Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

אין ויוו מעקב של האדם נגזר שומן בתאי גזע Mesenchymal במודל דלקת מפרקים ניוונית של הברך עכברוש עם קרום Lipophilic פלורסנט לצבוע

Published: October 8, 2017 doi: 10.3791/56273
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 3, 4, 1,2
1Cellular Biomedicine Group, China, 2Cellular Biomedicine Group, California, 3Department of Orthopedics, Shanghai TCM-Integrated Hospital, 4Department of Orthopedics, Shanghai East Hospital, Tongji University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר דרך יעילה כדי לנטר את התא התמדה ואת biodistribution של האדם נגזר שומן בתאי גזע mesenchymal (haMSCs) על-ידי קרינה פלואורסצנטית מרחיקת אדום תיוג במודל חולדה דלקת מפרקים ניוונית (קואה) הברך באמצעות הזרקה תוך-מפרקיות (IA).

Abstract

על מנת לתמוך היישום הקליני של האדם נגזר שומן mesenchymal טיפול בתאי גזע (haMSC) עבור דלקת מפרקים ניוונית בברך (קואה), בדקנו את היעילות של תאים התמדה ואת biodistribution של haMSCs במודלים של בעלי חיים. להדגים שיטה לתייג את קרום התא של haMSCs עם lipophilic הפלורסנט. לאחר מכן, הזרקה תוך-מפרקיות של התאים עם תוויות בחולדות עם קואה בניתוח המושרה נוטרו באופן דינאמי על-ידי יישום ויוו מערכת הדמיה. אנחנו נוקטים את lipophilic carbocyanines עשה (DilC18 (5)), אנלוגי דיל (dialkylcarbocyanines) פלורסנט מרחיקת אדום, אשר מנוצל לייזר אדום כדי להימנע עירור של autofluorescence ירוק טבעי מן הרקמות הסובבות. יתר על כן, האדום-העביר ספקטרום הפליטה של מותר לדימות רקמות עמוק בבעלי חיים וההליך תיוג גרם ללא אפקטים ציטוטוקסיות או פגיעה תפקודית haMSCs. גישה זו הוכח להיות שיטה מעקב יעיל אחר עבור haMSCs במודל קואה חולדה. היישום של שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לקבוע את דרך ניהול אופטימלי ואת המינון של MSCs ממקורות אחרים במחקרים קליניים.

Introduction

דלקת מפרקים ניוונית בברך (קואה) היא הפרעה ניוונית הנובעות אובדן סחוס במפרק ודלקת מתקדמת, אשר הפך מרכזי מחלה כרונית אצל הקשישים ברחבי העולם1. עם זאת, טיפולים שוטפים באמצעות תרופות אנטי דלקתיות, תוספי הפיזי ניתוחים רק עשוי לספק הקלה זמנית לכאב סימפטומטי2.

האדם הנגזרות שומן בתאי גזע mesenchymal (haMSCs) הפכו להיות תרופה משובי מבטיח עבור דלקת מפרקים ניוונית בברך, בשל התמיינות multipotent שלהם פוטנציאל התחדשות הסחוס לבין מאפיינים immunomodulatory3, 4. לעומת מסלולים תרופתי לחקור מנגנונים של פעולה ויוו, מעקב אחר haMSCs בשידור חי במודלים חייתיים קואה קטן הוא מאלף כיום להקים את הרציונל ואת הכדאיות של טיפול haMSC לקראת יישום קליני. בדיקה פרה, meniscectomy המדיאלי (מ מ) שיערער את העומס המכני של המפרק לזירוז קואה בחולדות, המספקת מודל ריאלי יחסית עקבית הפארמצבטית5. תחילתה של KOA שנגזרות מ מ הוא מוקדם יותר חיתוך צולבת קדמית לבד או בשילוב עם meniscectomy המדיאלי חלקי6. לכן, יחסי גומלין לטווח ארוך haMSCs מוזרק עם microenvironment פתולוגית של KOA הם לעיתים קרובות העריכו בחולדות שנגזרות מ מ7,8.

