Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Plasmamembran, Zytoplasma und Mitochondrien von U937 Zellen ohne den Einsatz von High-Speed-Zentrifugation zu isolieren. Diese Technik lässt sich subzelluläre Fraktionen für die anschließende Untersuchung des Proteins Lokalisierung über Immunoblotting zu reinigen.
Abstract
In diesem Protokoll zeigen wir eine Methode, subzelluläre Bruchteile von U937 Zellen ohne den Einsatz von Ultrazentrifugation oder wahllose Reinigungsmittel zu erhalten. Diese Methode nutzt hypotone Puffer, Digitonin, mechanische lyse und differentielle Zentrifugation, Zytoplasma, Mitochondrien und Plasmamembran zu isolieren. Der Prozess kann skaliert werden, um den Bedürfnissen der Forscher, ist preiswert und unkompliziert. Diese Methode ermöglicht abschätzen, Protein-Lokalisierung in Zellen ohne spezielle Zentrifugen und ohne den Einsatz von kommerziellen Kits, die teuer werden können. Wir haben erfolgreich diese Methode cytosolischen trennen, Plasmamembran und mitochondrialen Proteine in die menschliche Monocyte-Zellinie U937 verwendet.
Introduction
Zuverlässige Identifikation von Protein-Lokalisierung ist oft notwendig, bei der Prüfung, molekulare Signalwege in eukaryotischen Zellen. Methoden, subzelluläre Brüche zu erhalten sind übernommen werden Forscher zelluläre Komponenten von Interesse näher zu untersuchen.
Die Mehrzahl der bestehenden Zelle Fraktionierung Methoden fällt in der Regel in zwei große Kategorien, Waschmittel-basierte1,2 und Ultrazentrifugation basierende3,4,5, die sein kann unterscheiden sich durch Schnelligkeit, Präzision und Kosten. Waschmittel je Protokolle verlassen sich auf die Verwendung von Puffern mit zunehmender Waschmittel Stärke um verschiedene Komponenten der Zelle zu solubilisieren. Dies kann ist eine schnelle und bequeme Methode für die Verarbeitung von Proben und kostengünstig, wenn die Anzahl und Größe der Proben klein sind. Waschmittel-basierte Kits können erworben werden, um cytoplasmatischen Membran/Organellen (Gemischter Bruch) und nukleare Fraktionen aus Zellen zu isolieren. Jedoch begrenzen einige Nachteile verbunden mit diesen Kits ihre Nützlichkeit für Forscher. Sie sind entworfen, um einfach ein oder zwei Komponenten der Zelle zu isolieren, aber nicht in der Lage alle Fraktionen aus einer Probe gleichzeitig zu isolieren. Die Verwendung von Reinigungsmitteln bedeutet, dass die Plasmamembran und Membran umhüllten Organellen ebenso solubilisiert werden werden und somit voneinander getrennt werden. Eine zusätzliche Schwierigkeit ergibt sich aus der proprietären Komponenten in diesen Kits, die verhindert, dass Forscher Bedingungen für spezifische Anwendungen zu verändern. Schließlich, sie sind in der Anzahl der Nutzungen eingeschränkt und möglicherweise unerschwinglich für größere Skala Experimente. Non-Reinigungsmittel basierend Kits gibt es für die Isolation von Mitochondrien, aber sie sollen nicht die Plasmamembran zu isolieren und die Probenausbeute ist deutlich geringer als die von Dichte Zentrifugierung isoliert Protokolle6,7 .
Methoden, die Ultrazentrifugation zu nutzen, um Brüche zu erhalten sind mehr zeitaufwendig, aber oft führen zu reiner Brüche als Waschmittel-basierte Kits. Um die Plasmamembranen von Zellen zu isolieren, ohne erste Gefäss-sie (was zu Kontaminationen mit Membran Organellen) verlangt, dass sie durch eine nicht-Reinigungsmittel-Methode, gefolgt von Trennung der zellulären Komponenten über differentielle lysiert werden Zentrifugation – mit der Plasmamembran Isolation erfordern Geschwindigkeiten von 100.000 × g zu erreichen. In vielen Fällen muss Isopycnic Dichte Gradienten Zentrifugation für weitere Trennung von zellulären Brüche oder Entfernung von Verunreinigungen differentielle Zentrifugation folgt. Während diese Methoden gründlich und veränderbar sind, gehören Nachteile, Kosten, Zeitaufwand und die Notwendigkeit einer Ultrazentrifuge zur Trennung von Fraktionen und weitere Reinigung über Dichte Steigung Zentrifugierung. Die meisten High-Speed-Zentrifugen sind Kosten, die für einzelne Ermittler und sind oft geteilt, Ausrüstung an Hochschulen core unerschwinglich ist. Auf diese Weise wird Ultrazentrifugen Verfügbarkeit in diesen Situationen unerschwinglich.
