Summary
Bulk gen uttryck mätningar molnet enskild cell skillnader i heterogena cellpopulationer. Här beskriver vi ett protokoll för hur encelliga gen uttryck analys och index sortering av flourescens aktiverad Cell sortering (FACS) kan kombineras för att avgränsa heterogenitet och immunophenotypically karakterisera molekylärt distinkta cellpopulationer.
Abstract
Immunophenotypic karakterisering och molekylär analys har länge använts för att beskriva heterogenitet och definiera olika cellpopulationer. FACS är till sin natur en encellig analysen, men före molekylär analys, målceller isoleras ofta prospektivt i bulk, därmed förlora encelliga upplösning. Enskild cell gene expression analys ger ett sätt att förstå molekylära skillnader mellan enskilda celler i heterogena cellpopulationer. I cell massanalys resulterar en överrepresentation av en distinkt celltyp i fördomar och ocklusioner av signaler från sällsynta celler med biologisk betydelse. Genom att utnyttja FACS index sortering kopplat till enskild cell gene expression analys, populationer kan undersökas utan förlust av encelliga upplösning medan celler med mellanliggande cell surface markör uttryck fångas också, möjliggör utvärdering av betydelsen av kontinuerlig yta markör uttryck. Här, vi beskriver en strategi som kombinerar encelliga omvänd Transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) och FACS index sortering för att samtidigt karaktärisera molekylära och immunophenotypic heterogenitet inom cellpopulationer.
Till skillnad från encelliga RNA-sekvenseringsmetoder tillåter användning av qPCR med specifik amplifiering robust mätningar av låg-överflöd avskrifter med färre avbrott, medan det inte försvåras av frågor som rör cell till cell variationer i Läs djup. Dessutom möjliggör av direkt index-sortering singel-celler i Lys buffert denna metod, cDNA syntes och specifika mål före förstärkning ska utföras i ett steg samt när det gäller sambandet mellan därefter härledda molekylära signaturer med cellytan markör-uttryck. Den beskrivna metoden har utvecklats för att utreda hematopoetiska singel-celler, men har även använts framgångsrikt på andra celltyper.
Sammanfattningsvis kan det tillvägagångssätt som beskrivs häri för känsliga mätning av mRNA uttryck för en panel av förvalda gener med möjlighet att utveckla protokoll för efterföljande blivande isolering av molekylärt skilda subpopulationer.
Introduction
Varje enskild blodkroppar tros uppehålla sig i en cellulär hierarki, där stamceller bildar apexen ovanpå en rad allt mer engagerad mellanliggande stamfäder som så småningom obotligt differentieras till de slutliga effektor celler bära särskilda biologiska funktioner1. Mycket av kunskapen om hur stamceller är organiserade har genererats i det hematopoetiska systemet, mycket på grund av förmågan att prospektivt isolera distinkta hematopoetiska populationer höganrikat för stamceller eller olika föräldraparets2 av FACS sortering. Detta har möjliggjort för många av dessa populationer ska analyseras funktionellt eller molekylärt, huvudsakligen genom genuttryck profilering3,4. Men när analysera genuttryck av bulk populationer individuella skillnader mellan celler är i genomsnitt och förlorade5. Således, oförmåga att upptäcka cell till cell variationer inom heterogen cell fraktioner kan blanda ihop vår förståelse av viktiga biologiska processer om små grupper av celler svarar för den antagna biologiska funktionen av att befolkningen6, 7. Omvänt, utredning av gen uttryck signaturer på encelliga upplösning erbjuda en möjlighet att avgränsa heterogenitet och kringgå överskuggande influenser från överrepresenterade grupper av celler8.
Hittills har det utvecklats många protokoll för enskild cell gene expression analys; med varje metod har sina egna varningar. Den tidigaste metoden var RNA fluorescerande i situ hybridisering (RNA-fisk), som mäter ett begränsat antal avskrifter i taget men är unik genom att den tillåter för utredning av RNA lokalisering9,11. Tidiga metoder med PCR och qPCR för att upptäcka en enda eller mycket få utskrifter var också utvecklat12. Dessa har dock nyligen ersatts av mikrofluidik-baserade metoder som kan samtidigt analysera uttrycket av hundratals avskrifter per cell i hundratals celler genom qPCR och således möjliggör högdimensionella heterogenitet analys med förutbestämd gen paneler10,13. Nyligen RNA-sekvensering-baserade tekniker har blivit allmänt används för enstaka cell analys, eftersom dessa teoretiskt kan mäta det hela transkriptom i en cell och därmed lägger en förberedande dimension till heterogenitet analys10, 14. multiplexöverförde qPCR analys och encelliga RNA-sekvensering har olika funktioner, motiven för att använda någon av metoderna beror alltså på den frågan samt antalet celler i målpopulationen. Den stora dataflöden och låg kostnad per cell tillsammans med opartisk, undersökande egenskaper hos encelliga RNA-sekvensering är önskvärda vid okänd cell eller stora populationer utforskas. Encelliga RNA-sekvensering är dock också vinklad mot sekvensering hög riklig avskrifter oftare medan avskrifter med låg överflöd är benägna att avhopp. Detta kan leda till betydligt komplexa data som sätter hög-krav på bioinformatiska analyser att avslöja viktiga molekylära signaler som ofta subtila eller dolda i teknisk buller15. Således för välkarakteriserad vävnader, encelliga qPCR analys använder förutbestämda primer paneler valts för funktionellt viktiga gener eller molekylära markörer kan fungera som en känslig, okomplicerad metod att bestämma heterogenitet en befolkningen. Det bör dock noteras som jämfört till encelliga RNA-seq, kostnaden per cell är generellt högre för encelliga qPCR metoder. Här, beskriver vi en strategi som kombinerar encelliga RTqPCR (modifierad från Teles J. et al. ( 16), FACS index sortering17 och bioinformatik analys18 för att samtidigt karaktärisera molekylära och immunophenotypic heterogenitet inom populationer.