למרות יעילות טיפולית של haMSCs כבר ידע רלוונטי שדווח בהרחבה על התמדתו ויוו של haMSCs מושתל באמצעות הזרקה תוך-מפרקיות (IA) הוא נדיר9,10. לפיכך, שונים הסלולר תיוג פותחו שיטות, כולל פראפין11לוציפראז12, תרביות תאים13 חלבון פלואורסצנטי ירוק, תחמוצת ברזל תיוג עבור דימות תהודה מגנטית (MRI)14 ,15,8,צבעי פלורסנט תא רבים16. אין ויוו הדמיה לא פולשנית בהשוואה היסטולוגיה מהגידולים ניתוחים, מעסיקה התקנים אופטיים כדי לזהות את התפלגות בזמן אמת ואת הדינמיקה של תאים עם תוויות עם אותות פלואורסצנט10,17. עבור הדמיה תפקודית תא חי, תיוג פלורסנט cytocompatible היא טכניקה מתוחכמת רדיואקטיבי ללא מעקב כדי לחשוף את פעילות הסלולר לאחר השתלת תא גזע18. יתר על כן, ססגוניות צבעי פלורסנט lipophilic בעלי יתרונות אמינו ונבדקים צבע הידרופילית או חלבונים פלורסנט, כולל שלהם תא משופרת חדירות פלורסצנטיות משופרת קוונטית התשואות19.

לפיכך, הפרוטוקולים כלולים כאן לנצל אדום לייזר כדי לעורר תאים המסומנת lipophilic carbocyanines עשה (DilC18(5)), וזו מרחיקת אדום פלואורסצנטי דיל (dialkylcarbocyanines) אנלוגי20. אדום-העביר עירור, פליטת הספקטרום של ימנע התערבות autofluorescent ומאפשר הדמיה על פני תקופה ארוכה של זמן חיים8רקמות עמוק. שיטה זו של מעקב אחר תאים ויוו המסומנת האם חוקי עבור ניטור המושתלים תאי גזע, כגון haMSCs, במודלים של בעלי חיים, שהוא חיוני להבין ולשפר את הטיפול משובי הנוכחי של תאי גזע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הליכים הכוללים נושאים בעלי חיים היו אושרה על ידי בעלי חיים מוסדיים מקומיים אכפת ועדת האתיקה, במאמץ לצמצם את סבלם של בעלי החיים. פרוטוקול הבאים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) על אנשים התשיעית שנגחאי ’ s בבית החולים המסונף לקבוצת שנחאי ג'יאוטונג של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת עם הפרוטוקול מספר [2017] 063.