In diesem Protokoll Fraktionierung demonstrieren wir die Isolation der subzellularen Brüche ohne die Verwendung von Reinigungsmitteln Gefäss- und high-Speed Zentrifugation. Diese Methode erlaubt Forschern, die Plasmamembran, Mitochondrien und cytoplasmatische Komponenten einer eukaryotischen Zelle mit minimalen Kontamination zwischen den Fraktionen zu isolieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiten Sie Puffer und Reagenzien
Hinweis: Siehe Tabelle 1.
- Lösungen von Puffer A, Lyse Puffer B, Probenpuffer und Digitonin vorzubereiten.
- Bereiten Sie Puffer A durch Zugabe von 8,77 g NaCl und 50 mL HEPES (1 M, pH 7,4), 900 mL entionisiertem Wasser, Anpassung Endvolumen bis 1 L mit entionisiertem Wasser.
Hinweis: Endkonzentrationen sind 150 mM NaCl und 50 mM HEPES. - Bereiten Sie Lyse Puffer B durch Zugabe von 20 mL HEPES (1 M, pH 7,4), 0,75 g KCl, MgCl2, 2 mL Ethylenediaminetetraacetic Säure (0,5 M EDTA), 0,19 g 2 mL Ethylenglykol-Bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure (0,5 M EGTA) , 38,26 g Mannit und 23,96 g Saccharose zu 900 mL entionisiertem Wasser anpassen Endvolumen bis 1 L mit entionisiertem Wasser.
Hinweis: Endkonzentrationen sind 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, Mannit 210 mM und 70 mM Saccharose. - Bereiten Sie Probenpuffer durch Zugabe von 0,01 g Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) auf 10 mL Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) auf eine Endkonzentration von 0,1 % SDS.
- Bereiten Sie eine Stammlösung Digitonin durch Zugabe von 25 mg Digitonin, 100 mL entionisiertem Wasser (Endkonzentration ist 250 µg/mL).
- Speichern Sie alle Pufferlösungen bei 4 ° C und Digitonin bei-20 ° C bis zum Beginn des Experiments.
- Bereiten Sie Puffer A durch Zugabe von 8,77 g NaCl und 50 mL HEPES (1 M, pH 7,4), 900 mL entionisiertem Wasser, Anpassung Endvolumen bis 1 L mit entionisiertem Wasser.
- Bereiten Sie frische Lösungen von Protease und Phosphatase-Inhibitoren, Pufferlösungen vor der Zugabe zu Zellen hinzugefügt werden soll.
- Bereiten Sie eine Stammlösung Phenylmethanesulfonyl Fluorid (PMSF) durch Zugabe von 17,4 mg PMSF zu 1 mL 100 % Ethanol (Endkonzentration ist 100 mM).
Achtung: Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung und Vorsicht beim Umgang mit PMSF. PMSF ist gefährlich, wenn eingenommen und leicht gefährlich bei Hautkontakt (reizend), Augenkontakt (reizend) oder Inhalation; Es ist ätzend auf Augen und Haut. - Bereiten Sie einen handelsüblichen Protease Inhibitor Cocktail (100 ×) entsprechend den Anweisungen des Herstellers (siehe die Tabelle der Materialien).
- Bereiten Sie eine Stammlösung Natrium Orthovanadate (SOV) durch Zugabe von 92 mg SOV zu 1 mL entionisiertem Wasser (Endkonzentration beträgt 500 mM).
Achtung: Tragen Sie geeignetsten Schutzausrüstung und Vorsicht beim Umgang mit. SOV ist gefährlich bei Augenkontakt (reizend), verschlucken oder einatmen. Schweren Überbelichtung kann zu Tod führen.
- Bereiten Sie eine Stammlösung Phenylmethanesulfonyl Fluorid (PMSF) durch Zugabe von 17,4 mg PMSF zu 1 mL 100 % Ethanol (Endkonzentration ist 100 mM).
2. PBS waschen
- Konzentrieren und Zellen in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) vor der Fraktionierung waschen.
- Zentrifuge Zellsuspension mit einer entsprechenden Geschwindigkeit ein Pellet zu erstellen. Zum Beispiel Zentrifugieren Sie eine Aussetzung der U937 Zellen bei 400 × g für 10 min.