I denna strategi, cell befolkningen av intresse är målat och singel-celler är sorterade efter FACS direkt i lyseringsbuffert i 96 brunnar PCR-plattor. Samtidigt, registreras uttrycksnivåerna för ytterligare en uppsättning cellytan markörer för varje enskild cell under FACS-sortering, en metod som kallas för index-sortering. Lyserat cell materialet förstärks efterhand och genuttrycket av en vald uppsättning gener analyseras med RT-qPCR, använder en mikroflödessystem plattform. Denna strategi möjliggör molekylär analys av sorterade encelliga liksom samtidiga karakterisering av varje enskild cell cellytan markör uttryck. Genom att mappa direkt molekylärt distinkta undergrupper av celler till uttrycket av indexerade sorterade markörer, kan subpopulationsna kopplas till en särskild immunophenotype som kan användas för deras blivande isolering. Metoden beskrivs steg för steg i figur 1. En förutbestämd gen-panel ytterligare bidrar till en högre upplösning av det riktade genuttrycket, eftersom det kringgår mätning av irrelevanta riklig gener som kan annars täppa subtila gen uttryck signaler. Dessutom tillåter den specifik amplifiering, ett steg omvänd Transkription och förstärkning för robust mätning av låga uttryckt avskrifter, som transkriptionsfaktorer eller icke-poly-adenylated RNAs. Ännu viktigare, tillåta qPCR metoder för mätning av mRNA från fusionsproteiner, som är viktigt när du undersöker vissa maligna sjukdomar19. Slutligen, fokuserad antalet gener undersökas, låg i förtid, och begränsade tekniska skillnader mellan cellerna gör denna metod analyseras enkelt jämfört med högre dimensionell metoder, såsom encelliga RNA-följande punkter Genom att följa protokollet, kan ett hela experiment utföras, från sortering celler till analyserade resultat, inom tre dagar, vilket gör detta till en okomplicerad och snabb metod för känslig, hög genomströmning encelliga gen uttryck analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av Lysis plattor
- Använda en RNA/DNA gratis bänk, förbereda tillräckligt lyseringsbuffert 96 brunnar, med 10% extra, genom att blanda 390 µL nuclease gratis vatten, 17 µL 10% NP-40, 2,8 µL 10 mM dNTP, 10 µL 0,1 M DTT och 5,3 µL RNAse inhibitor (se Tabell för material). Vortex och varva ner.
- Fördela 4 µL lyseringsbuffert till varje brunn 96 väl PCR-platta och förslut plattorna med självhäftande film. Snurra ner rören att samla vätska på botten av plattorna. Hålla plattorna på is tills cellen sortering (maximalt 24 h).
2. förberedelse av celler för Cell sortering
- Tina lämpligt antal celler (här, CD34 berikad hematopoetiska stamceller och stamceller) för experimentet. 1 x 106 celler är lämpliga för sortering av ungefärligt tre 96 brunnar plåtar av singel-celler med kontroller.
- Överför tinade celler till en 15 mL koniska rör och tillsätt 1 mL FBS varje 30 s tills en total volym på 8 mL uppnås. Snurra celler i en centrifug på 350 x g under 10 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 8 mL färgning buffert (PBS med 2% FBS) och centrifugera vid 350 x g i 10 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 200 µL färgning buffert och ta bort celler för kontroll fläckar.
- Gör fluorescens minus en kontroller (ram av ömsesidiga åtaganden) för varje fluorophore, genom färgning en bråkdel av celler i 50 µL färgning buffert. I det här exemplet används 6 mikrocentrifugrör med 20.000 celler som FMOSs. Observera att antalet celler bör justeras beroende på befolkningens undersökt. Lägg till alla antikroppar i samma koncentration som i prov fläcken utom en till varje rör.
- Gör enstaka fläckar för varje fluorophore genom färgning en bråkdel av celler i 50 µL buffert för varje fluorophore används. I det här exemplet används 6 mikrocentrifugrör med 20.000 celler. Observera att målet för varje antikropp behöver uttryckas genom de celler som används för kontroller. Lägg till varje antikropp i samma koncentration som i prov fläcken i enskilda rör. Dessutom hålla 20.000 ofärgade celler i 50 µL som ofärgade kontroll.
- Till cell provet, lägga antikroppar på deras lämplig koncentration. Används här är CD34-FITC på en 1/100 koncentration, CD38-APC 1/50, CD90-PE 1/10, CD45RA-bv421 1/50, CD49F-PECy7 1/50 och härstamning Mix: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, CD56-PECy5 1/50, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, och CD235a-PECy5 1/1000.
- Inkubera cellerna med antikroppar i 30 min på is i mörkret.
- Tvätta cellerna med 3 mL färgning buffert. Centrifugera celler vid 350 x g i 10 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten.
- Omsuspendera cellerna och upprepa steg 2,9.
- Återsuspendera prov i 500 µL och ram av ömsesidiga åtaganden i 100 µL färgning buffert med 1/100 7AAD och filtrera celler genom en 50 µm filter för att få en encellig suspension.
3. cell sortering
- Kontrollera att FACS maskinen ställs upp korrekt med droppe fördröjning och cytometer setup och spårning (CST) som nyligen har utförts enligt tillverkarens anvisningar, se till att cellerna sorteras. För hematopoetiska celler rekommenderas användning av 4 85 micron munstycke och maximal hastighet, medan den optimala takten är mellan 800 och 2000 evenemang/s.
- Korrigera för spektral överlappning genom att utföra fluorescens ersättning och ange gates enligt FMO kontroller eller inre negativa kontroller.
- Utföra reanalysis av målgruppen genom att sortera minst 100 målceller i en ny mikrocentrifug rör med 100 µL av fläcken buffert. FACS analysera sorterade cellerna genom inspelning sorterade provet och se till att de hamnar i utfärda utegångsförbud för sortera.
