Summary
ここでは、細胞膜、細胞質、高速遠心分離を使用せず U937 細胞のミトコンドリアを分離するためのプロトコルを提案する.この手法は、蛋白質のローカリゼーションを介して免疫ブロットの後続受験内分を浄化するために使用できます。
Abstract
このプロトコル細胞遠心や無差別な洗剤を使用せず U937 細胞画分を取得する方法を詳しく説明します。このメソッドは、細胞質、ミトコンドリア、細胞膜を分離する差動遠心分離機械換散、ジギトニン低張性バッファーを利用します。プロセスは、研究者のニーズに対応することができます、安価で簡単です。このメソッドは、セル特殊な遠心分離機とどちらが極端に高くなることができる市販のキットの使用なしで蛋白質のローカリゼーションを決定する研究者になります。このゾル性細胞質の分離方法、細胞膜、ミトコンドリア蛋白質は、正常にひと単球細胞 u937 で利用させていただきました。
Introduction
蛋白質のローカリゼーションの確実な同定は、真核細胞の分子経路を調べてみる必要があります。内分を取得する方法は、興味の細胞成分を調べる研究者によって活用されます。
既存のセル分別方法の大半は一般に洗剤ベース1,2および遠心ベース3,4、5、することができます 2 つの広範なカテゴリに分類します。スピード ・精度・ コストによって区別されます。洗剤ベース プロトコルはセルの異なるコンポーネントを可溶化する洗剤の高強度化をバッファーの使用に頼る。これはサンプルを処理するための迅速かつ便利な方法で、数とサンプルのサイズが小さい場合は費用対効果にすることができます。細胞質膜/オルガネラ (混合割合)、細胞から核分画を分離するため洗剤ベース キットを購入できます。しかし、これらのキットに関連付けられているいくつかの欠点は、研究者への有用性を制限します。彼らは、簡単にセルの 1 つまたは 2 つのコンポーネントを分離するために設計されていますが、同時にサンプルからすべての画分を分離することができません。洗剤の使用を意味する血しょう膜、膜で囲まれた細胞内小器官が均等に溶こと、したがって、お互いから分離することができません。その他の合併症は、これらのキットは研究者が特定のアプリケーションのための条件を変更するを防止する独自のコンポーネントから発生します。最後に、彼らは、使用回数に制限が、非常に大きい実大施工実験高価かもしれません。非洗剤ベース キットは、ミトコンドリアの分離、膜を分離する設計されていませんし、サンプルの利回りは大幅密度遠心分離からのそれより小さいベース分離のプロトコル6,7.
分画遠心を利用する方法はより時間がかかるが、しばしば洗剤ベース キットよりも純粋な分数の結果。最初可 (膜小器官による汚染の結果) それらのない細胞から膜を分離するには、必要があります細胞コンポーネントを介して差動の分離に続いて非洗剤法による分離遠心分離、膜分離を達成する 100,000 × gの速度を必要とします。多くの場合、差動遠心分離細胞一部分または汚染物質の除去のさらに分離のための密度密度勾配遠心による従わなければなりません。これらのメソッドは、徹底的に、変更可能なコスト、時間消費、および分数とさらに浄化経由で密度勾配遠心分離用超遠心機の必要性の欠点が含まれます。ほとんど高速遠心分離機は、個々 の調査官とはしばしば共有、教育機関の機器のコアは、法外なコストです。したがって、超遠心機可用性はこのような状況で禁止になります。
この分別のプロトコルでは、内分可洗剤を使用せず、高速遠心分離なしの分離を示しています。このメソッドは、細胞膜、ミトコンドリアと分数の間の雑菌と真核細胞の細胞質成分を隔離して研究者になります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. バッファーおよび試薬
注: は、テーブル 1を参照してください。
- バッファー A、B の換散バッファー、サンプル バッファーおよびジギトニンのソリューションを準備します。
- バッファー A を準備するには、NaCl の 8.77 g と 900 mL の脱イオン水 50 mL HEPES (1 M、pH 7.4) の調整を脱イオン水 1 L に最終巻を追加します。
注: 最終濃度は、150 mM の NaCl と 50 mM HEPES。 - 換散バッファー B を準備するには、追加の HEPES (1 M、pH 7.4) の 20 mL KCl、MgCl2、エチレンジアミン四酢酸 (0.5 M の EDTA)、2 mL の 0.19 g の 0.75 g 2 mL エチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N'、N'-四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸 0.5 M)、38.26 g マンニトールと 900 mL の脱イオン水にショ糖 23.96 g 調整脱イオン水で 1 L に最終巻。
