Summary
Burada, plazma zarı, sitoplazma ve yüksek hızlı Santrifüjü kullanmanıza gerek kalmadan U937 hücrelerinin mitokondri izole etmek için bir protokol mevcut. Bu tekniği yoluyla protein yerelleştirme immunoblotting sonraki incelenmesi için hücre altı fraksiyonları arındırmak için kullanılabilir.
Abstract
Bu protokol için ultrasantrifüj ya da gelişigüzel kullanımı olmadan U937 hücrelerinin hücre altı fraksiyonları elde etmek için bir yöntem ayrıntı. Bu yöntem hipotonik arabellekleri, digitonin, mekanik lizis ve sitoplazma, mitokondri ve plazma zarı izole etmek için fark Santrifüjü kullanır. Bu işlem araştırmacıların ihtiyaçlarını karşılamak için ölçeklendirilebilir, ucuz ve basit. Bu yöntem araştırmacılar protein yerelleştirme hücrelerdeki özel santrifüjler ve ticari kitleri, bunların her ikisi de çok pahalı olabilir kullanımı olmadan belirlemek için izin verir. Biz başarıyla bu yöntemi sitozolik ayırmak için plazma zarı ve mitokondrial proteinler insan monosit hücre kültürünü U937 kullandık.
Introduction
Protein yerelleştirme güvenilir kimlik kez ökaryotik hücrelerde moleküler yolları incelerken gerekli değildir. Hücre altı fraksiyonları edinme yöntemleri ilgi hücresel bileşenleri daha yakından incelemek için araştırmacılar tarafından kullanılmaktadır.
Varolan hücre ayırma yöntemleri çoğunluğu genellikle iki geniş kategoriye, deterjan tabanlı1,2 ve hangi-ebilmek var olmak ultrasantrifüj tabanlı3,4,5, ayrılır hızlı, hassas ve maliyet tarafından ayrıştırılan. Deterjan tabanlı protokolleri ile hücrenin farklı bileşenleri solubilize için deterjan gücü artan arabellek kullanımını güveniyor. Bu işleme örnekleri için hızlı ve uygun bir yöntem ve maliyet örnekleri boyutunu ve sayısını küçük iseniz etkili olabilir. Deterjan tabanlı kitleri sitoplazmik, membran/organel (karışık fraksiyonu) ve nükleer kesirler hücreleri izole etmek için satın alınabilir. Ancak, bu kitleri ile ilişkili çeşitli sakıncaları kullanışlılığı araştırmacılar için sınırı. Onlar kolayca bir veya iki bileşen hücrenin yalıtmak için tasarlanmıştır, ama aynı anda bir örnek üzerinden tüm kesirler yalıtma aciz. Plazma zarı ve organelleri membran içine eşit çözündürüldükten ki deterjan kullanımı anlamına gelir ve bu nedenle, birbirinden ayrılması için. Araştırmacılar koşulları belirli uygulamalar için değiştirmesini engelleyen bu kitleri özel bileşenler ek bir komplikasyon kaynaklanmaktadır. Son olarak, kullanım sayısı sınırlı ve daha büyük ölçekli deneyler için çok pahalı olabilir. Mitokondri yalıtım için sigara-deterjan tabanlı kitleri var, ancak, bunlar plazma zarı yalıtmak için tasarlanmamıştır ve örnek verim önemli ölçüde yoğunluğu Santrifüjü bundan daha az yalıtım protokolleri6,7 dayalı .
Ultrasantrifüj kesirler edinmek yararlanın yöntemleri vardır daha fazla zaman tüketmek, ama sık sık deterjan tabanlı kitleri daha saf kesirler sonuçlanabilir. Plazma membran hücrelerden olmadan ilk onları (kirlenme membran organelleri ile sonuçlanan) çözücü yalıtmak için ayrılması hücresel bileşenleri ile fark tarafından takip bir deterjan yöntemi tarafından lysed etmelerini gerektirir Santrifüjü — gerçekleştirmek için 100.000 × g hızına gerektiren plazma membran izolasyon ile. Birçok durumda, farklı aralıklarla isopycnic yoğunluğu degrade Santrifüjü hücresel kesirleri veya kirleticiler kaldırılması tarafından daha fazla ayrılması için izlenmesi gerekir. Bu yöntemlerin tam ve dikkatli ve değiştirilebilir olmakla birlikte, sakıncaları maliyet, zaman tüketimi ve kesirler ve daha fazla arıtma ile yoğunluk gradient Santrifüjü ayrılması için bir ultracentrifuge ihtiyacını içerir. En yüksek hızlı santrifüjler bireysel müfettişler ve are sık sık paylaşılan, akademik kurumlar ekipman çekirdek için engelleyici bir maliyeti vardır. Böylece, ultracentrifuge durumu bu durumda engelleyici olur.