- Entfernen des Überstands, Aufschwemmen Zelle Pellet mit Raumtemperatur PBS-Puffer auf eine Endkonzentration von 4 × 106 Zellen/mL und Pipette vorsichtig zu Klumpen brechen.
- Zentrifugieren der Zellsuspension bei 400 × g für 10 min bis zum pellet-Zellen.
- Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie Zelle Pellet im eiskalten Puffer A auf eine Endkonzentration von 2 × 107 Zellen/mL.
Hinweis: Alle weiteren Schritte sollten bei 4 ° C durchgeführt werden oder auf Eis und alle Puffer sollte vorab gekühlt.
(3) zytosolischen Proteins Isolation
- Cytosolischen Proteine durch Inkubation mit dem Waschmittel Digitonin zu extrahieren.
- Unmittelbar vor der Wiederfreisetzung Zellen (Schritt 3.1.3) fügen Sie 10 µL des Bestandes PMSF (100 mM), 10 µL Protease Inhibitor (100 ×), 2 µL des Bestandes SOV (500 mM) und 100 µL Lager Digitonin (250 µg/mL), 878 µL Puffer A (Endkonzentrationen sind 1 mM PMSF , 1 × Protease-Inhibitor, 1 mM SOV und 25 µg/mL Digitonin; passen Sie das Endvolumen nach der Anzahl der verwendeten Zellen). Halten Sie die Lösung auf Eis bis zu Zelle Pellet.
- Die Zellsuspension bei 400 × g für 10 min Zentrifugieren und den Überstand zu entfernen.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet in A Pufferlösung mit Inhibitoren und Digitonin (vorbereitet in Schritt 3.1.1) auf eine Endkonzentration von 2 × 107 Zellen/mL Pipette vorsichtig zu Klumpen brechen.
- Inkubieren Sie die Zellsuspension auf eine durchgängige über Rotator bei 4 ° C für 20 min.
- Zentrifugieren der Zellsuspension bei 400 × g für 10 min. sammeln überstand und legen Sie sie in eine saubere Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren des gesammelten Überstands bei 18.000 × g für 20 min, Zelltrümmer pellet.
- Übertragen Sie den Überstand auf eine saubere Zentrifugenröhrchen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1.5 und 3.1.6, bis kein Pellet nach Zentrifugation gewonnen wird.
- Erfassen des Überstands, der cytosolischen Proteine enthalten und speichern es bei 4 ° C (kurzfristig) oder-20 ° C (langfristig).
- Entfernen Sie überschüssiges Digitonin und cytosolischen Proteine durch Zentrifugation.
- Aufzuwirbeln Sie das Digitonin-permeabilized Zelle Pellet (aus Schritt 3.1.5) in Puffer A auf eine Endkonzentration von 4 × 106 Zellen/mL und Pipette vorsichtig zu Klumpen brechen.
- Die Digitonin-permeabilized Zellsuspension bei 400 × g für 10 min Zentrifugieren und den Überstand zu entfernen.
Hinweis: Wiederholte Waschungen in Puffer A können durchgeführt werden, um überschüssige cytosolischen Verunreinigungen zu entfernen.
(4) Zelle Homogenisierung
- Brüten Sie die Zellen auf dem Eis in Lyse Puffer B und lösen Sie sie mit mechanischen Mitteln.
- Unmittelbar vor der Wiederfreisetzung Zellen (Schritt 4.1.2) hinzufügen 10 µL des Bestandes PMSF (100 mM) und 2 µL des Bestandes SOV (500 mM) 988 µL Lyse Puffer B (Endkonzentrationen sind 1 mM PMSF und 1 mM SOV; letzte Lautstärke für Anzahl von Zellen lysiert werden) und halten Sie Solu Tion auf Eis bis zu Zelle Pellet.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet (aus Schritt 3.2.2) in eiskalten Lyse B Pufferlösung mit PMSF und SOV (vorbereitet in Schritt 4.1.1) auf eine Endkonzentration von 4 × 106 Zellen/mL.
- Inkubieren Sie die Zellsuspension auf Eis für 30 min.
- Übertragen der Zellsuspension auf eine vorgekühlt Dounce-Homogenisator (mit einem eng anliegenden B Stößel) auf Eis und 40 Pässe mit den Homogenisator Stößel mit langsam, auch Schläge ausführen.
Hinweis: Alternativ nutzen Sie andere Mittel der mechanischen Zelle Lyse wie beschrieben im Diskussionsteil. - Sammeln Sie das Homogenat und übertragen Sie es auf eine saubere Zentrifugenröhrchen.
