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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Fraccionamiento de la célula de las células U937 en ausencia de centrifugación de alta velocidad

Published: January 18, 2019 doi: 10.3791/59022
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para aislar la membrana plasmática, citoplasma y mitocondrias de las células U937 sin el uso de la centrifugación de alta velocidad. Esta técnica se puede utilizar para purificar fracciones subcelulares para la examinación subsecuente de la localización de la proteína mediante immunoblotting.

Abstract

Este protocolo nos detalladamente un método para obtener fracciones subcelulares de las células U937 sin el uso de ultracentrifugación o indiscriminadas detergentes. Este método utiliza buffers hipotónicas, digitonin, lisis mecánica y centrifugación diferencial para aislar el citoplasma, mitocondrias y membrana plasmática. El proceso puede escalarse para satisfacer las necesidades de los investigadores, es barato y sencillo. Este método permitirá a los investigadores a determinar la localización de la proteína en células sin centrífugas especializadas y sin el uso de kits comerciales, los cuales pueden ser prohibitivos. Hemos utilizado con éxito este método para separar citosólica, membrana del plasma y proteínas mitocondriales en la línea de celular del monocito humana U937.

Introduction

Identificación confiable de la localización de la proteína es a menudo necesaria al examinar vías moleculares en las células eucariotas. Métodos para obtener fracciones subcelulares son utilizados por los investigadores a examinar más de cerca los componentes celulares de interés.

La mayoría de los métodos de fraccionamiento celular existentes cae generalmente en dos amplias categorías, a base de detergente1,2 y basado en la ultracentrifugación3,4,5, que puede ser diferenciados por la velocidad, precisión y costo. Detergentes basado en protocolos se basan en el uso de buffers con el aumento de fuerza detergente para solubilizar componentes distintos de la célula. Este es un método rápido y conveniente para el procesamiento de las muestras y puede ser rentable si el número y tamaño de las muestras son pequeñas. Base de detergente kits pueden comprarse para aislar citoplásmico membrana/organelo (fracción mixta) y fracciones nucleares de las células. Sin embargo, varios inconvenientes asociados con estos kits de limitan su utilidad a los investigadores. Están diseñados para aislar fácilmente uno o dos componentes de la célula, pero son incapaces de aislar todas las fracciones de una muestra al mismo tiempo. El uso de detergentes hace que la membrana plasmática y los organelos de membrana-incluido va ser solubilizados igualmente y, por tanto, no pueden ser separados uno del otro. Una complicación adicional surge de los componentes patentados en estos kits que impide que los investigadores alterar condiciones para aplicaciones específicas. Por último, ellos están limitados en número de aplicaciones y pueden ser prohibitivos para los experimentos de escala más grandes. Kits base detergente no existen para el aislamiento de mitocondrias, sin embargo, no están diseñados para aislar la membrana del plasma y el rendimiento de la muestra es significativamente menor que el de centrifugación de densidad basado en protocolos de aislamiento6,7 .

Métodos que utilizan ultracentrifugación para obtener fracciones son más tiempo consumiendo, pero a menudo resultado en fracciones más que kits de detergente. Para aislar las membranas del plasma de las células sin primero solubilizando los (dando por resultado la contaminación con organelos de membrana) obliga a la lisis por un método sin detergente seguido de separación de componentes celulares mediante diferencial centrifugación, con aislamiento de membrana plasmática que requieren velocidades de 100.000 × g para llevar a cabo. En muchos casos, debe seguirse diferencial centrifugación isopicnica centrifugación gradiente de densidad para más separación de fracciones celulares o eliminación de contaminantes. Mientras que estos métodos son minuciosos y modificables, inconvenientes incluyen coste, el consumo de tiempo y la necesidad de una ultracentrífuga para la separación de fracciones y más purificación a través de densidad gradiente centrifugación. Centrifugadoras de alta velocidad la mayoría están en un costo prohibitivo para investigadores individuales y son a menudo compartidas, base de equipos en instituciones académicas. Así, la disponibilidad de la ultracentrífuga se convierte en prohibitiva en estas situaciones.