Bu ayırma protokol için hücre altı fraksiyonları deterjanlar çözücü kullanımı ve yüksek hızlı Santrifüjü olmadan yalıtım göstermektedir. Bu yöntem araştırmacılar plazma zarı, mitokondri ve kesirler arasında en az kirlenme bir ökaryotik hücrenin sitoplazmik bileşenleri izole etmek için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlayın arabellekleri ve Kimyasalları
Not: Bkz. Tablo 1.
- Arabellek A, lizis arabellek B, örnek arabellek ve digitonin çözümleri hazırlayın.
- Arabellek A NaCl 8,77 g ve 900 mL deiyonize su, HEPES (1 M, pH 7,4) 50 mL deiyonize su ile 1 m'ye son hacim ayarlamak ekleyerek hazırlayın.
Not: 150 mM NaCl ve 50 mM HEPES son konsantrasyonları vardır. - Etilen glikol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, n 2 mL KCl, MgCl2, Ethylenediaminetetraacetic asit (0,5 M EDTA), 2 mL 0,19 g, 0.75 g (1 M, pH 7,4), HEPES 20 mL ekleyerek lizis arabellek B hazırlamak ', N'-tetraacetic asit (0, 5 M EGTA) , 38.26 g doz mannitol ve 23.96 g sükroz 900 mL deiyonize su için ayarlamak için 1 L son hacim deiyonize su ile.
Not: 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 210 mM mannitol ve 70 mM sükroz son konsantrasyonları vardır. - Örnek arabellek 0,01 g Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) ekleyerek tris tamponlu tuz (TBS) 10 mL % 0,1 SDS son bir konsantrasyon için hazırlayın.
- Digitonin 25 mg 100 mL deiyonize su (son 250 µg/mL bölgedir) için ekleyerek digitonin stok çözeltisi hazırlamak.
- 4 ° C'de tüm tampon çözeltiler ve digitonin-20 ° C'de deney başlayana saklayın.
- Arabellek A NaCl 8,77 g ve 900 mL deiyonize su, HEPES (1 M, pH 7,4) 50 mL deiyonize su ile 1 m'ye son hacim ayarlamak ekleyerek hazırlayın.
- Tampon çözeltiler hücreleri için ek Önce eklenecek fosfataz ve proteaz inhibitörleri taze çözümleri hazırlayın.
- % 100 etanol için 1 mL 17.4 mg PMSF ekleyerek phenylmethanesulfonyl florür (PMSF) stok çözeltisi hazırlamak (son konsantrasyonu ise 100 mM).
Uyarı: uygun koruyucu ekipman ve egzersiz dikkat PMSF işlerken giymek. PMSF yutulur Eğer tehlikeli ve Ciltle temas (tahriş edici), göz teması (tahriş edici) veya inhalasyon durumunda biraz tehlikeli olduğunu; gözleri ve cildi aşındırıcı. - Üreticinin yönergelerine göre piyasada bulunan proteaz inhibitörü kokteyl (100 ×) hazırlamak ( Tablo reçetesigörmek).
- Sodyum orthovanadate (SOV) hisse senedi bir çözüm için 1 mL deiyonize su (son 500 mM bölgedir) SOV 92 mg ekleyerek hazırlayın.
Uyarı: uygun koruyucu donanımları ve ele alırken dikkatli olun. SOV göz teması (tahriş edici), yenmesi veya inhalasyon durumunda zararlıdır. Şiddetli aşırı pozlama ölüme neden olabilir.
- % 100 etanol için 1 mL 17.4 mg PMSF ekleyerek phenylmethanesulfonyl florür (PMSF) stok çözeltisi hazırlamak (son konsantrasyonu ise 100 mM).
2. PBS yıkama
- Konsantre ve hücreleri fosfat tamponlu tuz (PBS) ayırma önce yıkayın.
- Santrifüj hücre süspansiyon bir Pelet oluşturmak için uygun bir hızda. Örneğin, bir süspansiyon U937 hücre vasıl 400 × g 10 dk santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak için hücre Pelet oda sıcaklığında PBS, 4 × 106 hücre/mL ve pipet yavaşça kümeleri kadar kırmak için son bir konsantrasyon içinde resuspend.
- Hücre süspansiyon hücre cips için 10 dakika için 400 × g , santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet buz gibi bir arabellek olarak 2 × 107 hücre/mL A son bir konsantrasyon, resuspend.
Not: Tüm sonraki adımları 4 ° C de gerçekleştirilmesi gerektiğini veya buz ve tüm arabellekleri önceden soğutulmuşolmalıdır.
3. sitozolik Protein yalıtım
- Kuluçka deterjan digitonin ile tarafından sitozolik protein ayıklayın.
- Hemen hücreleri (adım 3.1.3) resuspension önce PMSF (100 mM), proteaz inhibitörü 10 µL stokunun 10 µL ekleyin (100 ×), 2 µL stokunun SOV (500 mM) ve hisse senedi digitonin (250 µg/mL) arabelleği A 878 µL için 100 µL (son konsantrasyonları vardır 1 mM PMSF , 1 × proteaz inhibitörü, 1 mM SOV ve 25 µg/mL digitonin; Son kullanılan hücre sayısı göre ses seviyesini). Çözüm buz üzerinde ek hücre Pelet kadar tutun.
- Hücre süspansiyon vasıl 400 × g 10 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
- Hücre Pelet inhibitörleri ve (3.1.1. adımda hazırlanan) digitonin, 2 × 107 hücre/mL, pipet yavaşça kümeleri kadar kırmak için son bir konsantrasyon içeren arabellek A çözüm resuspend.
- Hücre süspansiyon için 20 dk 4 ° C'de bir bitti sıra rotator üzerinde kuluçkaya.
- 400 × g 10 dk. toplamak için de hücre süspansiyon süpernatant santrifüj kapasitesi ve bir temiz santrifüj tüpü yerleştirin.
- Toplanan süpernatant 18.000 × g hücresel enkaz cips için 20 dakika için de santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant temiz santrifüj tüpü aktarın.
- Hiçbir Pelet Santrifüjü elde edilen 3.1.5 ve 3.1.6 tamamlayana dek.
- Sitozolik protein içeren süpernatant toplamak ve 4 ° c (kısa vadeli) veya -20 ° C (uzun vadeli) saklayın.
- Aşırı digitonin ve sitozolik protein Santrifüjü tarafından kaldırın.
- Hücre digitonin permeabilized Pelet (Kimden adım 3.1.5) arabelleği A 4 × 106 hücre/mL ve pipet yavaşça kümeleri kadar kırmak için son bir konsantrasyon, resuspend.
- Digitonin permeabilized hücre süspansiyon vasıl 400 × g 10 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
Not: Aşırı sitozolik kirletici kaldırmak için tekrar tekrar yıkar arabelleği A gerçekleştirilebilir.
4. hücre homojenizasyon
- Hücre lizis tampon B buz üzerinde kuluçkaya ve onları mekanik yollarla parçalayıcı.
- Hemen hücreleri (adım 4.1.2) resuspension önce PMSF (100 mM) stokunun 10 µL ve stok SOV (500 mM) 2 µL lizis arabellek B 988 µL için ekleyin (son konsantrasyonları 1 mM PMSF ve 1 mM SOV; lysed hücre sayısını karşılamak için son ses seviyesini) ve solu tutmak Tion buz kadar hücre Pelet için ek.
- Buz gibi soğuk lizis arabellek B çözüm PMSF ve SOV (4.1.1 adımda hazırlanan) 4 × 106 hücre/mL son bir konsantrasyon içeren hücre Pelet (Kimden adım 3.2.2) resuspend.
- Hücre süspansiyon 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
- Yavaş, hatta konturları kullanarak homogenizer havaneli ile 40 geçer gerçekleştirmek ve buz üzerinde önceden soğutulmuş bir Dounce homogenizer (dar B havaneli ile) hücre süspansiyon transfer.
Not: Alternatif olarak tartışma bölümünde ayrıntılı olarak mekanik hücre lizis diğer araçlar kullanmaktadır. - Homogenate toplamak ve temiz santrifüj tüpü aktar.
- Homogenizer havaneli ve tüp lizis arabelleği B küçük hacimli (1-2 mL) ile yıkayın ve homogenate için ekleyin.
- Homogenate 400 × g (ya da kesilen hücreleri cips için gereken en düşük hız) santrifüj kapasitesi 10 dakikadır.
- Süpernatant temiz santrifüj tüpü aktarın.
Not: önemli bir Pelet 4.1.4 4.1.6 kesir olarak verim artışı ile arasındaki adımları yineleyin kalırsa tartışma bölümünde ayrıntılı. Protokol burada duraklatıldı ve homogenate 4 ° C'de depolanan kısa vadeli (24 saat).
5. farklı aralıklarla
- Hücresel artıkları, ayrı tutulan mitokondri ve membran kesirler kaldırmak için hızlarını artırarak, homogenate santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant (Kimden adım 4.1.8) vasıl 500 × g için 10 dk. Transfer süpernatant temiz santrifüj tüpü için santrifüj kapasitesi ve herhangi bir Pelet atın.
- 1000 × g 10 dk. Transfer için de (Kimden adım 5.1.1) süpernatant süpernatant temiz santrifüj tüpü için santrifüj kapasitesi ve herhangi bir Pelet atın.
- Süpernatant (Kimden adım 5.1.2) vasıl 2000 × g 10 dk. Transfer süpernatant temiz santrifüj tüpü için santrifüj kapasitesi ve herhangi bir Pelet atın.
- Süpernatant (Kimden adım 5.1.3) 4.000 × g 15 dk. Transfer süpernatant için de bir temiz santrifüj tüpü, mitokondri içeren pelet tutmak için santrifüj kapasitesi.
- Mitokondri Pelet lizis arabellek B. bir küçük hacminde (0.5\u20121 mL) resuspend
- 4.000 × g 15 dk. Kaldır, askıya alınan Pelet süpernatant ve resuspend santrifüj kapasitesi mitokondrial Pelet örnek arabellek (Örneğin, Pelet boyutuna bağlı olarak ve istenen 250-500 µL, istenen son hacmine konsantrasyon).
- 15 dakika süreyle santrifüj (Kimden adım 5.1.4) 4.000 × g de süpernatant temiz santrifüj tüpü süpernatant aktarın. Hiçbir Pelet Santrifüjü elde edilir kadar bu adımı yineleyin.
- Süpernatant 18.000 × g 3 h için de spin.
- Süpernatant kaldırın ve zar proteinleri içeren pelet tutun. Membran Pelet küçük bir birim resuspend (0.5-1 mL) B. lizis tampon
- 18.000 × g 1 h için de askıya alınmış Pelet santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak ve istenen son hacim örnek arabelleği (250-500 µL, pelet ve istenen konsantrasyon boyutuna bağlı olarak) membran Pelet resuspend.
- Örnek granül 3 için solüsyon içeren temizleyicide s 5 güç ayarı, bir buz banyosu içinde (125 W maksimum güç 20 kHz, % 50'si bkz: Malzemeler tablo).
- Örnekleri 4 ° c (kısa vadeli) veya -20 ° C (uzun vadeli) depolar.
- Ayırma saflığı için hücre sitoplazma, mitokondri ve membran bölmeleri bulundu protein işaretleri karşı antikor kullanan bir Batı leke gerçekleştirerek incelemek (temsilcisi sonuçları bölümüne bakın).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Farklılaşmamış U9378 hücre süspansiyon yetiştirilen başarılı ayırma yukarıda ayrıntılı ve Şekil 1' de gösterilmiştir iletişim kuralını kullanarak başarılı oldu. Bu yöntem ile elde edilen örnekler polivinilidin florid (PVDF) membran için ıslak aktarma yöntemini kullanan western Blot9 tabi tutuldu. Membran daha sonra karşı antikor ile probed sitoplazmik, mitokondri ve membran lokalize protein işaretleri (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4). Sitoplazmik protein başarılı çıkarma normalde hücre sitoplazma için yerelleştirilmiş sitozolik protein gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz10 (GAPDH), karşı antikor ile leke sondalama tarafından doğrulanabilir. (Şekil 2; alt paneli, şerit 1 ve 2) immunoblot tarafından gösterildiği gibi GAPDH örnekleri ve hiçbir kirlenme 4.000 × g Pelet (Şekil 4; yolları 3 ve 4 alt panelde) veya 18.000 × gözlenen sadece çıkarılan digitonin bulunur g granül (Şekil 4; 5 ve 6 alt panel şerit). Voltaj bağımlı anyon kanalı (VDAC), dış mitokondrial membran ' e11, yerelleştirilmiş bir protein için sondalama 4.000 × g Pelet (Şekil 4; yolları 3 ve 4 Orta mitokondri başarılı yalıtım gösterir Bu protein diğer kesirler yokluğu 18.000 × g granül ya da digitonin çıkarılan örnekleri mitokondriyal kirlenme eksikliği gösterirken paneli). Na/K-ATPaz α1 alt birimi, öncelikle plazma zarı12, bulundu bir integral membran heterodimerdir parçası için sondalama 18.000 × g Pelet (Şekil 4; 5 ve 6 üst şerit bulunan bu proteinin çoğunluğu gösterir paneli). Bu protein de 4000 × g granül içinde (Şekil 4; hatlarının 3 ve 4 üst panel), algılanan bu olasılığı düşük hızda hangi ile bu pelet elde olsa olası bulaşma ile plazma zarı, düşündüren. Na, K-ATPaz alt birimleri acil servise gelen plazma zarı için taşıma araştırmacılar13tarafından gösterildiği daha makul bir açıklama endoplazmik retikulum (ER) 4.000 × g Pelet örnek içinde varlığıdır. Na eksikliği, bu kesir saflığı K-ATPaz α1 protein digitonin çıkarılan örneklerde (Şekil 4; üst panelde yolları 1 ve 2) gösterir.
Başarılı bir ayırma (Şekil 2) sırasında gözlenen sonuç aksine, iletişim kuralının yanlış yürütme hücresel bileşenleri (Şekil 3, Şekil 4) kontaminasyon neden olabilir. Na, K-ATPaz α1 protein 18.000 × g Pelet karşılaştırıldığında 4.000 × g Pelet yüksek yoğunlukta (Şekil 3 {üst panel, lane 2-3] ve Şekil 4B [üst panel, yolları 5-12]), organel kesir olduğunu gösterir plazma zarı proteinleri ile kontamine olmuştur. GAPDH huzurunda digitonin çıkarılan sitoplazmik örnek dışında herhangi bir kesir (Şekil 3 [alt panel, lane 4] ve Şekil 4A [alt paneli, yolları 5-12] arasındadır sitoplazmik protein sonraki adımlar kaldırmak için başarısız bir göstergesidir.
Şekil 1: diyagramı hücre Ayırma Protokolü'nün. Bir akış şeması temsil hücre Ayırma Protokolü genel bir bakış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: U937 hücre sitoplazma, organel ve membran kesirler başarılı yalıtım. Hücre kesirler Batı açıkları iki U937 hücre kültürlerinde izole ve membran (Na, K-ATPaz α1, üst panel), mitokondri (VDAC, orta paneli) ve sitoplazma (GAPDH, alt paneli) markers için probed. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: U937 hücre bileşenleri Fractionate hatası. Organel kesir (lane 2) Na, K-ATPaz α1 ile kirlenme gösterilen tek bir U937 hücre kültür izole hücre kesirler Batı lekesi (üst panel) ve sitoplazmik membran Pelet (lane 4) süpernatant bileşenlerine kaybı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: çapraz bulaşma sitoplazmik ve membran bileşenleri ayırma sırasında. (A)ayırma girişimi ile GAPDH sitoplazmik çapraz bulaşma organel (alt paneli, yolları 5-8) ve membran kesirler (alt paneli, yolları 9-12). (B) ayırma girişimi ile plazma zarı kirlenme na, K-ATPaz mitokondrial kesirler (üst panel, yolları 5-8). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Adı | Kompozisyon (hisse senedi toplama) | Son konsantrasyonu |
| Arabellek A | NaCl (150 mM) ve HEPES (50 mM) | 1 x (hisse senedi ile aynı) |
| Lizis arabellek B | HEPES (20 mM), KCl (10 mM), MgCl2 (2 mM), EDTA (1 mM), EGTA (1 mM), Mannitol (210 mM) ve sukroz (70 mM) | 1 x (hisse senedi ile aynı) |
| Örnek arabellek | Tris arabelleğe alınmış serum Sodyum Lauryl Sülfat (% 0,1) | 1 x (hisse senedi ile aynı) |
| Digitonin | Digitonin (250 µg/ml) deiyonize su | 25 µg/ml |
| Phenylmethanesulfonyl florür | % 100 etanol Phenylmethanesulfonyl florür (100 mM) | 1 mM |
| Proteaz inhibitörü kokteyl | (Bkz: üretici ürün sayfası) değişir | 1 X |
| Sodyum Orthovanadate | Deiyonize su sodyum Orthovanadate (500 mM) | 1 mM |
Tablo 1: arabellekleri ve çözümler. Kompozisyon arabellekleri ve yordam için gerekli çözümleri.
| İletişim kuralı adım | Kritik faktör | Açıklama | Olası sorunları | Olası çözümler |
| Hücre hazırlık | Hücre toplama | Bu yöntem işleyebilir hücreleri en iyi konsantrasyon ile en iyi sonuçları elde etmek için çalışmış olan hücre tipi için ampirik olarak belirlenmelidir. | Yüksek konsantrasyonlu hücre süspansiyonlar mitokondri ve membran düşük verimleri kesirler lider verimsiz lizis içinde neden olabilir. | En iyi sonuçları belirlemek için hücre konsantrasyonları bir dizi ilk yordamı gerçekleştirin. |
| Hücre ön işleme | Hücreleri ayırma işlemi için süspansiyon olması gerekir, bu kültür yüzeylerden yapışık hücreleri ayırma veya doku homojenizasyon gerektirir. | Verimsiz işleme düşük kesir verimleri, çapraz bulaşma arasında hücre altı kesirleri veya diğer beklenmeyen sonuçlara neden olabilir. | Yöntemin sonuçları yordamı için yeterli hücrelerindeki istihdam sağlamak. Süspansiyon işlemlerden sonra konsantrasyonu belirlemek ve buna göre ayarlamak için hücreleri saymak. | |
| İstihdam yöntemi plazma zarı ödün vermez, erken lizis, çapraz bulaşma kesirler ile sonuçlanan meydana gelebilir. | Plazma zarı hücre hasat sırasında hücre zarar görmesini önlemek yöntemleri kullanarak bütünlüğün korunmasını sağlamak. Membran bütünlüğü bir membran geçirimsiz boya (gibi Trypan mavi) eklenmesi ile mikroskop altında incelenmesi ile doğrulayın. | |||
| Sitozolik Protein yalıtım | Digitonin konsantrasyonu | Digitonin en iyi konsantrasyonu hücre lizis hala sitozolik protein ayıklama gözenek oluşumu aracılığıyla izin verirken önlemek için belirlenmelidir. | Digitonin yüksek konsantrasyonda membran rüptürü, hücre lizis ve kirlenme sitozolik fraksiyonunun yol açabilir. Suboptimal konsantrasyonları sitozolik protein verimsiz çıkarma ve sonraki kesirler mümkün çapraz bulaşma neden olur. | Aşırı hücre lizis gözlem yapılırsa digitonin konsantrasyonu azaldı. Digitonin kuluçka elde edilen bir küçük hücreli Pelet membran rüptürü belirtmek ve lizis hücre. |
| Sonrası ayıklama yıkama | Digitonin ve permeabilized hücrelerden sitozolik protein çapraz bulaşma kaçınmak için gerçekleştirilmelidir. | Başarısızlık sitozolik ayıklama neden olabilir sonra hücreleri yeterince yıkamak için taşımak için diğer kesirler sitozolik protein. | Ek yıkar arabellek ile bir sonraki digitonin kuluçka digitonin ve sitozolik protein kalan seyreltik. | |
| Mitokondrial yalıtım | Hücre lizis | Lizis yöntemleri sonraki yalıtım mitokondrial bütünlüğünü koruyarak hücresel içeriği, serbest bırakmak için kapsamlı olmalıdır. | Hücre mekanik lizis sağlam ve mitokondrial proteinlerin düşük verimleri elde edilen hücreleri bırakarak verimsiz olabilir. | Güç hücreleri parçalayıcı ve mitokondri serbest bırakmak için gerekli miktarda ampirik olarak farklı hücre tipleri için belirlenmelidir. Büyük Pelet lizis adımdan sonra elde edilen (aynı zamanda küçük mitokondrial ve membran Granül) suboptimal lizis gösterebilir. Kuvvet (havaneli vuruş, iğne pasajlar, vb) yazı lizis Pelet en aza indirmek için miktarını artırın. |
| Çok fazla mekanik kuvvet mitokondri, plazma zarı kesir mitokondri zar proteinleri ile bulaşıcı koşullar. | Membran örnekleri mitokondriyal protein işaretleri bulunursa gücü azaltmak. | |||
| Enkaz kaldırma | Sağlam hücreleri ve daha büyük parçaları lizis mitokondrial örnekleri kirletici önlemek için takip homogenate kaldırılması gerekir. | Enkaz ve sağlam hücreleri mitokondri peletleme önce kaldırılmazsa mitokondrial örnekleri sitoplazmik bileşenleri veya plazma membran proteinlerinin ile kontamine. | Düşük hızlı Santrifüjü adımları mitokondrial yalıtım spin önce artırın. Mitokondrial verim düşükse, granül düşük hızlı spin kaydetmek ve western blot mitokondrial işaretleri üzerinden kontrol gerekli olabilir. | |
| Sonrası yalıtım yıkama | Mitokondrial örnekleri, onlarla cips bulaşıcı enkaz kaldırmak için iyice yıkanmalıdır. | Hücre parçaları Mayıs toplama ve mitokondri, kirlenme sitoplazmik geçmeye lider ile ilişkilendirmek veya zar proteinleri. | Granül yeterince kirletici kaldırmak için arabellek ile yıkanır emin olun. | |
| Membran izolasyon | Santrifüjü zaman | Santrifüjü kez membran kesir örnek verimini artırmak için genişletilmesi gerekebilir. | Toplam işlenen hücre sayısı ve hücre lizis verimliliğini bağlı olarak, membran kesir örnek verim düşük olabilir. | Santrifüjü zaman artan plazma zarı kesir verimini artırabilir. Önerilen zaman hücreler büyük bir başlangıç miktarı için yeterli olsa da, daha uzun süreleri daha küçük miktarlar için gerekli olabilir. |
Tablo 2: kritik adımlar. Özet Tablo Protokolü adımları, olası sorunları ve protokol sorun giderme için olası çözümler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı gelişimi mitokondrial ayırmak için bir yetersizlik ve protein yerelleştirme necroptosis14sırasında çözümlenmesi için piyasada kitleri kullanarak membran örnekleri ortaya çıktı. Birincil hazır kitleri bireysel araştırmacılar, ihtiyaçlarına adapte için kendi yetersizlik onların başına maliyet örnek ve sınırlı sayıda örnekleri işlenmesi mümkün sınırlamalardır. Burada sunulan Yöntem pahalı reaktifler kullanılmadan ve pahalı ekipman için zorunluluk olmadan gerçekleştirilebilir. Bu yöntem hücreleri herhangi bir sayısını karşılamak için ölçeklenebilir ve araştırmacılar gereksinimlerine uyacak şekilde değiştirilmiş yeteneğine sahiptir. Bu yöntem yürütülmesinde arttırılması için her kesir verim, gerçekleştirilen araştırma adımlardan terzilik ve esneklik sağlar. Araştırmacılar son örnek protein fosforilasyon durumunu inceleyerek değil sodyum orthovanadate arabellekleri ilavesi atlanabilir. Araştırmacılar daha fazla örnekler üzerinden yoğunluk gradient Santrifüjü arındırmak istediğiniz SDS dahil son arabellek içinde aynı şekilde atlanabilir. Biz sadece başarıyla U937 hücreleri, bir sigara yapışık monosit hücre kültürünü fractionate için bu yöntemi kullandık iken yordam birden çok hücre hatları ve dokular, küçük değişiklikler ile çalışması gerekir. Süspansiyon yetiştirilen hücreler aynı şekilde yapisan hücre hatları ayrılma bu protokolü başlamadan önce büyüme yüzeyinden gerektirirken, ayrıntılı U937 hücrelere pelleted. Benzer şekilde, doku hücreleri içeren ayırma önce iyice homojenize gerekir. Bu gevşek uyan Dounce homogenizer, Potter-Elvehjem cam polytetrafluoroethene homogenizer kullanan veya diğer (ticari) yöntemleri15tarafından gerçekleştirilebilir.