メモ: 最終的な濃度は、20 mM HEPES、10 mM KCl、MgCl22 mM、1 mM EDTA、1 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸、210 mM マンニトール 70 mM ショ糖です。 - 最終濃度 0.1 %sds のドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の 0.01 g を追加することによって含有トリス緩衝生理食塩水 (TBS) 10 mL にサンプル バッファーを準備します。
- ジギトニンの 25 mg を 100 mL の脱イオン水 (最終濃度は 250 μ g/mL) に追加することによってジギトニンの原液を準備します。
- 試験開始まで 4 ° C ですべての緩衝溶液と-20 ° C でジギトニンを格納します。
- バッファー A を準備するには、NaCl の 8.77 g と 900 mL の脱イオン水 50 mL HEPES (1 M、pH 7.4) の調整を脱イオン水 1 L に最終巻を追加します。
- 細胞に添加する前にバッファー ソリューションに追加するホスファターゼとプロテアーゼ阻害剤の新鮮なソリューションを準備します。
- 100% エタノール 1 mL に 17.4 mg PMSF を追加することによって phenylmethanesulfonyl フッ化物 (PMSF) の原液を準備 (最終濃度は 100 mM)。
注意: は、PMSF を処理するとき、適切な保護具と注意を着用します。PMSF は摂取した場合危険物や皮膚への接触 (刺激)、アイ ・ コンタクト (刺激) や吸入; の場合少し危険目と皮膚に腐食性です。 - 製造元の指示に従って市販プロテアーゼ阻害剤カクテル (100 ×) を準備 (材料の表を参照してください)。
- SOV の 92 mg を 1 mL の脱イオン水 (最終濃度は 500 mM) に追加することによってナトリウム バナジン (SOV) の原液を準備します。
注意: 適切な保護具を着用し、処理するときに注意を使用します。SOV はアイ ・ コンタクト (刺激)、摂取または吸入の場合危険です。深刻な露出過度は、死に至ることができます。
- 100% エタノール 1 mL に 17.4 mg PMSF を追加することによって phenylmethanesulfonyl フッ化物 (PMSF) の原液を準備 (最終濃度は 100 mM)。
2. PBS 洗浄
- 集中し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 分別前の細胞を洗ってください。
- ペレットを作成する適切な速度で細胞を懸濁液を遠心します。たとえば、400 × g 10 分間で U937 細胞の懸濁液を遠心分離機します。
- 上澄みを除去、4 × 106セル/mL と塊を破るに優しくピペットの最終濃度で室温 PBS で細胞ペレットを再懸濁します。
- 400 × g細胞のペレットを 10 分間で細胞懸濁液を遠心します。
- 上澄みを除去し、, 最終濃度 2 × 107セル/mL の氷冷バッファー A で細胞ペレットを再懸濁します。
注: これ以降の手順4 ° Cで行われるべきまたは氷とすべてのバッファーの前の冷蔵をする必要があります。
3. ゾル性細胞質蛋白質の隔離
- 洗剤ジギトニンと孵化によって細胞質蛋白質を抽出します。
- 直前のセル (ステップ 3.1.3) の株式 PMSF (100 mM)、プロテアーゼ阻害剤の 10 μ L の 10 μ L を追加 (100 ×)、2 μ L 在庫 SOV (500 mM) のバッファー A の 878 μ L にストック ジギトニン (250 μ g/mL) の 100 μ L (最終濃度 1 mM PMSF は、、1 × 1 mM SOV と 25 μ G/ml ジギトニン; プロテアーゼ阻害剤使用されているセルの数に従って最終的な音量を調整)。細胞ペレットに加えまで氷の上のソリューションを保持します。
- 400 × g 10 分間に細胞懸濁液を遠心分離し、上清を削除します。