- Set-up enda cell skylt sortering efter centrering nedgången i väl A1 i en 96 väl platta. När det är centrerad, sortera 50 – 100 6 µm partiklar i alla brunnar runt kanten på en tom 96 väl plåt för att alla brunnar kommer att få en cell i mitten av varje brunn.
- Om möjligt, kan en extra kontroll för att säkerställa att viabla celler sorteras läggas genom att sortera singel-celler för in vitro- tillväxt. Hematopoetiska celler kan odlas i U-botten 96 plattor i 100 µl SFEM med 1% penicillin streptomycin, 100 ng/mL FLT3L, TPO och SCF. Analysera varje brunn efter 3 dagar i kultur för cell kolonier med Mikroskop.
- Ta bort självhäftande film från plattorna. En enda cell slags intresse (här Lin-CD34 + CD38-celler) i 92 av 96 brunnar, aktivera INDEX-sortering i den FACS sortering programvara kan spara den immunophenotypic profilen för andra markörer av intresse (här CD45RA, CD49f och CD90) för varje enskild cell.
- Sortera två brunnar med 10 och 20 celler respektive för linjäritet kontroller i den PCR-amplifieringen. Wells H1 och H2 används vanligen.
- Hålla två brunnar utan celler som nr-mallen kontrollerar, vanligtvis brunnar H3 och H4.
- Förslut plattorna med tydlig självhäftande film och snurra plattorna vid 300 x g för 1 min innan snapin frysning på torris.
- Förvaras frysta plattor vid-80 ° C.
Obs: Säker stoppunkten. Sorterad och lyserat celler kan förvaras vid-80 ° C för långsiktig lagring.
4. omvänd Transkription och specifik amplifiering
- Förbereda den primer mix för alla 96 gen mål genom att lägga till 2 µL av varje primer par, inklusive städning gen primers och primers för spetsade in kontroll RNA, i en 1,5 mL RNAse Gratis tube på en RNA/DNA gratis bänk. Om du använder mindre än 96 primers, tillsätt en motsvarande volym nuclease gratis vatten för saknas primers. Primers beställs separat att matcha den önskade gen panelen.
- Gör omvänd Transkription och specifik amplifiering blanda genom att lägga 632.5 µL 2 x reaktionsblandning, 101,2 µL Taq/SuperscriptIII, 151,8 µL Primer mix och 0.7 µL spetsade i kontroll RNA. Utför detta steg på en gratis DNA-bänk. Mix av vortexa och snurra ner till samlar vätskan i botten av röret. Hålla på is tills tillägg till provet.
- Make nr-omvänd Transkription kontroll mix för fyra brunnar genom att blanda 27,5 µL av 2 x reaktionsblandning, 1.76 µL av Taq enzym, 6,6 µL av primer mix och 2,64 µL nuclease gratis vatten. Spike kontroll RNA. Utföra detta steg på en gratis DNA-bänk. Vortex och snurra ner till samlar vätskan i botten på röret och hålla på is tills tillägg till provet.
- Tina lysate plattor på is. Lägga till 8,75 µL av tidigare beredda omvänd Transkription och specifik amplifiering mix 92 brunnar, inklusive kontrollerna linjäritet och nr-mall. Tillsätt 8,75 µL nr-omvänd Transkription kontroll mix i fyra återstående brunnarna. Försegla plattor med tydlig självhäftande film och snurra ner till samla vätska på botten av plattorna.
- Preform omvänd Transkription och specifik amplifiering av kör plattan i en PCR-maskin enligt preamp programmet; steg 1:50 ° C i 60 min, steg 2: 95 ° C i 2 min, steg 3: 95 ° C i 15 s, steg 4: 60 ° C i 4 min, upprepa steg 3 – 4 24 gånger och slutligen steg 5: 8 ° C för evigt.
- Efter PCR är komplett, hålla plattan vid 8 ° C för kortsiktig lagring och -20 ° C för långtidsförvaring.
Obs: Säker stoppunkten. Förstärkt material kan hållas vid 8 ° C för kortsiktig lagring och vid-20 ° C för långsiktig lagring.
5. beredning av prov och test plåtar för Multiplex mikroflödessystem gen uttryck analys
- Förbereda assay lastning plattan genom pipettering 3 µL Assay lastning reagensmedel till varje brunn 96 väl platta. Tillsätt 3 µL av varje primer till enskilda brunnar i analysen lastning plattan.
- Försegla tallrik med självhäftande film och spinn ner till samla vätska på botten av plattorna.
- Förbereda den utspädning plattan genom pipettering 8 µL av nuclease gratis vatten i alla brunnar 96 väl platta. Tillsätt 2 µL av förstärkta prov till utspädning plattan, att göra en slutlig spädning 1:5.
- Försegla tallrik med självhäftande film, blanda av vortexa plate för 10 s, och slutligen snurra ner till samla vätska på botten av plattorna.
- Förbereda prov lastning mix genom att noggrant blanda 352 µL av master mix med 35,2 µL prov lastning reagens. Förbereda prov lastning plattan genom att alikvotering 3.3 µL lastning mix till varje brunn 96 väl platta.
- Tillsätt 2,7 µL från det utspädda provet i varje brunn av provet lastning plattan.
- Försegla tallrik med självhäftande film och spinn ner till samla vätska på botten av plattorna.
6. lastning av mikroflödessystem Chip
- Ta ut ett nytt 96 x 96 mikroflödessystem chip. Förbereda vikar genom att peta dem med en spruta med mössa på att se till att de kan flyttas.
- Ta bort bubblor från sprutor. Lägga till full volym med sprutor varje ventil samtidigt luta chip 45 grader och trycka ner ventilen. Prime chip med IFC controller.
- Fyll varje assay inlopp med 4.25 µL från var och en av brunnarna i analysen lastning plattan. Undvik bubblor. Om bubblor visas i brunnen, ta bort dem med en pipettspetsen.
- Fortsätta laddar varje prov inlopp med 4.25 µL från var och en av brunnarna i provet lastning plattan, undvika bubblor och om bubblor visas, ta bort dem med pipettspetsen.