1-הקמת מודל דלקת מפרקים ניוונית בברך עכברוש Surgically-Induced

  1. עבור הליך כירורגי, שימוש בשבוע 8-12 בן זכר חולדות ספראג Dawley (SD) עם משקל הגוף בין 250 עד 300 ג'
  2. עזים ומתנגד החיות עם tiletamine 40 מ"ג/ק"ג, zolazepam 40 מ"ג/ק"ג דרך זריקה תוך שרירית.
  3. למקם את החיה במיקום הלטראלי השמאלי על הבמה מחוממת. לגלח את ברך ימין ביסודיות עם סכין גילוח. לחטא את האזור הכירורגי עם 10% providone-יודיפלור תמיסה ואחריו 70% אתנול, חזור עוד פעמיים, ולאחר מכן צבעו 10% providone-יודיפלור תמיסה, לכסות את האזור ניתוחי עם כרית כירורגי.
  4. באמצעות אזמל כירורגי, עושים חתך 2 ס מ רוחבית לאורך הגיד ברך כדי לחשוף את jointcapsules.
  5. להשתמש באזמל כירורגי transect המדיאלי משני רצועה. לשקף את מניסקוס לכיוון עצם הירך.
  6. לטפטף פתרון סטרילי נתרן כלוריד 0.9% על פני השטח של הסחוס במפרק במהלך המבצע כדי למנוע את הסחוס מתייבשת.
  7. לתפוס את המניסקוס עם מלקחיים, לחתוך מניסקוס בנקודה הצרה ביותר שלה מן הקובץ המצורף הטיביאלי עם איזמל ( איור 1 א'). להימנע ופצעו את הסחוס.
  8. לסגור את הקפסולה משותפת בתפר שנספג 4-0-
  9. לפקח העכברושים כירורגי עד שהם ישובו להכרה.
  10. להזריק גנטמיצין 20 מ"ג/ק"ג כדי למנוע זיהום, 0.05 מ"ג/ק"ג. הבופרנורפין דרך נתיב שרירית להקל על כאבים לאחר הניתוח.
  11. לשמור על העכברושים מתקן בעלי טמפרטורה מבוקרת תחת מחזור/כהה 12 h 3-8 שבועות לתחילת קואה. חיות ימשיכו לקבל את התרופות, כולל אך לא מוגבל הבופרנורפין (0.05 מ"ג/ק"ג, i.m.) ו גנטמיצין (20 מ"ג/ק"ג, i.m.), כאב המומלצת. אם.

2. היסטולוגיה הערכה של עכברוש קואה דגם

  1. להקריב החולדות עם שאיפת 2 CO מוגזמת (הוספה קצב המילוי של-30% של אמצעי האחסון קאמרית לדקה עם פחמן דו-חמצני לאוויר הקיים בבית הבליעה של לגרום חוסר הכרה בבעלי חיים בתוך 2-3 דק CO2 לשמור על זרימה למשך תקופה מינימלית של 1 דקות לאחר נשימה מפסיק.) -ציינו נקודות זמן (נציג התוצאות יוצגו ב 8 שבועות האינדוקציה קואה ועד 3 8 שבועות) לאחר ניתוח של.
  2. לנתח את העור, השרירים סביב המפרקים בברך ולנתק את המפרקים בברך עם אזמל.
  3. לתקן את המפרקים בברך ב 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 3 ימים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, decalcify את הדגימות ב 20% חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) על 4 שבועות ב 4 ° C ולאחר שנה של EDTA כל 3 ימים.
    התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל, ללבוש הולם ציוד מגן אישי (PPE), כגון כפפות משקפיים.
  4. מייבשים את הדגימות באמצעות מעבד רקמות אוטומטית. להגדיר את התפריט כדי להתחיל מחזור סומק כדלקמן: 70% אתנול עבור 1 h; אז 80% אתנול וביו -אתנול 95% עבור 1 h בהתאמה; ואחריו 2 מחזורים של אתנול 100% עבור 1 h; לאחר מכן, קסילן פעמיים עבור 1 h בכל פעם, שעוות פרפין 3 פעמים ב 58 ° C עבור 1 h בכל פעם.
    התראה: קסילן רעיל, כך שמומלץ PPE המתאים, כגון כפפות משקפיים.
    הערה: לחלופין, להשתמש Coplin צנצנות התייבשות ידנית עם הסידור זהה כמו המעבד רקמות אוטומטי.
  5. למקם את האספקט המדיאלי של הפנים פרקים שלמים למטה, להטביע אותו לתוך הרחוב פרפין ברקמות מוטבע לתוך המרכז.
    הערה: לחלופין, להשתמש מלקחיים כדי להטביע את הדגימות לתוך הרחוב פרפין ידנית.
  6. מתחילים לחתוך 5 מיקרומטר הסאגיטלי קטעים מן השוליים המדיאלי של המפרק עבור 30 מיקרומטר מרווחים עם 2 סעיפים טורי על-ידי מיקרוטום רוטרי.
  7. הר מקטעים בשקופיות זכוכית, deparaffinize השקופיות קסילן. בין הסעיפים טורי 2, להכתים שקופית אחת עם Hematoxylin & אאוזין (H & E) צביעת: 0.1% Hematoxylin למשך 15 דקות, 1% פתרון חומצה אצטית 10 s ו- 0.5% אאוזין למשך 10 דקות. כתם על השקופית אחרים עם Safranin O/מהיר ירוק מכתים: 0.1% Hematoxylin למשך 15 דקות, 0.02% מהר ירוק במשך 3 דקות, 1% פתרון חומצה אצטית 10 s ו- 0.1% Safranin O עבור מינימלית 3
    התראה: קסילן רעיל, ללבוש PPE המתאים, כגון כפפות, משקפיים.
  8. להבקיע את השקופיות מוכתם בעזרת מערכת הערכה Histopathology הבינלאומי החברה לחקר אוסטיאוארתריטיס (OARSI) חולדות 6.