Protokolünde, en iyi sonuçları ve saf kesirler (Tablo 2) elde etmek için dikkatli dikkat edilmesi gereken önemli adımlar vardır. Burada (adım 2.1.2, 2.1.4, 3.1.3, 3.2.1 ve 4.1.2) önerilen hücre konsantrasyonu U937 hücreler için özgüdür ve deneme yanılma yoluyla belirlenir. Bu değerler protokol yürütürken suboptimal sonuçlar aldıysanız farklı hücre türleri karşılamak için ayarlanması gerekebilir. Sitoplazmik ayıklama adım (adım 3.1) sırasında digitonin konsantrasyonu plazma zarı tamamen hücreleri lysing olmadan permeabilize için yeterli olmalıdır. Bu kuluçka takip hücreleri sitozolik protein sonraki adımları kaldırmak için iyice yıkanması gerekir veya çapraz bulaşma aşağı akım örnekleri (4A rakam) ortaya çıkar. Homojenizasyon adım (adım 4.1.4) mekanik lizis herhangi bir formu ile gerçekleştirilebilir, sonuçları burada sunulan, ancak bir Dounce homogenizer ile elde edilmiştir. Dounce homogenizer kullanmanın bir alternatifi art arda hücreleri yeterli hücre lizis kadar dar hat iğne (27 önerilen, G 20-40 geçer) geçmek için sağlanır. Kırılmamış hücrelerinin büyük bir Pelet homojenizasyon (adım 4.1.7) sonra aldıysanız vuruş (veya şırınga geçer) sayısını artırmak gerekli olabilir. Araştırmacılar olasılıkla homojenizasyon şeker hücre türü için en uygun miktarını belirlemek gerekir. Homojenizasyon takip hücresel enkaz kaldırma organel kesir plazma zarı bileşenleri (Şekil 4B) ile kirlenmesini önlemek için dikkatli olmanız gerekir. Bu durum ortaya çıkarsa, hücresel enkaz kaldırmak için ek düşük hız Santrifüjü adımlar gerçekleştirilmelidir. Bu yöntem geliştirilmesi sırasında en çok Santrifüjü 18.000 × g de 18 h, plazma zarı verim 3 h spin (Şekil 2, yolları 5-6) üzerinden en az artış ile test edildi. Araştırmacılar daha iyi elde etmek için Santrifüjü kez artırmak gerekli plazma zarı örneği verir bulabilirsiniz.
Burada sunulan ultrasantrifüj ile ilgili daha kapsamlı arıtma yöntemleri ile karşılaştırıldığında sınırlı yöntemidir. İsopycnic yoğunluğu Santrifüjü kullanımı olmadan bireysel organellerin hücre homojenizasyon sonra elde edilen ayırmak mümkün değildir. 4.000 × g kesirler (VDAC, Şekil 2varlığı ile kanıtlandığı) mitokondri içerirken, onlar büyük olasılıkla da ER, golgi ve ek hücre içi organellerin içerir. Eğer bu gerçekleştirilen araştırma için önemli organel kesir diğer organelleri protein işaretleri için ek antikor kullanımı tarafından doğrulanması gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan
Acknowledgments
İş NIH-1R15HL135675-01 Timothy J. LaRocca tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
References
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S. II, Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
- Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
- Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, 3.27.1-3.27.33 (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, aG., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
- Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
- McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
- Simpson, R. J.