- Ladda chip med IFC controller.
- Kontrollera att chipet ser ännu och att alla avdelningar har hämtats. Ta bort damm från chip ytan genom att röra den med tejp. Kör chip i multiplex mikroflödessystem gen uttryck plattformen.
7. kör Chip på Multiplex mikroflödessystem gen uttryck plattform
- Efter lastning chip in på multiplex mikroflödessystem gen uttryck plattform, namn provet.
- Ange ROX som passiv färgämne. Som enda sond och FAM-MGB fluorescens. Använda 96 x 96 standard v2 som protokoll. Börja springa.
- Ta bort chip när kör är komplett.
8. preliminär analys av Chip kör
- Läsa in data i Real-Time PCR analysprogramvara.
- Läsa in-gen namn och cell genom att klistra in cell och genterapi layouter från en tabbavgränsad fil.
- Öppna bild vy och välj ROX som färgämne. Kontrollera om alla brunnar har ROX passiva färgämne.
- Undersöka om alla förstärkning tomter ser ok, med en slät förstärkning kurva med inga spikar (liknande figur 3E).
- Säkerställa att alla singel-celler har uttryck av spetsade in kontroll RNA se till att alla har laddats ordentligt.
- Se till att alla celler har städning genuttryck och således har sorterats ordentligt.
- Se till att 10-20 cell linjäritet kontroller har ca 1 CT skillnaden att validera linjär förstärkning.
- Kontrollera om det finns uttryck i de noRT kontrollproverna. Om uttryck upptäcks i noRT överväga att ändra sonder till sonder som inte upptäcka genomiskt DNA för efterföljande körningar.
- Exportera data i CSV-filer för ytterligare analys.
9. single-cell analys med SCExV
Obs: En inledande film är närvarande20 att introducera verktyget. Här presenteras en kort rekommendation om hur man gör analyser med hjälp av kontroller som införts i protokollet.
- Anslut till SCexV webbplats20.
- Ladda upp exporterade CSV-filer.
- Valde den spetsade-i kontrollen RNA som positiv kontroll. Ta bort en cell som har en kontroll RNA CT ovan 25. Normalisera data till median uttryck för kontroll RNA.
- Klicka på ”här -> analysera”. Ta bort noRT, notemplate, 10 och 20 cell kontroller i alternativet Uteslut cell.
- Klustret celler med metoden klustring val med det förväntade antalet kluster. Exportera analyserade värden.
10. Index-sortering analys
- Öppna FACS analysprogramvara och ladda de indexerade proverna.
- Öppna script editor och kör skriptet tillgängliga från Quinn J. et al. 21
- Nu programvaran FACS analys borde ha gjort en utfärda utegångsförbud för var och en av de enda cellerna, öppna layout editor och färga cellerna enligt CB från SCexV (finns i filen som heter ”Sample_complete_Data.xls”).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet beskrivs är snabbt, enkelt utförda och mycket tillförlitlig. En översikt över experimentella set-up presenteras i figur 1. Hela protokollet från sortering av singel-celler, till specifik amplifiering, gen uttryck mätningar och preliminär analys kan utföras i tre dagar. Ett exempel på analyserade resultaten i form av en intensitetskarta som representerar preliminära analyserade data från encelliga gen uttryck analys med 96 primers och 96 celler från antingen en kronisk myeloisk leukemi (KML) patient eller 96 celler från en äldre-matchade friska kontroll presenteras i figur 2. Med hjälp av hierarkisk klustring, kan analyserade celler delas in i fyra undergrupper baserat på deras gen uttryck signaturer. Värme karta visualisering är ett bekvämt sätt att få en översikt över data samt att kontrollera för brunnar som ska undantas från analys (t.ex. kontrollbrunnar). Figur 2B är en principalkomponentanalys (PCA) visualisera hur liknande cellerna i varje grupp är med varandra via dimensionen minskning. Här är extremvärden lätt urskiljas från resten av cellerna. Att analysera hur enskilda gener fördelas bland kluster som skiljer sig mellan dem, violin tomter är användbar. I figur 2 c, uttrycket av fyra representativa gener visas: fusion genen BCR-ABL1, som markerar alla leukemic celler; i cellcykeln markör mKI67, som uttrycks i ett aktivt dela gruppen; myeloisk differentiering markören MPO, som är begränsad till undergruppen Cykling; och slutligen huset hålla genen RPS18, som uttrycks i alla celler. Slutligen, i figur 2D molekylära signaturer har korrelerats till immunophenotyped, identiteterna för varje cell i varje kluster används att färga de enskilda cellerna i en FACS tomt genereras från index-sortering. Visas är cell surface markör uttrycket för hematopoetiska stamceller markörerna CD90 och CD45RA som i detta fall kan användas för att diskriminera mellan några av kluster och prospektivt isolera dem för funktionell analys.
Den mikrofluidik som används för att utföra de encelliga qPCR är mycket känslig för införsel av luft eller partiklar i systemet. Därför är det kritiskt att göra ett inlägg kör kvalitetskontroll av data. Figur 3 visar representativa data och kontrasten mellan en lyckad och en misslyckad kör på grund av dålig prov lastning. Figur 3A visar hur Rox nivåer efter en framgångsrik köra sprids jämnt över alla brunnar betryggande att lastningen har varit framgångsrik. Däremot visar figur 3B hur prov och test lastning har misslyckats som anges av bristen på ROX i stora delar av chip. När kvaliteten på Rox har utvärderats, kan kvaliteten på raw gen uttryck signalerna utvärderas. I figur 3 c, presenteras en intensitetskarta av en lyckad körning, där uttrycket är jämnt utspridda över prover med stark signal om runt 7-25 Ct:s. i kontrast, figur 3D visar en intensitetskarta av en misslyckad kör där många prover har ingen signal eller uttryck för en mycket begränsad mängd gener. Resultaten i figur 3D är sannolikt på grund av ett fel i FACS sortering före enskild cell gene expression analys, eftersom många celler har tydligt uttryck signaler medan andra saknar uttryck helt. Slutligen visar figur 3E förväntade förstärkning kurvan spetsade in kontroll RNA med alla brunnar ha tydligt uttryck för omkring 10 CT med liten eller ingen variation. Denna positiva kontroll mäter effektiviteten i alla steg i en enskild cell qPCR-analys. För att säkerställa att förstärkning inom dynamiskt omfång, ingår olika cell nummer som linjäritet kontroller; här, används 10 - och 20-cell kontroller. CT skillnaderna mellan linjäritet kontroller bör återspegla skillnaderna i cell nummer. Slutligen, ingen omvänd Transkription (noRT) och ingen mall negativa kontroller se till att inga falska positiva signaler upptäcks från genomiskt DNA eller föroreningar, respektive.