3. Labelling של האדם גזע Mesenchymal עם צבעי פלורסנט עשה

  1. להכין האם הפתרון תיוג תא ב 100% אתנול-ריכוז של 1 מ מ. להגן על הפתרון תיוג תא האור ואחסן אותו בטמפרטורת החדר במשך 6 חודשים.
  2. לגדול haMSCs תא סטנדרטי נהלי התרבות ב- Dulbecco ' s ששינה הנשר ' s בינוני (DMEM) בתוספת 1% פניצילין, סטרפטומיצין, 10% עגל עוברית סרום (FCS) בצלחת פטרי 10 ס מ.
  3. ניתוק haMSCs עם טריפסין 0.25% 2 מ עם זרימה לפני כ 80% EDTA 1 מ מ.
  4. לנטרל טריפסין 4 מ"ל תרבות בינונית, לסובב את התאים ב g x 800 למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. להשעות את התאים על צפיפות של עונה 1 פרק 10 6 תאים למ"ל במדיום תרבות ללא סרום מ ל.
  6. תווית בתאים על-ידי הוספת 50 µL האם תא-תיוג פתרון מ ל ללא סרום תרבות בינוני ב 37 ° C עבור 50 דק
  7. לסובב את התאים שכותרתו ב g x 800 במשך 3 דקות
  8. לשטוף את התאים שניכם יותר מדי פעמים עם 5 מ"ל פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS) ב g 800 x למשך 3 דקות כל אחד.
  9. לבדוק את haMSCs עם תוויות ברורות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ערכת מסנן Cy5.
  10. לספור את התאים עם trypan blue מכתים ולקבל 2.5 x 10 6 התאים קיימא ב- PBS 100 µL להזרקה.

