen med värmeblocket tills den H₂O avdunstar.
2. Sätta 1 eller 2 droppar monteringsmedium på delar och Lägg på ett täckglas.
   Försiktighet: Genomföra detta steg i dragskåp eftersom monteringsmedium är giftigt.

5. förvärv av bilder och kvantifiering av muskel område

1. Ta bilder i låg förstoring så att hela uppsättningen av DLM muskler är i fokus. Vi använder normalt 10 X.
   1. För statistisk analys ta minst 5 följetong bilder per fly och analysera minst 5 flugor per experimentella gruppen.
2. Välj den bild som innehåller hela musklerna (figur 5A). Kontrollera axeln eller läggning av avsnittet och kassera proverna med olämpligt orientering, som skulle snedvrida resultaten (jämför siffrorna 3A / 3B att skilja mellan dåligt och väl orienterad sektioner, respektive).
3. Använda ImageJ programvara för att markera ett område (i pixlar) som innehåller endast DLM (figur 5A/5B). För jämförelse mellan olika experimentella grupper, skulle referensområdet att användas alltid vara i farten med de största musklerna. Alla bilder av de olika genotyperna att jämföra, välja ett område innehållande DLM av samma dimensioner till referensområdet (figur 5B).
4. Binarize bilderna med kommandot bild-J: Process/Binary/Make binära och radera de områden eller pixlar som inte motsvarar musklerna av intresse (figur 5 c).
   1. Ifall tingsliga svart fläckar på andra områden än muskel, ta bort dem med kommandot ritverktyg och Välj symbolen suddgummi.

Figur 5 . Bild analys procedur muskel område bestämning. (A) övergripande avsnitt av internationellt dystrofi typ 1 modell flyger bröstkorgen med en rektangel som innehåller DLM. (B) valda område med endast indirekt flyg musklerna och tarmen (*). (C) Binarized bild. Svarta områden motsvarar musklerna i intresse. Tarmen har raderats för en exakt kvantifiering av muskel område. Skalstapeln: 200 µm.

5. Kvantifiera andelen pixlar motsvarar muskelvävnad (svarta pixlar) av totalt med kommandot: Analysera/mätning och välj alternativet området bråk. Denna procentandel av området är en uppskattning av DLM muskel massa varje fluga.

Representative Results

Att kvantifiera huruvida överuttryck av MblC eller administrationen av Abp1 hade någon effekt i atrofisk fenotypen av internationellt dystrofi flyga modellen vi fokuserat på de DLM, som är en del av innovativa (figur 1). Vi fast beslutna att modellen flyger, som uttryckligt 250 icke-kodande CTG repetitioner hela muskulaturn drivs av promotorn Myosin heavy-chain (Mhc)-Gal4, hade en 50% reduktion av muskel område jämfört med styra flugor. Däremot Co uttryck för MblC och expanderade CTG repetitioner med samma drivrutin, undertryckta starkt sådan fenotyp och crossectional muskel område var 70% av kontroll (normal) flugor. Administrering av den Abp1 hexapeptid i nutritive media likaså undertryckt de atrofisk fenotyp, och modell flugor som hade tagit föreningen visade cirka 60% av normal muskel område (i stället för 50% som är typisk för DM1 flugor; Figur 2E). För kvantifiering av dessa prover använde vi sektioner som färgas med toluidinblått blå att förbättra kontrast (figurerna 4 och 5).

Vi noterar att under förfarandet kan ett antal tekniska glitches påtagligt störa slutliga kvantifiering. En vanlig är att harts block inte är korrekt trimmas, vilket kan misorient provet och leda till sneda snittning av DLM. Som en följd några DLM muskler kan se större på ena sidan jämfört med den kontralaterala en (se exempel figur 3), som introducerar ett betydande fel i sista kvantifiering. Ett annat misstag som kan uppstå är otillräcklig penetration av fixeringsvätskan i muskelvävnaden (figur 6), som ser sämre och deformerade omöjliggör korrekt kvantifiering av området muskel.

Discussion

Det har visats att Drosophila melanogaster är en användbar modell för att studera mänskliga neuromuskulära sjukdomar^7,10,11, inklusive internationellt dystrofier, som kännetecknas av uppkomsten av muskelatrofi. Det protokoll som presenteras här är ett användbart verktyg för att kvantifiera muskel degeneration orsakas av uppkomsten eller progression av en viss sjukdom i en flyga modell. Till exempel, är det också möjligt att följa och kvantifiera degeneration av muskelfibrer genom att utföra denna analys i flugor i olika åldrar.

Det finns kritiska steg i protokollet. Den tid som krävs att dissekera flugorna innan deras fixering skall minimeras för att undvika nedbrytning av vävnaden. För genomträngningen av den fästande lösningen i musklerna (figur 6) är det viktigt att ta bort huvud, vingar och ben av flugor att säkerställa tillgång av lösningar till inre av i farten. Det är viktigt att få övergripande avsnitt där musklerna i intresse är helt synlig. Binärisering av proverna för kvantifiering är viktigt så att de markerade pixlarna (svarta pixlar) motsvarar vävnaden i intresse och hela området av intresse är markerad.

Figur 6. Adult Drosophila thorax med otillräcklig penetration av fixeringsvätskan i musklerna (*), som orsakar nedbrytning och deformation av vävnad under bearbetningen av provet. Skalstapeln: 200 µm.

En av de reagens som används i detta protokoll är OsO₄, som bevarar de flesta strukturer mycket väl, särskilt på den cytologiska nivån, och samtidigt ger kontrast till bild⁵. En viktig nackdel med metoden är dock toxiciteten av OsO₄, som alltid måste användas i ett dragskåp och kräver säker hantering och kassering. Detta protokoll inte bara tillåter exakt kvantifiering av muskelmassa på grund av den fästande och inbäddning förfarande, det kan också användas för ett annat program till exempel elektronmikroskopi (EM) förberedelse. Det lider dock en inneboende begränsning eftersom de resulterande histologiska sektioner inte kan användas i efterföljande analyser, såsom immunohistokemi.

Slutligen, denna metod är också optimerad för att upptäcka små muskel område skillnader således möjliggör tillförlitlig identifiering av modifierare i genetiska eller kemiska skärmar^8,9. Ändå, eftersom ökad muskelmassa område inte innebär nödvändigtvis bättre muskelfunktion, tvärsnittsdata muskel område bestämning bör idealiskt korreleras med funktionella analyser såsom flyg-analyser¹².

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Image-J software	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/
Ultramicrotome	Leica	Leica UC6
Microscope	Leica	Leica MZ6	Bright field technique.
Razor blades	Electron Microscopy Sciences	71970	Several alternative providers exist.
Scissors	World Precision World	14003	Several alternative providers exist.
Embedding molds	Electron Microscopy Sciences	70900	Several alternative providers exist.
Glutaraldehyde	Fluka (Sigma)	49624	Toxic.
OsO4	Polyscience	0972A	Extremely toxic.
Propylene oxide	Sigma Aldrich	82320-250ML	Extremely toxic.
resin (Durcupan)	Sigma Aldrich	44611-44614	Carcinogenic when it is unpolymerized.
Toluidine blue	Panreac	251176	Toxic.
Mountant Medium (DPX)	Sigma Aldrich	44581	Dangerous.
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-500G	Harmful.
Na2HPO4	Panreac	122507	0.2 M dilution.
NaH2PO4	Panreac	121677	0.2 M dilution.
Borax	Panreac	3052	Toxic.