- 阻害剤と 2 × 107セル/mL、塊を破るに優しくピペットの最終的な集中でジギトニン (3.1.1 の手順で準備) を含むバッファー A 溶液中の細胞ペレットを再懸濁します。
- 4 ° C、20 分でエンド オーバー エンド回転子に細胞懸濁液を孵化させなさい。
- 上澄み 400 × gで 10 分間収集に細胞懸濁液を遠心分離し、きれいな遠心管。
- 細胞デブリに 20 分間、18,000 × gで収集した上清を遠心します。
- きれいな遠心チューブに上清を転送します。
- 3.1.5 と 3.1.6 の手順を繰り返して、遠心分離後餌が得られない。
- ゾル性細胞質蛋白質を含む上清を収集して保存する (短期) の 4 ° C または-20 ° C (長期)。
- 遠心分離によって過剰ジギトニンとゾル性細胞質蛋白質を削除します。
- 4 × 106セル/mL と塊を破るに優しくピペットの最終濃度バッファー A に (ステップ 3.1.5) からジギトニン グリセリン細胞ペレットを再懸濁します。
- 400 × g 10 分間ジギトニン グリセリン細胞懸濁液を遠心分離し、上清を削除します。
注: 余分なゾル性細胞質の汚染物質を除去するバッファー A に繰り返し洗浄を実行できます。
4. セルの均質化
- 細胞換散バッファー B に氷の上をインキュベートし、機械的手段によってそれらを溶解します。
- 直前のセル (ステップ 4.1.2) の換散バッファー B 988 μ に株式 PMSF (100 mM) の 10 μ L と株式 SOV (500 mM) の 2 μ L を追加 (最終濃度 1 mM PMSF、1 mM SOV; 分離されているセルの数を合わせて最終的な音量を調整) し、ラブ細胞ペレットに加えまで氷のグローバリゼ-ション。
- 4 × 106セル/mL の最終的な集中で PMSF と SOV (4.1.1 の手順で準備) を含む氷冷換散バッファー B 溶液中 (からステップ 3.2.2) 細胞ペレットを再懸濁します。
- 30 分間氷の上細胞懸濁液を孵化させなさい。
- 氷の上 (とタイトなフィッティング B 杵) 中古冷蔵 Dounce ホモジナイザーに細胞懸濁液を転送し、遅いもストロークを使用してホモジナイザー杵と 40 パスを実行します。
注: またディスカッション セクションで詳細として機械セル換散の他の手段を利用します。 - 磨砕液を収集し、きれいな遠心管にそれを転送します。
- ホモジナイザー杵と少量 (1 ~ 2 mL) 換散バッファー B の管を洗って、磨砕液を追加します。
- 10 分間 400 × g (または餌の切れ目のない細胞に必要な最小速度) でホモジネートを遠心します。
- きれいな遠心チューブに上清を転送します。
注: 重要な餌まま手順として分数の収穫を増加する 4.1.6 を通じて 4.1.4 の場合ディスカッション セクションで詳しく説明します。プロトコルをここでは、一時停止できるし、磨砕液は短期 (24 h) の 4 ° C で保存します。
5. 差動遠心分離
- 細胞の残骸、分離ミトコンドリア膜の一部分を削除する速度を増加させる、ホモジネートを遠心します。
- 上清を 500 × g 10 分転送上澄みで (ステップ 4.1.8) からきれいな遠心チューブを遠心分離し、ペレットを破棄します。
- きれいな遠心チューブに上清 (ステップ 5.1.1) から 1,000 × gで 10 分間転送で上清を遠心し、ペレットを破棄します。
- 上清を 2,000 × gで 10 分間転送上澄みで (ステップ 5.1.2) からきれいな遠心チューブを遠心分離し、ペレットを破棄します。
- 遠心上清を 4,000 × gで 15 分転送上澄みで (ステップ 5.1.3) からきれいな遠心管、ミトコンドリアを含む維持ペレット。
- B. の換散バッファーの少量 (0.5\u20121 mL) でミトコンドリアのペレットを再懸濁します
- 4,000 × gで 15 分間削除で中断されたペレットを遠心上清と再懸濁します、ミトコンドリアのサンプル バッファー (例えば250 を 500 μ L、ペレットのサイズによって異なり、必要な目的の最終巻のペレット濃度)。
- 15 分間遠心する (ステップ 5.1.4) から 4,000 × gで上清は、きれいな遠心管に上清を転送します。この手順を繰り返して、遠心分離後餌が得られない。
- 3 時間 18,000 × gで上清をスピンします。
- 膜蛋白質を含んでいるペレットをして、上清を除去します。少量で膜ペレットを再懸濁します (0.5 – 1 mL) の換散バッファー b.