4. אין ויוו פלורסנט הדמיה המסלול haMSCs

  1. 8 שבועות לאחר הניתוח (שלב 1), עזים ומתנגד העכברושים קואה בזריקה תוך שרירית של tiletamine 25 מ"ג/ק"ג, 25 מ"ג/ק"ג zolazepam.
  2. לגלח את ברך ימין ביסודיות עם סכין גילוח כדי לחשוף את האזור המשותף. לחטא את האזור משותפת עם אתנול 70%-
  3. באמצעות מחט מזרק 26 גרם, להזריק 2.5 x 10 6 שכותרתו תאים הושעו ב- PBS 100 µL במרכז של אזור המשולש הנוצרת על-ידי הצד המדיאלי של רצועה ברך, המפרקתי הנמוך המדיאלי של הירך (בעצם הטיביאלי המדיאלי איור 1B).
  4. פתח את תוכנת הדמיה, לאתחל ביולומינסנציה ויוו מערכת הדמיה-
  5. בו פרקדן עכברים עמדה עמדה על הבמה המרכזית של מערכת ההדמייה וסגור את הדלת של התא.
  6. לבדוק " פלורסנט " תיבת סימון, בחר מסנן פלורסנט סטים של 640 ננומטר על עירור, 680 ננומטר על פליטה ( איור 2 א).
  7. בחר תצוגה של שדה כדי להגדיר ד פיקסל binning לבינונית (8), F/להפסיק כדי 2 וחשיפה זמן באופן אוטומטי. לשמור על האופטימלית זמן החשיפה עקבי כדי להשיג תוצאות דומות על פני המחקר כולו ( איור 2 א).
  8. להסיר את החיה הבמה ואת הצג ההתאוששות מן ההרדמה.
    הערה: המקום חיה על רכיב pad חימום מכוסה עם 2-3 שכבות של toweling.
  9. בחר את היחידות של קורנים יעילות מדידות קרינה פלואורסצנטית ( איור 2B). בחר אזורים מעניינים (ROI) לניתוח ולכמת אותות פלואורסצנט כל תמונה ( איור 2C).
  10. חזור על הפעולות ויוו הדמיה עבור כל עכברוש ברצף ללמוד haMSCs השמירה האורך בכלא.
    הערה: אנו מציעים הדמיה החיות ' אותות פלואורסצנט על ידי מערכת הדמיה ויוו פעם יום שני בשבוע הראשון לאחר ההזרקה, פעם אחת בכל שבוע עד אין אפשרות לזהות את האות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בתערובות לזירוז דגם קואה, מ מ בוצעה ב המפרק ברך ימין של חולדות SD (איור 3). 8 שבועות לאחר הניתוח, חולדות הוקרבו, הסעיפים טורי של המפרקים בברך הוערכו עם שתי H & E ו- Safranin O/מהיר ירוק מכתים (איור 4). עבור H & E מכתים, פני השטח של הסחוס במפרק הציג גבולות גסים בברכיים ניתוח מאשר המפרק נורמלי בלי ניתוח. עבור Safranin-O/Fast ירוק מכתים, אנחנו נצפתה ירידה פרוטאוגליקן (צביעת אדום) והגדילה fibrillated קולגן (צביעת ירוק) בניתוח משותף לעומת אחד נורמלי, אשר ציינו את ההתקדמות של פנוטיפים קואה ניוונית המושרה על ידי ניתוח. באופן דומה את ההתקדמות של KOA אנושי, חולדות הוקרבו ב 3 שבועות, 6 שבועות, ו- 8 שבועות לאחר מ"מ עד להעריך פתוגנזה, לקבוע את הזמן של התערבויות טיפוליות.

הנקרא haMSCs היה דמיינו במודל חולדה קואה ידי אופטי של ויוו מערכת הדמיה. h 1 לאחר תיוג, תוויות haMSCs הציג סביב צורות במבחנה. היעילות תיוג הגיעו כ- 95%. לאחר 24 שעות, תרבותי עשה haMSCs שכותרתו הציגו צורות ציר זמן, המציין עשה לא לשנות את היכולת הדבקות של haMSCs במבחנה (איור 5). 8 שבועות לאחר הניתוח, 2.5 x 106 התווית על-ידי haMSCs היו מוזרק המפרקים עם קואה. כאן, הנקרא haMSCs נצפו בכלא המקומי מיום 0 (8 שבועות לאחר הניתוח) עד היום 70 שלאחר ההזרקה (18 שבועות אחרי הניתוח) על-ידי שימוש של ויוו הדמיה מערכת (איור 6).