- Waschen Sie den Homogenisator Stößel und Rohr mit einem kleinen Volumen (1 bis 2 mL) der Lyse Puffer B und das Homogenat hinzufügen.
- Zentrifugieren Sie das Homogenat in 400 × g (oder die Mindestgeschwindigkeit erforderlich, um ununterbrochene Zellen pellet) für 10 min.
- Übertragen Sie den Überstand auf eine saubere Zentrifugenröhrchen.
Hinweis: Bleibt ein bedeutender Pellet wiederholen Sie die Schritte 4.1.4 durch 4.1.6 erhöhen den Ertrag der Brüche als detailliert im Abschnitt Diskussion. Das Protokoll kann hier angehalten, und das Homogenat kurzfristig (24 h) bei 4 ° C gelagert.
(5) differentielle Zentrifugation
- Zentrifugieren Sie das Homogenat mit steigender Geschwindigkeit, Zelltrümmer, isolieren Mitochondrien und Membran Brüche zu entfernen.
- Zentrifugieren des Überstands (aus Schritt 4.1.8) bei 500 × g für 10 min. Transfer Überstand auf eine saubere Zentrifugenröhrchen, und verwerfen alle Pellet.
- Zentrifugieren Sie überstand (aus Schritt 5.1.1) bei 1.000 × g für 10 min. Transfer des Überstands auf eine saubere Zentrifugenröhrchen, und verwerfen Sie alle Pellet.
- Zentrifugieren des Überstands (aus Schritt 5.1.2) bei 2.000 × g für 10 min. Transfer der Überstand auf eine saubere Zentrifugenröhrchen, und verwerfen alle Pellet.
- Zentrifugieren des Überstands (aus Schritt 5.1.3) bei 4.000 × g für 15 min. Transfer Überstand auf eine saubere Zentrifugenröhrchen, halten Pellet mit Mitochondrien.
- Aufschwemmen der Mitochondrien Pellet in einem kleinen Volumen (0.5\u20121 mL) der Lyse Puffer B.
- Zentrifugieren der suspendierten Pellet bei 4.000 × g für 15 min. Entfernen des Überstandes und Aufschwemmen der mitochondrialen Pellet in das gewünschte Endvolumen Probenpuffer (z.B., 250 bis 500 µL, je nach Größe des Pellet- und auf Wunsch (Konzentration).
- Zentrifuge des Überstands (aus Schritt 5.1.4) bei 4.000 × g für 15 min. Überstand auf eine saubere Zentrifugenröhrchen übertragen. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis keine Pellets nach Zentrifugation gewonnen wird.
- Drehen Sie den Überstand bei 18.000 × g 3 h.
- Entfernen Sie den Überstand zu, und halten Sie das Pellet, Membranproteine enthalten. Aufschwemmen der Membran-Pellets in einem kleinen Volumen (0,5-1 mL) der Lyse Puffer B.
- Zentrifugieren der suspendierten Pellets bei 18.000 × g für 1 h.
- Entfernen Sie den Überstand und Aufschwemmen der Membran Pellet in das gewünschte Endvolumen Probenpuffer (250 bis 500 µL, abhängig von der Größe der Pellets und der gewünschten Konzentration).
- Beschallen Sie die Probe-Pellets für 3 s im Eisbad bei einer Leistung von 5 (50 % von 125 W maximale Leistung bei 20 kHz, siehe Die Tabelle Materialien).
- Speichern Sie die Proben bei 4 ° C (kurzfristig) oder-20 ° C (langfristig).
- Die Proben für die Reinheit der Fraktionierung zu untersuchen, indem Sie ein western-Blot mit Antikörper gegen Protein Marker gefunden in den Zytoplasma, Mitochondrien und Membran der Zelle durchführen (siehe Abschnitt "repräsentative Ergebnisse").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Erfolgreiche Fraktionierung der undifferenzierten U9378 Zellen in Suspension angebaut wurde durchgeführt unter Verwendung des Protokolls genannten und in Abbildung 1dargestellt. Die Proben, die mit dieser Methode wurden westlichen befleckenden9 Nutzung eine nasse Übertragungsmethode auf eine Membran Polyvinylidene Fluorid (PVDF) unterzogen. Die Membran wurde anschließend mit Antikörpern gegen sondiert zytoplasmatischen, mitochondrialen Membran lokalisiert Protein-Marker (Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4). Die erfolgreiche Gewinnung von zytoplasmatischen Proteinen kann überprüft werden, durch Sondierung den Blot mit Antikörpern gegen die zytosolischen Proteins Glyceraldehyde-3-Phosphat-Dehydrogenase10 (GAPDH), normalerweise in das Zytoplasma der Zelle lokalisiert. Dargestellt durch Immunoblot (Abbildung 2, Bodenplatte, die Bahnen 1 und 2) GAPDH nur das Digitonin extrahiert entnehmen Sie Proben und Verunreinigung in der 4.000 × g Pellets (Abbildung 4; Bahnen 3 und 4 auf der Bodenplatte) oder 18.000 × eingehalten wird g Pellets (Abbildung 4, die Bahnen 5 und 6 auf der Bodenplatte). Die erfolgreiche Isolation von Mitochondrien zeigt in den 4.000 × g Pellets (Abbildung 4, die Bahnen 3 und 4 in der Mitte sondieren für die spannungsabhängige Anion Channel (VDAC), ein Protein in der mitochondrialen Außenmembran11, lokalisiert (Panel), während das Fehlen dieses Proteins in anderen Fraktionen das Fehlen der mitochondrialen Kontamination in der 18.000 × g Pellets oder Digitonin extrahierte Proben zeigt. Den Großteil dieses Protein befindet sich in der 18.000 × g Pellets (Abbildung 4; Bahnen 5 und 6 auf der Oberseite zeigt sondieren für die Na/K-ATPase α1-Untereinheit, Teil einer integralen Membran Heterodimer finden vor allem in der Plasmamembran12, Panel). Dieses Protein wird auch erkannt, in den 4.000 × g Pellets (Abbildung 4, Bahnen 3 und 4 von der Oberseite), mögliche Kontamination mit Plasmamembran, was darauf hindeutet, obwohl diese Möglichkeit unwahrscheinlich bei der niedrigen Drehzahl mit denen dieses Pellet wurde erhalten. Eine plausiblere Erklärung ist das Vorhandensein von endoplasmatischen Retikulum (ER) in der 4.000 × g Pellets Probe, wie Forscher13Transport von Na, K-ATPase Untereinheiten aus der Notaufnahme, der Plasmamembran gezeigt hat. Das Fehlen von Na, K-ATPase α1-Protein in den Digitonin extrahiert Proben (Abbildung 4; Bahnen 1 und 2 auf der Oberseite) zeigt die Reinheit dieser Fraktion.
Im Gegensatz zu den Ausgang während einer erfolgreichen Fraktionierung (Abbildung 2) beobachtet kann unsachgemäße Ausführung des Protokolls Kreuzkontamination zellulärer Komponenten (Bild 3, Bild 4) führen. Eine hohe Konzentration von Na, K-ATPase α1-Protein in den 4.000 × g Pellets, im Vergleich zu den 18.000 × g Pellets (Abbildung 3 {Oberblende, Lane 2-3] und Abbildung 4 b [Oberboden, Lanes 5-12]), zeigt, dass die Organellen Bruchteil hat mit Plasma Membranproteine kontaminiert worden. Das Vorhandensein von GAPDH in alle Teile außer dem Digitonin extrahiert zytoplasmatischen Probe (Abbildung 3 [Bodenplatte, Bahn 4] und Abbildung 4A [Bodenplatte, Lanes 5-12] ist ein Indikator für die Nichtbeachtung der zytoplasmatischen Proteine in den nachfolgenden Schritten entfernen.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Zelle Fraktionierung Protokoll. Eine Übersicht über die Zelle Fraktionierung Protokoll als ein Flussdiagramm dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: erfolgreiche Isolierung der U937 Zelle Zytoplasma, Organellen und Membrane Brüche. Westliche Flecken der Zelle Bruchteile von zwei U937 Zellkulturen isoliert und sondiert für Marker der Membran (Na, K-ATPase α1, Oberseite), Mitochondrien (VDAC, Mitte) und Zytoplasma (GAPDH, Bodenplatte). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Nichtbeachtung U937 Zellbestandteile fraktionieren. Westliche Flecken der Zelle Bruchteile isoliert von einer einzigen U937 Zellkultur zeigt Verunreinigung von den Organellen Bruch (Bahn 2) mit Na, K-ATPase α1 (Oberseite) und Verlust der cytoplasmatische Komponenten in der Überstand des Pellet-Membran (Bahn 4). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Cross-Kontamination der zytoplasmatischen und Membran-Komponenten während der Fraktionierung. (A) Fraktionierung versuchen mit zytoplasmatischen Kreuzkontamination von GAPDH Organelle (Bodenplatte, Bahnen 5-8) und Membran Brüche (Bodenplatte, Bahnen 9-12). (B) Fraktionierung versuchen mit Plasmamembran Kontamination von Na, K-ATPase in mitochondriale Fraktionen (Oberboden, Bahnen 5-8). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Name | Zusammensetzung (Lager Konzentration) | Endkonzentration |
| Puffer A | NaCl (150 mM) und HEPES (50 mM) | 1 x (identisch mit Lager) |
| Lyse Puffer B | HEPES (20 mM), KCl (10 mM), MgCl2 (2 mM), EDTA (1 mM), EGTA (1 mM), Mannit (210 mM) und Saccharose (70 mM) | 1 x (identisch mit Lager) |
| Probenpuffer | Sodium Dodecyl Sulfat (0,1 %) in Tris gepufferte Kochsalzlösung | 1 x (identisch mit Lager) |
| Digitonin | Digitonin (250 µg/ml) in entionisiertem Wasser | 25 µg/ml |
| Phenylmethanesulfonyl Fluorid | Phenylmethanesulfonyl Fluorid (100 mM) in 100 % igem ethanol | 1 mM |
| Protease-Inhibitor-Cocktail | Variiert (siehe Hersteller-Produkt-Datenblatt) | 1 X |
| Natrium-Orthovanadate | Natrium Orthovanadate (500 mM) in entionisiertem Wasser | 1 mM |
Tabelle 1: Puffer und Lösungen. Zusammensetzung der Puffer und Lösungen für das Verfahren.
| Protokoll-Schritt | Entscheidender Faktor | Erklärung | Potenzielle Probleme | Mögliche Lösungen |
| Handy-Vorbereitung | Zellkonzentration | Die optimale Konzentration der Zellen, die diese Methode verarbeiten kann muss für den Zelltyp mit gearbeitet wird, um die besten Ergebnisse zu erzielen empirisch ermittelt werden. | Hochkonzentrierte Zellsuspensionen können ineffizient Lyse führt zu niedrigen Erträgen von Mitochondrien und Membran Brüche führen. | Führen Sie erste Verfahren mit einer Reihe von Zelle Konzentrationen festzustellen, optimale Ergebnisse zu erzielen. |
| Vor der Verarbeitung von Zellen | Zellen in Suspension für die Fraktionierung Verfahren werden müssen, erfordert dies abnehmen adhärente Zellen von Kultur Oberflächen oder homogenisieren Gewebe. | Ineffiziente Verarbeitung kann zu geringen Bruchteil Erträge, cross-Kontamination zwischen subzellularen Brüche oder anderen unerwarteten Ergebnissen führen. | Stellen Sie sicher, dass die Ergebnisse in genügend Zellen für das Verfahren angewendet. Zählen von Zellen in Suspension Konzentration nach der Verarbeitung zu bestimmen und entsprechend anpassen. | |
| Wenn die angewendeten Methode der Plasmamembran Kompromisse, auftreten vorzeitige Lyse resultierende in cross-Kontamination der Brüche. | Sicherstellen Sie, dass die Plasmamembran Integrität gewahrt bleibt während der Zellernte mithilfe von Methoden, die Beschädigung der Zelle zu vermeiden. Prüfen Sie die Membran Integrität durch Untersuchung unter dem Mikroskop mit der Aufnahme einer Membran undurchlässig Färbung (z. B. Trypan blau). | |||
| Zytosolischen Proteins Isolation | Digitonin Konzentration | Die optimale Konzentration von Digitonin muss ermittelt werden, zur Lyse der Zellen zu vermeiden, gleichzeitig cytosolischen Proteingewinnung durch Porenbildung. | Hohe Konzentrationen von Digitonin führen zu Membran Bruch, Zelle Lysis und Kontamination der cytosolische Fraktion. Suboptimale Konzentrationen führt zu ineffizienten Extraktion der cytosolischen Proteine und mögliche Kontamination der nachfolgenden Brüche. | Die Konzentration von Digitonin sollte verringert werden, wenn übermäßige Zelle Lysis beobachtet wird. Ein kleine Zelle Pellet erhalten nach Digitonin Inkubation Membran Bruch angeben und Zell-Lyse. |
| Post-Extraktion-Waschanlagen | Entfernung von Digitonin und cytosolischen Proteine aus permeabilized Zellen muss durchgeführt werden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. | Nichtbeachtung der Zellen ausreichend waschen, nachdem cytosolischen Extraktion führen kann der cytosolischen Proteine zu anderen Fraktionen übernommen. | Zusätzliche wäscht mit Puffer eine Anhängerschaft Digitonin Inkubation wird verdünnen, Digitonin und verbleibende cytosolischen Proteine. | |
| Mitochondriale Isolation | Zell-Lyse | Lyse Methoden müssen gründliche zelluläre Inhalt freizugeben wobei mitochondriale Integrität für die spätere Isolierung sein. | Mechanische lyse der Zellen möglicherweise ineffizient, so dass Zellen intakt und daraus resultierenden niedrigen Renditen der mitochondrialen Proteine. | Die Höhe der Kraftaufwand zu lösen Zellen und Mitochondrien muss für verschiedene Zelltypen empirisch ermittelt werden. Suboptimale Lyse deutet auf große Pellets nach der Lyse Schritt erhalten (sowie kleine mitochondriale und Membran Pellets). Erhöhen Sie den Betrag der Kraft (Stößel Striche, Nadel Passagen, etc.), die Post-Lyse-Pellet zu minimieren. |
| Zu viel mechanische Kraft kann Mitochondrien, verunreinigen die Plasmamembran-Fraktion mit mitochondrialen Membranproteine lösen. | Verringern Sie die Menge an Kraft, wenn mitochondriale Protein-Marker in Membran Proben gefunden werden. | |||
| Schmutzentfernung | Intakte Zellen und größeren Fragmente müssen die Homogenat nach Lyse zur Vermeidung einer Kontamination mitochondriale Proben entfernt werden. | Mitochondriale Proben können mit zytoplasmatischen Komponenten oder Plasma Membranproteine verunreinigt, wenn Schmutz und intakte Zellen nicht entfernt werden, vor der Pelletierung Mitochondrien. | Erhöhen Sie die Anzahl der niedrigen Geschwindigkeit Zentrifugation Schritte vor der mitochondrialen Isolierung Spin. Wenn Mitochondrien Ertrag niedrig ist, ist es möglicherweise erforderlich zu speichern Pellets aus niedriger Drehzahl dreht über western-Blot für mitochondriale Marker zu überprüfen. | |
| Post-Isolierung-Waschanlagen | Mitochondriale Proben sollten gründlich gewaschen werden, um die kontaminierenden Verunreinigungen zu entfernen, die mit ihnen pellet kann. | Zelle Fragmente Mai aggregieren und assoziierten mit Mitochondrien, führt zu Kontamination der zytoplasmatischen überqueren oder Membranproteine. | Stellen Sie sicher, dass Pellets ausreichend mit Puffer gewaschen sind, um Verunreinigungen zu entfernen. | |
| Membran-Isolation | Zentrifugation Zeit | Zentrifugation Zeiten müssen erweitert werden, um die Ausbeute der Membran Bruchteil Probe zu erhöhen. | Abhängig von der Gesamtzahl der bearbeiteten Zellen und die Effizienz der Lyse der Zelle kann die Membran Bruchteil Probenausbeute niedrig sein. | Erhöhung der Zentrifugation Zeit kann die Ausbeute der Plasmamembran Bruchteil verbessern. Während die vorgeschlagene Zeit für eine große ab Menge Zellen ausreicht, können längere Zeit für kleinere Mengen notwendig sein. |
Tabelle 2: wichtige Schritte. Übersichtstabelle der Protokoll Treppen, mögliche Probleme und mögliche Lösungen für die Problembehandlung des Protokolls.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die Entwicklung dieses Protokolls entstand aus einer Unfähigkeit, mitochondriale trennen und Membran-Proben, mit handelsüblichen Kits für die Analyse von Protein-Lokalisierung während Necroptosis14. Die primäre Einschränkungen von vorgefertigten Kits sind ihre Unfähigkeit, auf die Bedürfnisse des einzelnen Forschers angepasst werden die Kosten pro Probe und begrenzte Anzahl von Proben können verarbeitet werden. Die hier vorgestellte Methode kann ohne den Einsatz von teuren Reagenzien und ohne die Notwendigkeit für teure Ausrüstung durchgeführt werden. Diese Methode kann skaliert werden, um beliebige Anzahl von Feldern unterzubringen und ist in der Lage ist, wird geändert, um die Bedürfnisse der Forscher. Dies ermöglicht den Ertrag der einzelnen Fraktionen erhöht werden, Anpassung der Maßnahmen, um die Forschungsarbeiten und Flexibilität in der Ausführung der Methode. Die Zugabe von Natrium Orthovanadate in den Puffern kann weggelassen werden, wenn nicht Staat Phosphorylierung von Proteinen in den letzten Proben untersucht werden. Die Aufnahme von SDS in den letzten Puffer kann ebenfalls weggelassen werden, wollen Forscher der Proben über Dichte Gradienten Zentrifugation weiter zu reinigen. Während wir nur diese Methode verwendet haben, um erfolgreich U937 Zellen, eine nicht-anhaftende Monocyte Zelllinie fraktionieren sollten das Verfahren mit mehreren Zelllinien und Gewebe, mit geringfügigen Änderungen funktionieren. Zellen in Suspension angebaut können in ähnlicher Weise pelleted werden, zu den U937 Zellen detailliert hier, während adhärenten Zelllinien Dissoziation von der Wachstumsoberfläche vor Beginn dieses Protokolls erfordern. Ebenso müssen Gewebe gründlich vor der Fraktionierung von Zellen homogenisiert werden. Dies kann durch die Verwendung eines lockeren sitzende Dounce Homogenisator, ein Potter-Elvehjem-Glas-Polytetrafluoroethene-Homogenisator oder durch andere (kommerzielle) Methoden15erreicht werden.
Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte in das Protokoll, die besondere Aufmerksamkeit, um optimale Ergebnisse und sortenreine Fraktionen (Tabelle 2) zu erhalten. Die Konzentration der Zellen, die hier empfohlenen (Schritte 2.1.2, 2.1.4, 3.1.3, 3.2.1 und 4.1.2) sind spezifisch für U937 Zellen und waren fest entschlossen, durch Versuch und Irrtum. Diese Werte müssen möglicherweise angepasst werden, um verschiedene Arten von Zellen zu berücksichtigen, wenn suboptimale Ergebnisse erzielt werden, wenn das Protokoll ausführen. Während der zytoplasmatischen Extraktionsschritt (Schritt 3.1) muss die Konzentration von Digitonin ausreicht, um die Plasmamembran permeabilize ohne komplett lyse der Zellen sein. Im Anschluss an diese Inkubation Zellen müssen gründlich gewaschen werden, um cytosolischen Proteine aus nachfolgenden Schritten entfernen oder Kontamination erfolgt in nachgelagerten Proben (Abbildung 4A). Die Homogenisierung Schritt (Schritt 4.1.4) mit irgendeiner Form von mechanischen Lyse durchgeführt werden kann, obwohl Ergebnisse hier vorgestellt wurden mit einem Dounce-Homogenisator erhalten. Eine Alternative zur Verwendung einer Dounce-Homogenisator ist immer wieder Zellen durchlaufen eine Schmalspur-Nadel (27 G empfohlen, 20-40 Pässe) bis ausreichend lyse der Zelle erreicht ist. Es möglicherweise notwendig, die Anzahl der Striche (oder Spritze Pässe) zu erhöhen, wenn ein großer Pellet ungebrochen Zellen nach Homogenisierung (Schritt 4.1.7) erworben wird. Forscher müssen wahrscheinlich die optimale Höhe der Homogenisierung für die Art der Zelle wird fraktioniert bestimmen. Entfernung der Zelltrümmer nach der Homogenisierung muss zur Vermeidung von Kontaminationen der Organelle Bruch mit Plasmamembran Komponenten (Abbildung 4 b) gründlich zu sein. In diesem Fall sollten zusätzliche langsamem Zentrifugation Schritte durchgeführt werden, um Zelltrümmer zu entfernen. Während der Entwicklung dieser Methode war bis zu 18 h der Zentrifugation bei 18.000 × g getestet, mit minimalen Anstieg der Plasmamembran Ertrag über die 3 h-Spins (Abbildung 2, Bahnen 5-6). Forscher finden es notwendig, die Zentrifugation Zeiten besser zu erhöhen der Plasmamembran Probe ergibt.
Die hier vorgestellte Methode ist begrenzt im Vergleich zu den gründlicheren Reinigungsverfahren, bei denen Ultrazentrifugation. Ohne den Einsatz von Isopycnic Dichte Zentrifugation ist es nicht möglich, einzelnen Organellen erhalten nach Zelle Homogenisierung zu trennen. Während die 4.000 × g Brüche enthalten Mitochondrien (wie durch die Anwesenheit des VDAC, Abbildung 2belegt), enthalten sie wahrscheinlich auch ER, Golgi und zusätzliche intrazellulären Organellen. Die Organelle Bruchteil sollte überprüft werden, durch den Einsatz von zusätzlichen Antikörper gegen Protein Marker für andere Organellen, ist dies von Bedeutung für die Forschung durchgeführt wird.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären kein Interessenkonflikt
Acknowledgments
Arbeit wurde unterstützt von NIH-1R15HL135675-01, Timothy J. LaRocca
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
References
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S. II, Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
- Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
- Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, 3.27.1-3.27.33 (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, aG., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
- Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
- McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
- Simpson, R. J.