- 1 時間 18,000 × gで中断されたペレットを遠心します。
- 上澄みを除去し、サンプル バッファー (250 を 500 μ L、ペレットと望ましい集中のサイズによって) の必要な最終巻で膜ペレットを再懸濁します。
- 3 サンプル ペレットを超音波照射 5 のパワー設定で氷浴で s (20 kHz で 125 W の最大電力の 50% は、材料表を参照してください)。
- (短期) の 4 ° C または-20 ° C (長期) のサンプルを格納します。
- セルの細胞質やミトコンドリア膜コンパートメント内で見つかったタンパク質マーカーに対する抗体を用いたウエスタンブロットを実行することによって分別の純度のためのサンプルを調べる (代表的な結果を参照してください)。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
未分化 U937 細胞懸濁液で栽培の成功の分別は、上記の詳細し、図 1に示したプロトコルを使用して達成されました。この方法で得られた試料は、ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜に濡れた転送法を用いた西部しみが付く9に服従しました。膜はその後に対する抗体をプローブ細胞質、ミトコンドリア膜局在蛋白質のマーカー (図 2図 3図 4) とします。細胞質蛋白質を正しく抽出は、通常細胞の細胞質に局在ゾル性細胞質蛋白質のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ10 (GAPDH) に対する抗体としみを調査によって確認できます。(図 2; 下のパネル、1 と 2 のレーン) イムノブロットによってように、GAPDH は、サンプルと汚染なしは 4,000 × gペレット (図 4; 3 と下のパネル上の 4 レーン) または 18,000 ×で観察される抽出ジギトニンでのみ発見されます。gペレット (図 4; 5 と下のパネル上の 6 車線)。ミトコンドリアの分離を成功させるは、電位依存性アニオン チャネル (VDAC)11ミトコンドリア外膜に局在するタンパク質のプロービング 4,000 × gペレット (図 4; 3 と中央の 4 車線パネルの) 中に他の画分のこの蛋白質の不在、18,000 × gペレットまたはジギトニン抽出サンプルでミトコンドリアの汚染の欠如を示しています。18,000 × gペレット (図 4; 5 と 6 の上のレーンにあるこの蛋白質の大半を示しています atp アーゼ Na/K α 1 サブユニット、膜12、主に、不可欠な膜ヘテロダイマーの一部のプロービングパネル)。この蛋白質はまた 4,000 × gペレット (図 4; 上部パネルの 3 と 4 レーン) で検出されるこの可能性は、このペレットを得られた低速で可能性が高いが血しょう膜に可能な汚染を示唆しています。もっともらしい説明、小胞体 (ER) の存在 4,000 × gペレット サンプル Na, K ATPase 細胞膜に小胞体サブユニットの輸送研究者13によって実証されているようです。Na の欠如は、ジギトニン抽出サンプル (図 4; トップ ・ パネルに 1 と 2 のレーン) K ATPase α 1 蛋白はこの画分の純度を示しています。
成功した分別 (図 2) の時に観測された結果と対照をなしてプロトコルの不適切な実行は、(図 3図 4) 細胞成分のクロスコンタミネーションで起因できます。Na、K ATPase α 1 蛋白 4,000 × gペレット、18,000 × gペレットと比較して高濃度 (図 3 {上部パネル、レーン 2-3]、図 4 b [上部パネル、レーン 5-12])、細胞小器官の一部があることを示します膜タンパク質に汚染されています。ジギトニン抽出細胞質サンプル以外の端数の GAPDH の存在 (図 3 [下のパネル、レーン 4]、図 4 a [下のパネル、レーン 5-12] 障害以降の手順で細胞質蛋白質を削除するためのインジケーターです。
図 1: 図のセル分別のプロトコル。フロー グラフとして表されるセル分別のプロトコルの概要です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: U937 細胞細胞質、細胞小器官、膜画分の分離を成功させるします。細胞画分の西部のしみ 2 U937 細胞培養から分離された、膜 (Na, K-atpase α 1、上部パネル)、ミトコンドリア (VDAC、中央のパネル) と細胞質 (GAPDH、底板) のマーカーの調査。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: U937 細胞成分を分別する失敗します。Na, K-atpase α 1 オルガネラ分数 (2 車線) の汚染を示す単一 U937 細胞培養から分離された細胞画分の西部のしみ (上部パネル) と培養上清を膜ペレット (4 車線) の細胞質成分の損失。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 細胞質の汚染と膜成分を分別中クロスします。(A) 分別オルガネラ (下のパネル、レーン 5-8) および膜の一部分 (底板、9-12 の車線) の GAPDH の細胞質のクロス汚染を試みる。(B) 分別は Na, ミトコンドリア画分 (上部パネル、レーン 5-8) で K ATPase の膜汚染を試みます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 名 | 組成 (ストック濃度) | 最終濃度 |
| バッファー A | 塩化ナトリウム (150 mM) と HEPES (50 mM) | (株式と同じ) x 1 |
| 換散バッファー B | HEPES (20 mM)、KCl (10 mM)、MgCl2 (2 mM)、EDTA (1 mM)、グリコールエーテルジアミン四酢酸 (1 mM)、マンニトール (210 mM)、スクロース (70 mM) | (株式と同じ) x 1 |
| サンプル バッファー | ドデシル硫酸ナトリウム (0.1%) 含有トリス緩衝生理食塩水 | (株式と同じ) x 1 |
| ジギトニン | ジギトニン (250 μ g/ml) 脱イオン水 | 25 μ g/ml |
| Phenylmethanesulfonyl フッ化物 | 100% エタノールで Phenylmethanesulfonyl フッ化物 (100 mM) | 1 mM |
| プロテアーゼ阻害剤カクテル | 異なります (を参照してくださいメーカー製品シート) | 1 X |
| ナトリウム バナジン | 脱イオン水でナトリウム バナジン (500 mM) | 1 mM |
表 1: バッファーおよび解決します。バッファーおよびプロシージャの必要なソリューションの構成。
| プロトコル手順 | 重要な要因 | 説明 | 潜在的な問題 | 可能な解決策 |
| セル準備 | 細胞濃度 | この方法で処理することができますセルの最適な濃度は、最良の結果を得るために作業中のセル型の経験的に決定する必要があります。 | 高濃度細胞懸濁液は非能率的な換散、分数のミトコンドリア膜の低収量につながる可能性があります。 | 最良の結果を決定する細胞濃度の範囲での最初の手順を実行します。 |
| 細胞の前処理 | セル分別プロシージャの懸濁液である必要があります、これは文化面から付着性のセルをデタッチまたは組織を均質化を必要があります。 | 内分またはその他の予期しない結果の間のクロスコンタミネーションの割合が低い利回りで非効率的な処理があります。 | 手法の手順の十分なセルに結果を確認します。処理後の濃度を決定し、それに応じて調整する中断のセルをカウントします。 | |
| 手法は、細胞膜を侵害する早期溶解場合、分数のクロスコンタミネーションの結果です。 | 細胞の損傷を防ぐ方法を使用して、セル収穫中にプラズマ膜の完全性が維持されることを確認します。膜の不浸透性染料 (トリパン ブルー) などを含めると顕微鏡での検査、膜の完全性を確認します。 | |||
| ゾル性細胞質蛋白質の隔離 | ジギトニン濃度 | ジギトニンの最適濃度は、まだ細孔形成を通じてのゾル性細胞質蛋白質の抽出を許可している間細胞の換散を避けるために決定する必要があります。 | ジギトニンの高濃度は、膜破裂、セル換散および細胞質画分の汚染につながる可能性があります。最適な濃度は細胞質蛋白質の非効率的な抽出とそれ以降の分数の可能な交差汚染になります。 | 過剰な細胞溶解が観察される場合、ジギトニンの濃度を下げる必要があります。ジギトニン インキュベーション後得られた小細胞ペレットは膜破裂を示し、セル換散があります。 |
| ポスト抽出洗浄 | ジギトニンとグリセリンの細胞から細胞質蛋白質の除去は、交差汚染を避けるために行われなければなりません。 | ゾル性細胞質の抽出可能性があります後細胞を十分に洗浄する失敗をゾル性細胞質タンパク質他の画分に引き継ぐ。 | 追加の洗浄バッファーの次ジギトニン インキュベーション ジギトニンと残りのゾル性細胞質蛋白質を希釈します。 | |
| ミトコンドリアの分離 | セル換散 | 換散方法はそれに続く分離のミトコンドリアの整合性を維持しながら携帯電話の内容を解放する徹底した必要があります。 | 細胞の機械換散は、効率的なそのままで、ミトコンドリア蛋白質の低利回りの結果細胞を残してあります。 | 細胞を溶解し、ミトコンドリアを解放するために必要な力の量は、異なる種類の細胞の経験的に決定する必要があります。散のステップ後に得られる大きなペレット (と同様小さなミトコンドリアおよび膜ペレット) は、最適な換散を可能性があります。力 (杵ストローク、針の通路等) ポスト溶解ペレットを最小限に抑えるための量を増やします。 |
| あまり機械的な力がミトコンドリア、ミトコンドリア膜タンパク質と細胞膜画分の汚染を溶解させます。 | ミトコンドリア蛋白質のマーカーが膜サンプルで見つかった場合は、力の量を減らします。 | |||
| 瓦礫撤去 | そのままなセルおよび大きいフラグメントは、ミトコンドリアのサンプルの汚染を避けるために換散を次の磨砕液から削除する必要があります。 | ミトコンドリア サンプル残渣およびそのまま細胞がミトコンドリアをペレット化する前に削除されない場合が細胞質のコンポーネントまたは細胞膜タンパク質に汚れて可能性があります。 | ミトコンドリアの分離のスピンの前に低速遠心分離手順の数を増やします。ミトコンドリアの収量が低い場合、低速回転からペレットを保存し、西部のしみのミトコンドリア マーカーでチェックする必要があります。 | |
| 洗浄後の分離 | ミトコンドリアのサンプルは、彼らとペレットが汚染がれき撤去を徹底的に洗浄する必要があります。 | 細胞断片 5 月集計、ミトコンドリア、細胞のクロスコンタミネーションにつながると関連付けるまたは膜蛋白質。 | 汚染物質を除去するためのバッファーでのペレットの洗浄は十分に確保します。 | |
| 膜分離 | 遠心分離の時間 | 遠心回膜分画サンプルの収率を高めるために拡張する必要があります。 | 処理されたセルの合計数、セル換散の効率によって膜分画サンプル収量が低い可能性があります。 | 遠心分離の時間を増やすと、原形質膜画分の収量が向上します。推奨される時間は開始大量のセルのために十分ですより長い時間少量の必要があります。 |
表 2: 重要な手順を実行します。プロトコル手順、潜在的な問題およびプロトコルのトラブルシューティングの解決策の概要表。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルの開発は、ミトコンドリアを分離することができないと膜サンプル、市販キットを用いたネクロトーシス14中タンパク質の局在の解析から生まれた。既成のキットの主な制限は、サンプルとサンプルを処理することの限られた数、単価、各研究者のニーズに適応する無力です。ここで紹介した方法は、高価な試薬を使用せず、高価な機器の必要性なしに実行できます。このメソッドは、任意の数のセルに対応することができ、研究者のニーズに合わせて変更することが可能です。これにより、メソッドの実行で増加する各画分の収量、行われている研究の手順の仕立てと柔軟性。研究者は、最終的な試料中のタンパク質のリン酸化状態を検査していません場合ナトリウム バナジン バッファーの追加は省略できます。SDS の最後のバッファーに含めることは、研究者がさらに密度勾配遠心によるサンプルを浄化する場合に同様に省略できます。正常に非付着性単球細胞株 U937 細胞を分画するこのメソッドのみ使用しておりプロシージャは複数の細胞や組織、軽微な変更で動作するはず。細胞懸濁液の成長は、U937 細胞付着性のセルラインにこのプロトコルを開始する前に成長面から解離が必要ですが、ここでは、詳細に同様にペレットすることができます。同様に、組織する必要がありますを含む細胞の分別に徹底的に均質化します。これは、その他 (業務用)15ゆったり Dounce ホモジナイザー、ポッター エルベジェム ガラス polytetrafluoroethene ホモジナイザーを用いて実現できます。
最適な結果と純粋な分数 (表 2) 取得に細心の注意を必要とするプロトコルの重要なステップの数があります。細胞 (2.1.2、2.1.4、3.1.3、3.2.1、4.1.2 の手順) をここで推奨の濃度は U937 細胞に固有のものであり、試行錯誤しながら決定しました。これらの値は、プロトコルを実行するときに最適な結果が得られた場合、細胞の種類に合わせて調整する必要があります。細胞質抽出ステップ (ステップ 3.1) の間にジギトニン濃度が膜を permeabilize セルを完全に溶解せずに十分なである必要があります。このインキュベーション次以降のステップからゾル性細胞質蛋白質を削除するセルを徹底的に洗浄する必要があります。 または下流のサンプル (図 4 a) で交差汚染が発生します。均質化 (4.1.4 手順) 機械換散の任意のフォームで行うことが、結果をここで発表が Dounce ホモジナイザーが得られました。Dounce ホモジナイザーを使用する代わりに、繰り返し十分なセル換散まで狭いゲージ針 (27 G、推奨 20 40 パス) をセルを通過するを実現します。切れ目のない細胞の大きい餌は均質化 (ステップ 4.1.7) 後に得られる場合ストローク (または注射器パス) の数を増やす必要がある場合があります。研究者は、分別されているセルの型の均質化の最適な量を決定する必要があります。次の均質化細胞残屑の除去はオルガネラ膜コンポーネント (図 4 b) 分数の汚染を避けるために徹底的なする必要があります。この場合、追加の低速遠心分離手順を実行して、細胞の残骸を削除ください。このメソッドの開発中に 18,000 × gで遠心分離の 18 h までは、(図 2レーン 5 6) 3 h スピンをかけて膜収率の最小限の増加とテストされました。研究者膜サンプルの利回りより良いを取得する遠心分離の時間を増やす必要があります。
ここで紹介した方法は、超遠心法を含むより完全な浄化方法と比較して制限されています。密度密度遠心分離を使用せず、セル均質化後に得られた個々 の細胞器官の分離することはないです。4,000 × g分数を含むミトコンドリア (VDAC、図 2の存在によって立証される) と、彼らも含まれる小胞体、ゴルジ体とその他の細胞内小器官です。これは、行われている研究の重要性の場合、他の細胞器官のタンパク質マーカーを追加抗体の使用によってオルガネラ分数を確認必要があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
仕事に NIH-1R15HL135675-01 ティモシー j. ラロッカに支えられ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
References
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S. II, Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
- Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
- Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, 3.27.1-3.27.33 (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, aG., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
- Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
- McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
- Simpson, R. J.