Figure 1
איור 1: סכימטי דימומים עבור מ מ ניתוח הזרקת האזור למשלוח תא. (א) תרשים סכמטי זה מתאר את האזור הכירורגי, אשר מסומן בצבע כחול. (B) תרשים סכמטי זה מציין בתוך אדום חגו באזור ההזרקה. ראשי תיבות של הגדרות הן כדלקמן: מ מ, מדיאלי; MCL, רצועה המדיאלי משני; LM, מניסקוס לרוחב; LCL, רצועה לרוחב בטחונות; PL, רצועה ברך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מסך יריות של תוכנת הדמיה ויוו. (א) הגדרות מפתח של פרמטרים עבור ייבוא תמונות פלורסנט מודגשים עם ריבועים אדומים. (B) יעילות זוהרת נבחר כיחידת עבור מדידת קרינה פלואורסצנטית. (ג) ב- הכלי הצבעים, אזורים מעניינים (ROI) מוקפים בעיגול למדידות קרינה פלואורסצנטית יעילות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ההליכים של KOA בניתוח המושרה. (א) החשיפה של חלל המפרק הברך. (B) המבנה הפנימי של הברך, עם חץ שחור המציינת את המניסקוס. (ג) גזור מדיאלי. (ד) חלל המפרק ואת העור סגורים.

Figure 4
איור 4: נציג תמונות היסטולוגית של המפרקים בברך וניתוח סטטיסטי ניקוד OARSI של KOA. (א) 8 שבועות לכתוב מ מ ניתוח אצל חולדות, קטעים טורי של המפרקים בברך הוערכו עם H & E ו- Safranin O/מהיר ירוק מכתים. H & E מכתים הראה עובי הסחוס בברך הניתוח צומצם. Safranin O/מהיר ירוק מכתים הראה ירידה פרוטאוגליקן (צביעת אדום) והגדילה קולגן fibrillated (צביעת ירוק) בברך בניתוח לעומת הברך נורמלי. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) ניתוח סטטיסטי על הציון של דלקת מפרקים ניוונית של המפרקים נורמלי והמפרקים קואה (n = 3). הנתונים מבוטא mean±SEM. * מציין p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: מורפולוגיה של האם התווית על-ידי haMSCs. שדה בהיר, ותמונות פלורסנט הממוזג של haMSCs ב h 1 לאחר תיוג מוצגים בחלונית העליונה. שדה בהיר, fluorescentand התמזגו תמונות של haMSCs at24 h לאחר תיוג מוצגים בחלונית התחתונה. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: In vivo הדמיה של האם התווית על-ידי haMSCs. לאחר הזרקה של 2.5 x 106 התווית על-ידי haMSCs, מוצגים להחליפן בתמונות של KOA חולדות. האם haMSCs עם תוויות ברורות אותרו עד 9 שבועות באופן מקומי במפרקים של KOA חולדות. איור זה שוחזר מהפרסום של Li מ' ואח8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תקני בטיחות ולימודים biodistribution של טיפול בתאי גזע נחוצים בדחיפות לפני שנוכל להביא משובי בתאי גזע לטיפול קואה מהספסל אל המיטה. עם זאת, הסביבה פתולוגי של המחלה ממלא תפקיד חשוב התמדה ו biodistribution של המושתלים haMSCs10. לאחרונה, הקבוצה שלנו הוכיח כי הזרקה תוך-מפרקיות של haMSCs שהתמידו עוד בסביבה קואה פתולוגיים מאשר זריקות תחת תנאים נורמליים8. זה אפשרי כי microenvironment ואת ניוונית דלקתית יכול לגייס את גזע mesenchymal לתיקון, לאחר מכן טובה השמירה של1,haMSCs מוזרק21. יתר על כן, פרופיל הבטיחות והיעילות של haMSCs עלול להיות מושפע העיתוי של משלוח תא בנוגע לחומרת קואה, כך אופטימיזציה של ההתקדמות של KOA בחיות מעבדה תספק נתונים יקרי ערך לתמיכה בניסויים קליניים. עם המטרה של דמוי קלה עד מתונה בחומרת קואה אנושי, חולדות שנגזרות מ מ מותר לפתח קואה ועד 3 8 שבועות. במחקר זה, שינוי מורפולוגי של הסחוס הוערכה על ידי histopathological הבקיע 8 שבועות לאחר הניתוח, אשר מציע מודל ריאלי יחסית עם מידה מתונה של KOA כדי לחקור את היעילות והבטיחות של haMSCs8. להדגים כאן שיטה פשוטה האפשריים כדי haMSCs תווית עם ממברנה lipophilic פלורסנט מרחיקת אדום צבע להערכת היעילות קליניים לטווח ארוך.