Figur 1: Schematisk vy av protokollet. Cellerna är färgade, sorterade med index-sortera program aktiverat för att spela in surface markör uttryck och lyserat att släppa mRNA. mRNA är därefter omvänd transkriberas till cDNA och förstärks med specifik amplifiering. Nästa, proverna laddas tillsammans med individuella grundfärger i en mikroflödessystem chip, där varje cell gene expression profil analyseras med RT-qPCR. Efter insamling av data, data är förbearbetade att avlägsna låg kvalitet celler och klustring utförs för att definiera molekylärt distinkta cellpopulationer. Slutligen, molekylärt definierade subpopulationer är korrelerade till ytan markör uttryck från FACS index sortera data till immunophenotypically karakterisera heterogenitet av befolkningarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa resultat av tre framgångsrika encelliga genuttryck analyserar av normala och leukemiska hematopoetiska stamceller. (A) värme karta visar enskild cell gene expression mätningar av 270 enstaka celler från en kronisk myeloisk leukemi patienten samt en åldersmatchade friska kontroll analyseras av hierarkisk klustring med SCExV 18, ett analysverktyg för denna typ av data. Rött representerar hög uttryck, blå låga uttryck och grå inget uttryck. Cellerna var indelade i fyra olika kluster baserat på deras gen uttryck signaturer. Det framgår av data att befolkningens leukemiska stamceller från denna patient kan delas i en quiescent befolkning (cluster 3), med uttryck av endast några differentiering markörer, och ett aktivt delande befolkningen som har initierat uttryck för gener associerade med myeloisk differentiering (kluster 4). De uppgifter som används här är från en vald patient som ingår i tidigare publicerade arbete genom Warfvinge o.a. 22 (B) Principal Komponentanalys (PCA) av data visas i A, där fyra åtskilda grupper kan visas. (C) Violin tomter av fyra gener med kluster specifika uttryck, BCR-ABL1, mKI67, RPS18 och MPO. Varje violin tomt representerar uttrycket i varje kluster och den streckade linjen representerar medelvärdet av uttryck för alla celler. (D) Index-sortering analys av en av patientproverna representerade i stresskartan, där varje enskild cell markeras med färgen på dess molekylära subpopulation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kvalitetskontrollen av multiplex qPCR i realtid PCR programvara. (A) Rox inläsningsbild av lyckade prov och test lastning. (B) Rox inläsningsbild av misslyckade prov och test lastning, där misslyckade axelbelastningar för prover visas av bristande ROX i horisontella linjer. Misslyckade lastning av analyser skulle visas i vertikala linjer. (C) exempel på en framgångsrik kör i värme kartvy, där singel-celler representerar rader och gener kolumner. Hög genuttryck indikeras i gula, låg uttryck i blått och inga upptäckta uttryck i svart. (D) exempel på en misslyckad kör i värme kartvy, där singel-celler representerar rader och gener kolumner. Hög genuttryck representeras av gul, låga uttryck representeras av blå och inga upptäckta uttryck som svart. (E) normaliserad intensitet (vänster) och förstärkning tomt (höger) en spetsade-i RNA kontroll. CT-värden av ungefärligt 10 och kurvor med begränsad variation indikerar framgångsrika och robust omvänd Transkription, före förstärkning och qPCR analys inom alla brunnar. (F) normaliserad intensitet (vänster) och amplification plot (höger) av en felande gen. De normaliserade stödnivåerna utgör inte en kurva och förstärkning tomten visar stora spikar i fluorescens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under de senaste åren har enskild cell gene expression analys blivit ett värdefullt tillskott till definiera olika cell populationer23heterogenitet. Tillkomsten av RNA-sekvensering teknik ger teoretiskt en möjlighet för att mäta den hela transkriptom till en cell, men dessa metoder är kompliceras av variationer i cell-till-cell sekvensering djup och drop-outs. Encelliga qPCR erbjuder en känslig och robust analys av uttrycket av hundratals kritiska gener där alla celler behandlas på samma sätt minska tekniska buller. Fokuserad analys av ett begränsat antal avskrifter möjliggör dessutom förenklad analys utan inblandning från starkt uttryckt gener.
Eftersom metoden undersöker endast en delmängd av gener uttrycks i cellerna är det mycket viktigt att välja rätt uppsättning gener när du utformar panelen genen. Valet av gener kan göras på flera sätt; genom litteratur, tidigare fynd av massanalys och bioinformatik analys av offentligt tillgängliga uppgifter. Detta är inte trivialt; dock med rätt uppsättning gener kan metoden vara mycket kraftfullt. När panelen genen har utformats, är det viktigt att validera att primers inte störande under multiplexing. Här rekommenderar vi analysera om primers är linjärt genom Förformning en utspädning serie med gott om material. en utspädning serie med primers som används i denna studie visas i kompletterande figur 2D i Warfvinge o.a. 22
De två huvudsakliga begränsningarna av det protokoll som presenteras här är det begränsade antalet celler och gener undersökas. Men även om endast 96 celler undersöks i varje körning, detta relativt enkla protokoll kan slutföras på en dag och därmed hundratals celler kan analyseras i en vecka. Dessutom ökas antalet gener undersökas om mer primers ingår i målet-specifika före förstärkning steg. I det här fallet behövs flera marker att undersöka varje uppsättning 96 primers.
Om starkt uttryckt gener eller celler med hög RNA-innehåll analyseras, antalet cykler optimerad för hematopoetiska stamceller med låga övergripande gen uttryck23 bör ändras. Ändra förstärkning cykler är också viktigt när du undersöker bulk populationer. För massanalys av hematopoetiska stamceller (100 celler) rekommenderar vi att minska mängden före förstärkning cykler från 25 till 18.
De vanligaste orsaker till misslyckats körs beror misslyckade sortering av singel-celler i brunnen av Lys plattan, sortering av icke-viabla celler, suboptimal före förstärkning eller chip lastning fel. Rox nivån i varje reaktionskammaren är en indikator för laddning av antingen prov eller test, och om dessa är låg, det rekommenderas att proverna åter körs på ett nytt chip, sedan låg Rox nivåer orsakas sannolikt av införandet av bubblor under lastning. Bristande kontroll för spetsade-i RNA uttryck är en indikator på att Pre ampere har misslyckats, sannolikt på grund av problem med före förstärkning- eller omvänd Transkription reagenser. I detta fall är det rekommenderat att ett nytt chip drivs med nyligen sorterade celler och nya reaktanterna. Påvisande av kontroll RNA men ingen indikation på andra genuttryck signaler är en indikation på misslyckade encelliga FACS sortering före gen uttryck analys. Att undvika fel under FACS sortering är det viktigt att se till att singel-cellerna sorteras in i centrera av varje brunn. Detta kan göras genom att sortera pärlor till en tom platta och visuellt inspektera där droplet-programmet landar. Se till att test-sortera in alla brunnar i kanterna på plattan så att upplägget inte är bara rätt för de första några brunnarna. I förekommande fall, singel-celler kan parallellt sorteras in vitro tillväxt och analyseras före qPCR-analys för att kontroll för framgångsrika sortering protokoll. Index-sortering information tillåter inte bara för att utreda immunophenotyped av en molekylärt distinkta subpopulation men kan också ge värdefulla insikter när felsökning om du sorterar en odefinierad befolkning och många låg kvalitet celler är närvarande i enskild cell gene expression analysen. Index-sortering informationen kan användas för att optimera den portande strategin och undvika framtida sortering av låg kvalitet celler.
Enskild cell gene expression analys är revolutionerar hur heterogena cell populationer utforskas och banar väg för ytterligare förståelse för celldifferentiering. I hematopoes, encelliga gen uttryck analys har använts för att förfina sortering strategier för undergrupper av Förenta7, lös heterogenitet multipotenta stamceller populationer6,24,25 , och att identifiera terapi okänsliga leukemiska stamceller populationer22,26. Kombination av index sortering med både encelliga gen uttryck- och funktionell analys har tidigare visat sig vara tillförlitlig och effektiv när du undersöker immunophenotype och heterogenitet i olika populationer27, 28,29. Här, en metod för undersökning av molekylära och immunophenotypic heterogenitet cell populationer har varit beskrivs där kombinera encelliga qPCR med index sortering möjliggör snabba och reproducerbara resultat utan komplicerade analys i en kort tidsram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från Cancerfonden, Vetenskapsrådet, Svenska Sällskapet för medicinsk forskning, The Barncancerfonden, The Ragnar Söderbergs stiftelse, och från Knut och Alice Wallenbergs stiftelse
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD14 PECY5 | eBioscience | 15-0149-42 | Clone: 61D3 |
| CD16 PECY5 | Biolegend | 302010 | Clone: 3G8 |
| CD56 PECY5 | Biolegend | 304608 | Clone: MEM-188 |
| CD19 PECY5 | Biolegend | 302210 | Clone: HIB19 |
| CD2 PECY5 | Biolegend | 300210 | Clone: RPA-2.10 |
| CD3 PECY5 | Biolegend | 300310 | Clone: HIT3a |
| CD123 PECY5 | Biolegend | 306008 | Clone: 6H6 |
| CD235A PECY5 | BD Pharma | 559944 | Clone GAR2 |
| CD34 FITC | Biolegend | 343604 | Clone: 561 |
| CD38 APC | Biolegend | 303510 | Clone: Hit2 |
| CD90 PE | Biolegend | 328110 | Clone: 5E10 |
| CD45RA BV421 | BD bioscience | 560362 | Clone: HI100 |
| CD49f Pecy7 | eBioscience | 25-0495-82 | Clone: eBioGOH3 |
| FBS | HyClone | SV30160.3 | |
| PBS | HyClone | SH30028.02 | |
| 96-well u-bottom Plate | VWR | 10861-564 | |
| SFEM | Stem cell technologies | 9650 | |
| Penicillin streptomycin | HyClone | SV30010 | |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| SCF | Peprotech | 300-07 | |
| FLT3L | Peprotech | 300-19 | |
| Falcon Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Eppendorph tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| CST beads | BD | 642412 | |
| Accudrop Beads | BD | 345249 | 6 µm particles |
| Adhesive film Clear | Thermo scientific | AB-1170 | |
| Adhesive film Foil | Thermo scientific | AB-0626 | |
| 96 well PCR plate | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
| PCR 1.5 mL tube | Axygen | MCT-150-L-C | |
| T100 PCR cycler | BioRad | 186-1096 | |
| 10% NP40 | Thermo scientific | 85124 | |
| 10 mM dNTP | Takara | 4030 | |
| 0.1 M DTT | Invitrogen | P2325 | |
| RNAsout | Invitrogen | 10777-019 | RNAse inhibitor |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Invitrogen | 11753-100 | |
| Neuclease free water | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| 2x Reaction Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| SuperScript III RT/Platinum Taq Mix | Invitrogen | 11753-100 | from CellsDirect kit |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966026 | |
| TaqMan Cells-to-CT Control Kit | Invitrogen | 4386995 | |
| Xeno RNA Control | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay | Invitrogen | 4386995 | From TaqMan Cells-to-CT Control Kit |
| 96.96 Sample/Loading Kit—10 IFCs | Fluidigm | BMK-M10-96.96 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| 20x GE Sample Loading Reagent | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| Control line fluid | Fluidigm | From 96.96 Sample/Loading Kit | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| BioMark HD | Fluidigm | BMKHD-BMKHD | |
| 96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M10-96.96GT | |
| Excel | Microsoft | Microsoft | |
| FlowJo V10 | TreeStar | TreeStar | |
| Fluidigm real time PCR analysis | Fluidigm | Fluidigm | |
| CD179a.VPREB1 | Thermofisher scientific | Hs00356766_g1 | |
| ACE | Thermofisher scientific | Hs00174179_m1 | |
| AHR | Thermofisher scientific | Hs00169233_m1 | |
| BCR_ABL.52 | Thermofisher scientific | Hs03043652_ft | |
| BCR_ABL41 | Thermofisher scientific | Hs03024541_ft | |
| BMI1 | Thermofisher scientific | Hs00995536_m1 | |
| CCNA2 | Thermofisher scientific | Hs00996788_m1 | |
| CCNB1 | Thermofisher scientific | Hs01030099_m1 | |
| CCNB2 | Thermofisher scientific | Hs01084593_g1 | |
| CCNC | Thermofisher scientific | Hs01029304_m1 | |
| CCNE1 | Thermofisher scientific | Hs01026535_g1 | |
| CCNF | Thermofisher scientific | Hs00171049_m1 | |
| CCR9 | Thermofisher scientific | Hs01890924_s1 | |
| CD10.MME | Thermofisher scientific | Hs00153510_m1 | |
| CD11a | Thermofisher scientific | Hs00158218_m1 | |
| CD11c.ITAX | Thermofisher scientific | Hs00174217_m1 | |
| CD123.IL3RA | Thermofisher scientific | Hs00608141_m1 | |
| CD133.PROM1 | Thermofisher scientific | Hs01009250_m1 | |
| CD151 | Thermofisher scientific | Hs00911635_g1 | |
| CD220.INSR | Thermofisher scientific | Hs00961554_m1 | |
| CD24.HSA | Thermofisher scientific | Hs03044178_g1 | |
| NCOR1 | Thermofisher scientific | Hs01094540_m1 | |
| CD26.DPP4 | Thermofisher scientific | Hs00175210_m1 | |
| CD274 | Thermofisher scientific | Hs01125301_m1 | |
| CD276 | Thermofisher scientific | Hs00987207_m1 | |
| CD32.FCGR2B | Thermofisher scientific | Hs01634996_s1 | |
| CD33 | Thermofisher scientific | Hs01076281_m1 | |
| CD34 | Thermofisher scientific | Hs00990732_m1 | |
| CD344.FZD4 | Thermofisher scientific | Hs00201853_m1 | |
| CD352.SLAMF6 | Thermofisher scientific | Hs01559920_m1 | |
| CD38 | Thermofisher scientific | Hs01120071_m1 | |
| CD4 | Thermofisher scientific | Hs01058407_m1 | |
| CD41.ITGA2B | Thermofisher scientific | Hs01116228_m1 | |
| CD49f.ITGA6 | Thermofisher scientific | Hs01041011_m1 | |
| CD56.NCAM1 | Thermofisher scientific | Hs00941830_m1 | |
| CD9 | Thermofisher scientific | Hs00233521_m1 | |
| CD97 | Thermofisher scientific | Hs00173542_m1 | |
| CD99 | Thermofisher scientific | Hs00908458_m1 | |
| CDK6 | Thermofisher scientific | Hs01026371_m1 | |
| CDKN1A | Thermofisher scientific | Hs00355782_m1 | |
| CDKN1B | Thermofisher scientific | Hs01597588_m1 | |
| CDKN1C | Thermofisher scientific | Hs00175938_m1 | |
| CEBPa | Thermofisher scientific | Hs00269972_s1 | |
| CSF1r | Thermofisher scientific | Hs00911250_m1 | |
| CSF2RA | Thermofisher scientific | Hs00531296_g1 | |
| CSF3RA | Thermofisher scientific | Hs01114427_m1 | |
| E2A.TCF3 | Thermofisher scientific | Hs00413032_m1 | |
| EBF1 | Thermofisher scientific | Hs01092694_m1 | |
| ENG | Thermofisher scientific | Hs00923996_m1 | |
| EPOR | Thermofisher scientific | Hs00959427_m1 | |
| ERG | Thermofisher scientific | Hs01554629_m1 | |
| FLI1 | Thermofisher scientific | Hs00956711_m1 | |
| FLT3 | Thermofisher scientific | Hs00174690_m1 | |
| FOXO1 | Thermofisher scientific | Hs01054576_m1 | |
| GAPDH | Thermofisher scientific | Hs02758991_g1 | |
| GATA1 | Thermofisher scientific | Hs00231112_m1 | |
| GATA2 | Thermofisher scientific | Hs00231119_m1 | |
| GATA3 | Thermofisher scientific | Hs00231122_m1 | |
| GFI1 | Thermofisher scientific | Hs00382207_m1 | |
| HES1 | Thermofisher scientific | Hs01118947_g1 | |
| HLF | Thermofisher scientific | Hs00171406_m1 | |
| HMGA2 | Thermofisher scientific | Hs00171569_m1 | |
| HOXA5 | Thermofisher scientific | Hs00430330_m1 | |
| HOXB4 | Thermofisher scientific | Hs00256884_m1 | |
| ID2 | Thermofisher scientific | Hs04187239_m1 | |
| IGF2BP1 | Thermofisher scientific | Hs00198023_m1 | |
| IGF2BP2 | Thermofisher scientific | Hs01118009_m1 | |
| IKZF1 | Thermofisher scientific | Hs00172991_m1 | |
| IL1RAP | Thermofisher scientific | Hs00895050_m1 | |
| IL2RG | Thermofisher scientific | Hs00953624_m1 | |
| IRF8 | Thermofisher scientific | Hs00175238_m1 | |
| ITGB7 | Thermofisher scientific | Hs01565750_m1 | |
| KIT | Thermofisher scientific | Hs00174029_m1 | |
| Lin28B | Thermofisher scientific | Hs01013729_m1 | |