En este protocolo de fraccionamiento se demuestra el aislamiento de fracciones subcelulares sin el uso de detergentes de solubilización y sin centrifugación de alta velocidad. Este método permitirá a los investigadores aislar la membrana plasmática, las mitocondrias y componentes citoplasmáticos de una célula eucariota con mínima contaminación entre fracciones.

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Protocol

1. preparación de tampones y reactivos

Nota: Vea la tabla 1.

  1. Preparar soluciones de tampón de lisis B, tampón, tampón A y digitonin.
    1. Preparar el tampón A agregando 8,77 g de NaCl y 50 mL de HEPES (1 M, pH 7,4) a 900 mL de agua desionizada, ajustar el volumen final de 1 L con agua desionizada.
      Nota: Concentraciones finales son 150 mM de NaCl y 50 mM HEPES.
    2. Preparar el tampón de lisis B añadiendo 20 mL de HEPES (1 M, pH 7.4), 0,75 g de KCl, 0,19 g de MgCl2, 2 mL de ácido etilendiaminotetracético (EDTA de 0,5 M), 2 mL de etilenglicol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacético ácido (0.5 M EGTA) , 38,26 g de manitol y 23,96 g de sacarosa a 900 mL de agua desionizada, ajustar el volumen final de 1 L con agua desionizada.
      Nota: Concentraciones finales son 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM de MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, manitol de 210 mM y 70 mM sacarosa.
    3. Preparar el tampón de muestra mediante la adición de 0.01 g de sulfato de sodio dodecyl (SDS) a 10 mL de solución salina tamponada con tris (TBS) para una concentración final de 0.1% SDS.
    4. Prepare una solución de digitonin mediante la adición de 25 mg de digitonin a 100 mL de agua desionizada (concentración final es de 250 μg/mL).
    5. Guarde todas las soluciones tampón a 4 ° C y digitonin a-20 ° C hasta el comienzo del experimento.
  2. Preparar soluciones frescas de inhibidores de la proteasa y fosfatasa a añadirse a soluciones antes de la adición a las células.
    1. Prepare una solución de phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF) añadiendo 17,4 mg de PMSF 1 ml de etanol al 100% (concentración final es 100 mM).
      PRECAUCIÓN: Use equipo de protección adecuado y tenga cuidado al manipular el PMSF. PMSF es peligroso si se ingiere y ligeramente peligroso en caso de contacto con la piel (irritante), contacto con los ojos (irritante) o por inhalación; es corrosivo para los ojos y la piel.
    2. Preparar un cóctel de inhibidor de la proteasa disponibles comercialmente (100 ×) según las instrucciones del fabricante (véase la Tabla de materiales).
    3. Preparar una solución stock de ortovanadato de sodio (SOV) mediante la adición de 92 mg de SOV a 1 mL de agua desionizada (concentración final es de 500 mM).
      PRECAUCIÓN: Use equipo de protección adecuado y tenga cuidado cuando maneje. SOV es peligroso en caso de contacto con los ojos (irritante), ingestión o inhalación. La sobreexposición severa puede causar la muerte.

2. PBS lavado

  1. Concentrar y lavar las células en solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes del fraccionamiento.
    1. Centrifugue la suspensión celular a una velocidad adecuada para crear un diábolo. Por ejemplo, centrifugar una suspensión de células U937 en 400 × g por 10 min.
    2. Eliminar el sobrenadante, Resuspender el precipitado de células en PBS de la temperatura ambiente a una concentración final de 4 × 106 células/mL y la pipeta suavemente para romper grumos.
    3. Centrifugue la suspensión de células a 400 x g durante 10 minutos para que sedimenten las células.
    4. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en solución tampón de hielo frío A en una concentración final de 2 × 107 células/mL.
      Nota: Todos los pasos subsecuentes deben llevarse a cabo a 4 ° C o en hielo y todas las memorias intermedias deben ser previamente enfriada.