החסרונות של שיטה זו הם כי הרקמה שבעורך צריכים להיות. ליד העור, כמות משמעותית של haMSCs עם תוויות ברורות נדרשים עבור רכישת אות מספיק בשל הירידה בתשואות קוונטית צנוע של האם. למרות ויוו הדמיה מערכת אופטית מאפשר לימודים האורך לא פולשנית של haMSCs biodistribution ב קואה מודלים, מגמות במספר התאים, מיקום רק מבחינים באופן כללי. הניתוח של גורל תאי גזע, התפשטות תא מסוים ובידול, יטופלו על ידי ניצול גם גורל מיפוי והדמיה מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה.

כיום, מגוון רחב של טכניקות תוויות זמינות למעקב ויוו תאי הגזע, כולל תוויות רדיואקטיבי, חלקיקים נגיפיים התמרה חושית של הכתב גנים22,23,24. עם זאת, תיוג רדיואקטיבי וכן ויראלי התמרה חושית של תאי גזע עלולים להפריע המאפיינים הגנטי של תאים, אשר לאחר מכן עלול להשפיע על גזע תא התפשטות והישרדות ויוו16. יתר על כן, מעקב תאי גזע באמצעות MRI על-ידי ספיגת של חלקיקים כמו סוכן חוזה מצריך שיפור רזולוציה מרחבית באמצעות שדה מגנטי חזק, אשר עלול להעלות חששות לגבי הרגישות של טכניקה זו25. תא פלורסנט צבענים, כגון PKH26, ס מ- DiI ו- CFSE שהפגינו בדרגות שונות של cytotoxicity, מציעים משך מוגבל יחסית (עד 4 שבועות) של תיוג רקמת שומן נגזר תאים15. לעומת זאת, תערוכות פלורסצנטיות חלש בפתרונות מימית. ברגע משולב עם קרום השומנים, מפזרת בצורה אחידה בתוך קרום התא, זריחה מרחיקת אדום אקספרס יציב19. התאים קיימא תוויות לא משפיעים על ההפצה שלהם, לתפקד18. חשוב יותר, הצבעים לא להעביר תאים עם תוויות תאים ללא תווית אלא אם כן יש האינטראקציה ממברנה ישיר בין התאים האלה26. עירור מרחיקת אדום ואת ספקטרום הפליטה של מונע הפרעות autofluorescent הרקמות הסובבות ומספק לדימות רקמות עמוק בבעלי חיים. הפעל תכונות אלה עשה תיוג כמו שיטת מעקב לטווח ארוך אידיאלי כדי לחקור את גורלו של מושתל haMSCs intra-articularly. לכן, הראו אמין מתודולוגיה לעקוב האם haMSCs עם תוויות ברורות על פני תקופה של 63 ימים ב- מודל עכברוש8.

בתוך הפרוטוקול עבור haMSCs עשה את התווית על-ידי מעקב במודל חולדה קואה, השלבים הקריטיים כדי להשיג תוצאות ריאלי ואמין הם כדי לוודא: 1) מניסקוס לכיוון עצם הירך לחלוטין לחתוך בכל מודל חולדה על עקבי התחלתה של קואה, 2) יש יחס מיטבי של 10 μL לצבוע נגד 10 תאים haMSC6 עבור דקה 50 מכתים, 3) הסף זיהוי ויוו עבור haMSCs שכותרתו האם הוא בין 104 ו-5 10 תאים, ואילו מעל 106 תאים מומלץ ב פרוטוקול זה.