| LMO2 | Thermofisher scientific | Hs00153473_m1 | |
| LYL1 | Thermofisher scientific | Hs01089802_g1 | |
| Meis1 | Thermofisher scientific | Hs01017441_m1 | |
| mKi67 | Thermofisher scientific | Hs01032443_m1 | |
| MPL | Thermofisher scientific | Hs00180489_m1 | |
| MPO | Thermofisher scientific | Hs00924296_m1 | |
| NFIB | Thermofisher scientific | Hs01029175_m1 | |
| Notch1 | Thermofisher scientific | Hs01062011_m1 | |
| Pten | Thermofisher scientific | Hs02621230_s1 | |
| RAG2 | Thermofisher scientific | Hs01851142_s1 | |
| RPS18 | Thermofisher scientific | Hs01375212_g1 | |
| RUNX1 | Thermofisher scientific | Hs00231079_m1 | |
| Shisa2 | Thermofisher scientific | Hs01590823_m1 | |
| Spi1 | Thermofisher scientific | Hs02786711_m1 | |
| Sterile.IgH | Thermofisher scientific | Hs00378435_m1 | |
| TAL1 | Thermofisher scientific | Hs01097987_m1 | |
| THY1 | Thermofisher scientific | Hs00264235_s1 | |
| Tim.3.HAVCR2 | Thermofisher scientific | Hs00958618_m1 | |
| VWF | Thermofisher scientific | Hs00169795_m1 |
References
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Ye, F., Huang, W., Guo, G. Studying hematopoiesis using single-cell technologies. Journal of Hematology & Oncology. 10, 27 (2017).
- Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research. Nature Cell Biology. 16 (10), 919-927 (2014).
- Wills, Q. F., et al. Single-cell gene expression analysis reveals genetic associations masked in whole-tissue experiments. Nature Biotechnol. 31 (8), 748-752 (2013).
- Velten, L., et al. Human haematopoietic stem cell lineage commitment is a continuous process. Nat Cell Biol. 19 (4), 271-281 (2017).
- Wilson, N. K., Nicola, K., et al. Combined single-cell functional and gene expression analysis resolves heterogeneity within stem cell populations. Cell Stem Cell. 16 (6), 712-724 (2015).
- Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. Single-cell RNA-seq: Advances and future challenges. Nucleic Acids Research. 42 (14), 8845-8860 (2014).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of Single RNA Transcripts in Situ. Science. 280 (5363), 585-590 (1998).
- Kalisky, T., et al. A brief review of single-cell transcriptomic technologies. Briefings in Functional Genomics. , elx019 (2017).
- Crosetto, N., Bienko, M., van Oudenaarden, A. Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics. 16, 57 (2014).
- Bengtsson, M., Ståhlberg, A., Rorsman, P., Kubista, M. Gene expression profiling in single cells from the pancreatic islets of Langerhans reveals lognormal distribution of mRNA levels. Genome Research. 15 (10), 1388-1392 (2005).
- Bengtsson, M., Hemberg, M., Rorsman, P., Ståhlberg, A. Quantification of mRNA in single cells and modelling of RT-qPCR induced noise. BMC Molecular Biology. 9 (1), 63 (2008).
- Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nature Methods. 10, 1096 (2013).
- Tung, P. -Y., et al. Batch effects and the effective design of single-cell gene expression studies. Scientific Reports. 7, 39921 (2017).
- Teles, J., Enver, T., Pina, C. Single-cell PCR profiling of gene expression in hematopoiesis. Methods in Molecular Biology. , 21-42 (2014).
- Hayashi, T., et al. Single-cell gene profiling of planarian stem cells using fluorescent activated cell sorting and its "index sorting" function for stem cell research. Development, Growth, & Differentiation. 52 (1), 131-144 (2010).
- Lang, S., et al. SCExV: A webtool for the analysis and visualisation of single cell qRT-PCR data. BMC Bioinformatics. 16 (1), 320 (2015).
- de Klein, A., et al. A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukaemia. Nature. 300 (5894), 765-767 (1982).
- Lang, S., et al. SCExV. , Available from: http://stemsysbio.bmc.lu.se/SCexV/ (2015).
- Quinn, J. indexed-sorting. , Available from: https://github.com/FlowJo-LLC/indexed-sorting (2016).
- Warfvinge, R., et al. Single-cell molecular analysis defines therapy response and immunophenotype of stem cell subpopulations in CML. Blood. 129 (17), 2384-2394 (2017).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Breton, G., et al. Human dendritic cells (DCs) are derived from distinct circulating precursors that are precommitted to become CD1c+ or CD141+ DCs. The Journal of Experimental Medicine. 213 (13), 2861-2870 (2016).
- Alberti-Servera, L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals developmental heterogeneity among early lymphoid progenitors. The EMBO Journal. 36 (24), 3619-3633 (2017).
- Giustacchini, A., et al. Single-cell transcriptomics uncovers distinct molecular signatures of stem cells in chronic myeloid leukemia. Nature Medicine. 23, 692 (2017).
- Hansmann, L., Han, A., Penter, L., Liedtke, M., Davis, M. M. Clonal expansion and interrelatedness of distinct B-lineage compartments in multiple myeloma bone marrow. Cancer Immunology Research. 5 (9), 744-754 (2017).
- Psaila, B., et al. Single-cell profiling of human megakaryocyte-erythroid progenitors identifies distinct megakaryocyte and erythroid differentiation pathways. Genome Biology. 17 (1), 83 (2016).
- Schulte, R., et al. Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations. Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).