3. citosólica proteína aislamiento

  1. Extracto de proteínas citosólicas por incubación con digitonin detergente.
    1. Inmediatamente antes de la resuspensión de las células (paso 3.1.3) Añadir 10 μl de caldo PMSF (100 mM), 10 μl de inhibidor de proteasa (× 100), 2 μl de caldo SOV (500 mM) y 100 μl de digitonin stock (250 μg/mL) a 878 μl de buffer A (concentraciones finales están de 1 mM PMSF , 1 x inhibidor de la proteasa, 1 mM SOV y 25 μg/mL digitonin; ajustar el volumen final según el número de células se utiliza). Mantenga la solución en el hielo hasta que además de pellets celulares.
    2. Centrifugar la suspensión celular en 400 × g por 10 min y retirar el sobrenadante.
    3. Resuspender el precipitado de células en solución buffer A inhibidores y digitonin (preparado en el paso 3.1.1) a una concentración final de 2 × 107 células/mL, pipeta suavemente para romper grumos.
    4. Incubar la suspensión celular en un rotador de extremo a extremo a 4 ° C por 20 min.
    5. Centrifugar la suspensión celular en 400 × g durante 10 minutos recoge el sobrenadante y colocar en un tubo de centrífuga limpio.
    6. Centrifugar el sobrenadante recogido en 18.000 × g por 20 min para que sedimenten los detritos celulares.
    7. Transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio.
    8. Repita los pasos 3.1.5 y 3.1.6 hasta no pellet se obtiene tras centrifugación.
    9. Recoger el sobrenadante que contiene las proteínas citosólicas y almacenar a 4 ° C (corto plazo) o a-20 ° C (largo plazo).
  2. Retire el exceso digitonin y proteínas citosólicas por centrifugación.
    1. Resuspender el precipitado celular permeabilized digitonin (de paso 3.1.5) en tampón A, a una concentración final de 4 × 106 células/mL y la pipeta suavemente para romper grumos.
    2. Centrifugar la suspensión celular permeabilized digitonin en 400 × g por 10 min y retirar el sobrenadante.
      Nota: Repetidos lavados en tampón A pueden realizarse para eliminar el exceso de contaminantes citosólico.

4. homogeneización de la célula

  1. Incubar las células en hielo en tampón de lisis B y lyse por medios mecánicos.
    1. Inmediatamente antes de la resuspensión de las células (paso 4.1.2) Añadir 10 μl del stock PMSF (100 mM) y 2 μl de caldo SOV (500 mM) a 988 μl de tampón de lisis B (concentraciones finales son 1 mM PMSF y 1 mM SOV, ajustar el volumen final para acomodar el número de células que lisis) y solu ción en el hielo hasta además de pellets celulares.
    2. Resuspender el precipitado de células (del paso 3.2.2) en solución de tampón B de lisis fria con PMSF y SOV (preparado en el paso 4.1.1) en una concentración final de 4 × 106 células/mL.
    3. Incubar la suspensión celular en hielo durante 30 minutos.
    4. Transferir la suspensión de células a un homogeneizador de Dounce previamente enfriado (con un mortero de B ajustados) en hielo y realizar 40 pases con la mano del mortero homogeneizador con lento, incluso trazos.
      Nota: También puede utilizar otros medios de lisis celular mecánica tal como se detalla en la sección de discusión.
    5. Recoger el homogeneizado y transferirlo a un tubo de centrífuga limpio.
    6. Lave el mortero homogeneizador y el tubo con un pequeño volumen (1 a 2 mL) de tampón de lisis B y añadir al homogeneizado.
    7. Centrifugar el homogeneizado a 400 × g (o la velocidad mínima necesaria para que sedimenten las células intactas) durante 10 minutos.
    8. Transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio.
      Nota: Si una pelotilla significativa permanece 4.1.4 a través 4.1.6 para aumentar el rendimiento de fracciones como Repita los pasos detallados en la sección de discusión. El protocolo se puede detener aquí, y el homogenado almacenados a 4 ° C para el corto plazo (24 h).

5. diferencial centrifugación

  1. Centrifugar el homogeneizado a aumentar la velocidad para eliminar los residuos celulares, mitocondrias aisladas y fracciones de la membrana.
    1. Centrifugar el sobrenadante (de paso 4.1.8) a 500 × g por 10 min transferencia sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y descartar cualquier pelotilla.
    2. Centrifugar el sobrenadante (desde el paso 5.1.1) en 1.000 × g por 10 min transferencia el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y descartar cualquier pelotilla.
    3. Centrifugar el sobrenadante (de paso 5.1.2) a 2.000 × g por 10 min transferencia el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio y descartar cualquier pelotilla.
    4. Centrifugar el sobrenadante (de paso 5.1.3) a 4.000 x g durante 15 min. traslado sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio, mantener pellet que contiene mitocondrias.
    5. Resuspender el precipitado de las mitocondrias en un pequeño volumen (0.5\u20121 mL) de tampón de lisis B.
    6. Centrifugue el sedimento suspendido a 4.000 × g durante 15 minutos retirar el sobrenadante y resuspender el mitocondrial pelotilla en el volumen final deseado del tampón de muestra (por ejemplo, 250 a 500 μl, dependiendo del tamaño de la pelotilla y deseado concentración).
    7. Centrifugar el sobrenadante (de paso 5.1.4) a 4.000 x g durante 15 minutos transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga limpio. Repita este paso hasta que no pellet se obtiene tras centrifugación.
    8. Girar el sobrenadante a 18.000 × g durante 3 h.
    9. Quite el sobrenadante y mantener el pellet que contiene proteínas de la membrana. Resuspender el precipitado de la membrana en un pequeño volumen (0,5 – 1 mL) de lysis buffer B.
    10. Centrifugue el sedimento suspendido en 18.000 × g durante 1 hora.
    11. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de membrana en el volumen final deseado del tampón de muestra (250 a 500 μl, dependiendo del tamaño de la pelotilla y la concentración deseada).
  2. Someter a ultrasonidos las pelotillas de muestra de 3 s en un baño de hielo en un ajuste de potencia de 5 (50% de 125 W de potencia máxima a 20 kHz, ver La tabla de materiales).
  3. Almacenar las muestras a 4 ° C (corto plazo) o a-20 ° C (largo plazo).
  4. Examinar las muestras de pureza del fraccionamiento mediante la realización de un western blot utilizando anticuerpos contra marcadores de proteínas encontrados los compartimientos del citoplasma, mitocondrias y membrana de la célula (refiérase a la sección de resultados representativos).

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Representative Results

Fraccionamiento exitoso de células indiferenciadas de la8 de U937 cultivadas en suspensión fue logrado usando el protocolo detallado arriba e ilustrado en la figura 1. Las muestras obtenidas con este método fueron sometidas a western blot9 utilizando un método de transferencia mojado a una membrana de polivinilideno (PVDF) de fluoruro. La membrana fue posteriormente explorada con anticuerpos contra citoplasmática, mitocondrial y membrana localizada marcadores de proteínas (figura 2, figura 3, figura 4). La extracción exitosa de proteínas citoplásmicas se puede verificar mediante el sondeo del blot con anticuerpos contra la proteína citosólica gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa10 (GAPDH), normalmente localizada en el citoplasma de la célula. Como se muestra por el immunoblot (figura 2, panel inferior, carriles 1 y 2), GAPDH se encuentra sólo en el digitonin extraído muestras y ninguna contaminación se observa en los 4.000 × g gránulos (figura 4; carriles 3 y 4 en el panel inferior) o 18.000 × g pellets (figura 4, calles 5 y 6 en el panel inferior). Sondeo para el canal aniónico dependiente de voltaje (VDAC), una proteína localizada en la membrana mitocondrial externa11, muestra el aislamiento exitoso de mitocondrias en los 4.000 × g gránulos (figura 4; carriles 3 y 4 en el centro panel), mientras que la ausencia de esta proteína en otras fracciones muestra la falta de contaminación mitocondrial en los 18.000 × g balas o muestras extraídas de digitonin. Sondeo para la subunidad α1 de Na/K-ATPasa, parte de un heterodímero de membrana integral principalmente en la membrana plasmática12, muestra la mayoría de esta proteína en los 18.000 × g gránulos (figura 4, calles 5 y 6 en la parte superior panel). Esta proteína también se detecta en los 4.000 × g gránulos (figura 4; carriles 3 y 4 del panel superior), sugiriendo la posible contaminación con la membrana del plasma, aunque esta posibilidad es poco probable que a la baja velocidad con la que se obtuvo esta pelotilla. Una explicación más plausible es la presencia de retículo endoplásmico (ER) en el 4.000 × g gránulos de muestra, como transporte de Na, subunidades de K-ATPasa de la ER a la membrana plasmática ha sido demostrado por investigadores13. La falta de Na, proteína de α1 K-ATPasa en las muestras extraída de digitonin (figura 4; carriles 1 y 2 en el panel superior) demuestra la pureza de esta fracción.

En contraste con los resultados observados durante un exitoso fraccionamiento (figura 2), ejecución incorrecta del Protocolo puede resultar en contaminación de componentes celulares (figura 3, figura 4) cruzada. Una alta concentración de Na, proteína de α1 K-ATPasa en las 4.000 × g pelotillas, en comparación con los 18.000 × g gránulos (figura 3 {panel superior, carril 2-3] y Figura 4B [panel superior, carriles 5-12]), indica que la fracción de organelo tiene sido contaminados con proteínas de la membrana plasmática. La presencia de la GAPDH en cualquier fracción que no sean la muestra citoplásmica extraído de digitonin (figura 3 [panel inferior, carril 4] y Figura 4A [panel inferior, carriles 5-12] es un indicador de falla para eliminar proteínas citoplasmáticas en los pasos posteriores.

Figure 1
Figura 1: diagrama del Protocolo de fraccionamiento celular. Un resumen del Protocolo de fraccionamiento celular representado como un diagrama de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: aislamiento exitoso de citoplasma de las células U937, orgánulo y las fracciones de membrana. Manchas blancas /negras occidentales de fracciones celulares aislaron de dos cultivos de células U937 y sondeado para los marcadores de membrana (Na, K-ATPasa α1, panel superior), mitocondrias (VDAC, panel central) y citoplasma (GAPDH, panel inferior). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: falta de fraccionar los componentes celulares U937. Manchas blancas /negras occidentales de fracciones celulares aislados de un cultivo de células U937 solo mostrando la contaminación de la fracción de organelas (carril 2) con Na, K-ATPasa α1 (panel superior) y la pérdida de componentes citoplasmáticos en el sobrenadante de la pelotilla de la membrana (carril 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Cruz contaminación de citoplasmática y componentes de la membrana durante el fraccionamiento. Fraccionamiento (A) intente con contaminación cruzada citoplásmica de GAPDH en organelas (panel inferior, carriles 5-8) y fracciones de la membrana (panel inferior, carriles de 9-12). (B) fraccionamiento trate con la contaminación de la membrana plasmática de Na, K-ATPasa mitocondrial fracciones (panel superior, carriles 5-8). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre Composición (concentración de stock) Concentración final
Buffer A NaCl (150 mM) y HEPES (50 mM) 1 x (igual que stock)
Tampón de lisis B HEPES (20 mM), KCl (10 mM), MgCl2 (2 mM), EDTA (1 mM), EGTA (1 mM), manitol (210 mM) y sacarosa (70 mM) 1 x (igual que stock)
Tampón de muestra Dodecil sulfato de sodio (0.1%) en solución salina con tampón Tris 1 x (igual que stock)
Digitonin Digitonin (250 μg/ml) en agua desionizada 25 μg/ml
Fluoruro de Phenylmethanesulfonyl Fluoruro de Phenylmethanesulfonyl (100 mM) en etanol al 100% 1 mM
Cocktail de inhibidores de proteasa Varía (consulte la hoja de producto fabricante) 1 X
Ortovanadato de sodio Ortovanadato de sodio (500 mM) en agua desionizada 1 mM

Tabla 1: soluciones y Buffers. Composición de buffers y soluciones necesarias para el procedimiento.

Protocolo paso Factor crítico Explicación Posibles problemas de Posibles soluciones
Preparación de la célula Concentración de células La concentración óptima de células que puede procesar este método debe determinarse empíricamente para el tipo de célula está trabajando con para obtener los mejores resultados. Suspensiones celulares muy concentrado pueden causar lisis ineficiente, conduce a bajos rendimientos de las mitocondrias y la membrana fracciones. Realizar el procedimiento inicial con una gama de concentraciones de la célula para determinar los mejores resultados.
Tratamiento previo de las células Las células deben estar en suspensión para el procedimiento de fraccionamiento, esto requiere separar las células adherentes de las superficies de cultivo u homogeneizar los tejidos. Procesamiento ineficiente puede resultar en rendimientos de baja fracción, Cruz contaminación entre fracciones subcelulares u otros resultados inesperados. Asegúrese de que el método empleado resultados en suficientes células para el procedimiento. Contar las células en suspensión para determinar la concentración después de procesar y ajustar en consecuencia.
Si el método empleado compromete la membrana plasmática, lisis prematura pueden ocurrir, resultando en la contaminación de las fracciones cruzada. Mantener integridad de la membrana plasmática es durante la cosecha de células utilizando métodos que evitan dañar la célula. Verificar la integridad de la membrana por examen bajo un microscopio con la inclusión de un tinte impermeables de la membrana (como el azul tripán).
Aislamiento de proteínas citosólicas Concentración de Digitonin Se determinará la concentración óptima de digitonin para evitar la lisis de las células mientras sigue permitiendo la extracción de proteínas citosólicas a través de la formación de poros. Altas concentraciones de digitonin pueden llevar a ruptura de la membrana, lisis celular y la contaminación de la fracción citosólica. Concentraciones subóptimas resultará en ineficientes extracción de proteínas citosólicas y posible contaminación cruzada de las fracciones subsecuentes. La concentración de digitonin debe ser disminuida si se observaron lisis celular excesiva. Un pellet de células pequeñas obtenida tras incubación de digitonin puede indicar la ruptura de la membrana y lisis de la célula.
Post extracción lavado Eliminación de digitonin y proteínas citosólicas de las células permeabilized debe realizarse para evitar la contaminación cruzada. No lave las células suficientemente después citosólica extracción puede resultar en llevar sobre de proteínas citosólicas a otras fracciones. Adicional lava con Buffer un siguiente incubación digitonin diluiría digitonin y el resto de proteínas citosólicas.
Aislamiento mitocondrial Lisis de la célula Métodos de lisis deben ser profundo para liberar el contenido celular, manteniendo la integridad mitocondrial para el aislamiento posterior. La lisis mecánica de las células puede ser ineficaz, dejando las células intactas y que resulta en bajos rendimientos de proteínas mitocondriales. La cantidad de fuerza necesaria para lyse las células y liberar las mitocondrias debe determinarse empíricamente para diferentes tipos de células. Grandes gránulos obtenidos tras el paso de lisis (como pequeñas bolitas de membrana y mitocondriales) pueden indicar lisis subóptima. Aumentar la cantidad de fuerza (golpes de mano, pasos de aguja, etc.) para reducir al mínimo la pelotilla de la lisis de post.
Mucha fuerza mecánica puede lisar las mitocondrias, contaminando la fracción de la membrana plasmática con proteínas de la membrana mitocondrial. Disminuir la cantidad de fuerza si se encuentran marcadores de proteínas mitocondriales en las muestras de la membrana.
Retiro de escombros Las células intactas y fragmentos más grandes deben eliminarse desde el homogeneizado después de lisis para evitar contaminar las muestras mitocondriales. Muestras mitocondriales pueden contaminarse con componentes citoplasmáticos o proteínas de membrana plasmática si no se retiran escombros y las células intactas antes de la granulación de las mitocondrias. Aumentar el número de pasos de centrifugación de baja velocidad antes de la vuelta de aislamiento mitocondrial. Si la producción mitocondrial es baja, puede ser necesario salvar a pellets de baja velocidad giros y comprobar mediante inmunoblot para marcadores mitocondriales.
Aislamiento posterior al lavado Muestras mitocondriales se deben lavar bien para eliminar residuos contaminantes que pueden de la pelotilla con ellos. La célula fragmentos mayo agregado y asociado con las mitocondrias, a contaminación de citoplásmico cruzada o proteínas de membrana. Asegúrese de que pastillas son suficientemente lavadas con tampón para eliminar los contaminantes.
Aislamiento de membrana Tiempo de centrifugación Tiempos de centrifugación deben ampliarse para aumentar el rendimiento de la muestra de la fracción de membrana. Según el número total de células transformadas y la eficiencia de la lisis celular, membrana fracción muestra rendimiento puede ser bajo. Aumentar el tiempo de centrifugación puede mejorar el rendimiento de la fracción de la membrana plasmática. Mientras que el tiempo sugerido es suficiente para una gran cantidad a partir de las células, tiempos más largos pueden ser necesarios para cantidades más pequeñas.

Tabla 2: pasos críticos. Tabla Resumen de pasos del Protocolo, posibles problemas y posibles soluciones para el protocolo de resolución de problemas.

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Discussion

El desarrollo de este protocolo surge de la incapacidad de separar mitocondrial y las muestras de la membrana, usando kits disponibles en el mercado, para el análisis de la localización de la proteína durante la necroptosis14. Las limitaciones primarias de kits prefabricados son su incapacidad para adaptarse a las necesidades de los investigadores individuales, su costo por muestra y el número limitado de muestras capaces de ser procesados. El método presentado aquí se puede realizar sin el uso de reactivos caros y sin necesidad de equipo costoso. Este método puede adaptarse para acomodar a cualquier número de celdas y es capaz de ser modificado para adaptarse a las necesidades de los investigadores. Esto permite que el rendimiento de cada fracción que se aumente, flexibilidad y adaptación de medidas para la investigación se realiza en la ejecución del método. La adición de ortovanadato de sodio en los buffers puede omitirse si los investigadores no están examinando el estado de fosforilación de proteínas en las muestras finales. La inclusión de SDS en el tampón final además puede omitirse si los investigadores desean purificar más lejos la centrifugación gradiente a través de la densidad las muestras. Mientras que sólo hemos utilizado este método para fraccionar con éxito células U937, una línea de celular del monocito no adherente, el procedimiento debería funcionar con múltiples líneas de células y tejidos, con alteraciones menores. Las células cultivadas en suspensión pueden ser peleteadas semejantemente a las células U937 detalladas aquí, mientras que las líneas celulares adherentes requieren disociación de la superficie de crecimiento antes de iniciar este protocolo. Del mismo modo, los tejidos deben bien homogeneizados antes de fraccionamiento de que contiene las células. Esto puede lograrse mediante la utilización de un suelto Dounce homogeneizador, un homogeneizador de vidrio-del polytetrafluoroethene Potter-Elvehjem o por otros métodos (comercial)15.

Hay una serie de pasos críticos en el protocolo que necesita atención cuidadosa para obtener resultados óptimos y fracciones puras (tabla 2). La concentración de células recomienda aquí (pasos 2.1.2, 2.1.4, 3.1.3, 3.2.1 y 4.1.2) son específica de las células U937 y fueron determinada a través de ensayo y error. Estos valores pueden necesitar ajustar para acomodar a diversos tipos de células si se obtienen resultados subóptimos cuando ejecutar el protocolo. Durante la etapa de extracción citoplasmática (paso 3.1), la concentración de digitonin debe ser suficiente para permeabilizar la membrana plasmática sin lisis totalmente las células. Después de la incubación, las células deben lavarse minuciosamente para eliminar proteínas citosólicas de realizar los siguientes pasos o contaminación cruzada se producirá en las muestras de aguas abajo (Figura 4A). El homogeneización paso (4.1.4) puede realizarse con cualquier forma de lisis mecánica, aunque los resultados aquí presentados se obtuvieron con un homogeneizador de Dounce. Una alternativa al uso de un homogeneizador de Dounce es repetidamente pasar las células a través de una aguja de calibre estrecho (27 G recomendado, pasa de 20-40) hasta suficiente lisis celular se logra. Puede ser necesario aumentar el número de golpes (o jeringa pasadas) si se obtiene un pellet grande de células intactas después de la homogeneización (paso 4.1.7). Los investigadores probablemente tendrá que determinar la cantidad óptima de homogeneización para el tipo de célula se fracciona. Eliminación de restos celulares tras la homogeneización debe ser cuidadosa para evitar la contaminación de la fracción del organelo con componentes de la membrana plasmática (Figura 4B). Si esto ocurre, deben realizarse pasos de centrifugación de baja velocidad adicional para eliminar los desechos celulares. Durante el desarrollo de este método fue probado hasta 18 h de centrifugación a 18.000 × g , con un mínimo aumento del rendimiento de la membrana plasmática en las vueltas de 3 h (figura 2, carril 5-6). Los investigadores pueden encontrar necesario aumentar el tiempo de centrifugación para obtener mejores rendimientos de la muestra de membrana plasmática.

El método presentado aquí es limitado en comparación con los métodos de purificación más profundo con ultracentrifugación. Sin el uso de centrifugación de densidad isopicnica no es posible separar organelos individuales obtenidos después de la homogeneización de la célula. Mientras que las 4.000 × g fracciones contienen mitocondrias (según lo evidenciado por la presencia de VDAC, figura 2), es probable que también contienen ER, golgi y orgánulos intracelulares adicionales. La fracción de organelo debe ser verificada por el uso de anticuerpos adicionales para marcadores de proteínas de otros organelos si esto es de importancia para la investigación que se realiza.

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Disclosures

Los autores no declaran conflicto de intereses

Acknowledgments

Trabajo fue financiado por los NIH-1R15HL135675-01 para Timothy J. LaRocca

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Digitonin TCI Chemicals D0540 For Cytoplasm Extraction
D-Mannitol Sigma-Aldrich M4125 For Lysis buffer B
Dounce homogenizer VWR 22877-282 For Homogenization
end-over-end rotator Barnstead N/A For Cytoplasm Extraction
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Alfa Aesar J61721 For Lysis buffer B
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E7889 For Lysis buffer B
GAPDH (14C10) Cell Signalling Technologies 2118 For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000
HEPES VWR J848 For Lysis buffers A and B
KCl Sigma-Aldrich P9541 For Lysis buffer B
MgCl2 Alfa Aesar 12315 For Lysis buffer B
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565 For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000
NaCl Sigma-Aldrich 793566 For Lysis buffer A
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) VWR M145 For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer
probe sonicator Qsonica Q125-110 For Final Samples
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML For Cytoplasm Extraction
refrigerated centrifuge Beckman-Coulter N/A
Sodium dodecyl sulfate (SDS) VWR 227 For Sample buffer
sodium orthovanadate (SOV) Sigma-Aldrich 450243 For Lysis buffers A and B
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 For Lysis buffer B
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 788 For Sample buffer
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661 For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000

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References

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Bioquímica número 143 fraccionamiento celular mitocondria membrana citoplasma organelos centrifugación U937
Fraccionamiento de la célula de las células U937 en ausencia de centrifugación de alta velocidad
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McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska Jr,, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation. J. Vis. Exp. (143), e59022, doi:10.3791/59022 (2019).

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