ברגע בטכניקה זו הוא שולט, היישום של שיטה זו יכול לשמש כדי לקבוע את המסלול האופטימלי או מינון עבור ניהול של MSCs במחקרים קליניים. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות על הערכה טרום קליניים לטווח ארוך של ויוו biodistribution של גזע mesenchymal (MSCs) ממקורות אחרים, כולל דם במח העצם ואת חבל הטבור. לאור פוטנציאליים לגורל תאי גזע לתוך מודלים בעלי חיים קואה, אימונולוגיה חקר haMSCs xenogeneic, כגון Ki67 עבור הפצת8 ו קולגן II על הסחוס במפרק בידול27, יכול להיות משולב עם זה טכניקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מנג Li, מינג Hao, ון וונג נמצאים העובדים הנוכחי ומחזיקים אופציות מקבוצת וההתערבות הסלולר (סימול: CBMG). המחברים אחרים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

המחקר הנוכחי נתמכה על ידי שנגחאי חדשנות מימון (1402H 294300) בחסות המדע, הטכנולוגיה עמלה של שנגחאי העירייה (CN) כדי ד ר ון וונג. ברצוננו להודות ד ר גואנג-דונג ג'ואו (הלאומי רקמות הנדסה מרכז של סין) שלו סיוע וייעוץ טכני מדעי עבור כתב יד זה. אנחנו רוצה גם להודות מר Huitang שיה (החולים שנגחאי התשיעית לאנשים בבית) על עזרתו רווחת בעלי חיים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Matrx VMR animal anesthesia system Midmark VIP3000
4-0 suture Shanghai Jinhuan KC439
Razor Pritech LD-9987
Gentamicin Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. None
0.9% Sodium chloride solution Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. H43020455
Penicillin Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. None
Buprenorphine Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. None
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 16005 Dilute to final concentration of 10% in PBS
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Dilute to final concentration of 20% in PBS
0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s Sigma-Aldrich MHS16
0.5% Eosin Y solution, alcoholic Sigma-Aldrich HT110116
Safranin O Sigma-Aldrich S8884
Fast Green Sigma-Aldrich F7258
Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor Thermo Fisher A78400006
Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center Thermo Fisher B64100010
Fully Automated Rotary Microtome Leica RM2255
DiD Molecular Probes, Life
Technologies		 V-22887
D-MEM High Glucose Sigma-Aldrich D5648
PBS GIBCO, Life Technologies 14190-144
0.25% Trypsin-EDTA Invitrogen 25200-114
10 cm Petri Dish Corning V118877
Centrifuge Beckman Optima MAX-TL
Fluorescent microscope Olympus BX53
0.4% Trypan Blue solution Sigma-Aldrich 93595
Titetamme Virbac (Zoletil 50) 1000000188
Zolazepam Virbac (Zoletil 50) 1000000188
Sterile hyposermic syringe for single use 26G Shanghai Misawa Medical Industry None
IVIS Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer 124262
Living Imaging 4.0 software PerkinElmer None

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  2. Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
  3. Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
  4. Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27 (2016).
  5. Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
  6. Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, Suppl 3. S24-S34 (2010).
  7. Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
  8. Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160 (2016).
  9. Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
  10. Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22 (2013).
  11. Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
  12. Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
  13. Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
  14. Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
  15. Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
  16. Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
  17. Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
  18. Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50 (2015).
  19. Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005 (2009).
  20. Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
  21. Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
  22. Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
  23. Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
  24. Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
  25. Jasmin,, et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4 (2011).
  26. Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
  27. Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 128 Mesenchymal גזע תאים Biodistribution הזרקה תוך-מפרקיות צבעי זריחה In vivo הדמיה דלקת מפרקים ניוונית בברך meniscectomy המדיאלי
<em>אין ויוו</em> מעקב של האדם נגזר שומן בתאי גזע Mesenchymal במודל דלקת מפרקים ניוונית של הברך עכברוש עם קרום Lipophilic פלורסנט לצבוע
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, M., Hao, M., Jiang, D., Chen,… More

Li, M., Hao, M., Jiang, D., Chen, Y., Wang, W. In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye. J. Vis. Exp. (128), e56273, doi:10.3791/56273 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter