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Cancer Research

Hefe als Chassis für die Entwicklung von funktionellen Assays zur Untersuchung von Human P53

Published: August 4, 2019 doi: 10.3791/59071
Automatic Translation
1, 2, 3, *3, *1, *2
1Mutagenesis and Cancer Prevention Unit, Ospedale Policlinico San Martino, 2Department CIBIO, University of Trento, 3LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Porto
* These authors contributed equally

Summary

Präsentiert werden vier Protokolle zum Konstruieren und Ausnutzen von Hefe Saccharomyces cerevisiae Reporterstämmen, um menschliche P53-Transaktivierungspotenziale, Auswirkungen seiner verschiedenen krebsassoziierten Mutationen, ko-exprimierte interagierende Proteine und die Auswirkungen bestimmter kleiner Moleküle.

Abstract

Die Feststellung, dass das bekannte Säugetier-P53-Protein als Transkriptionsfaktor (TF) in der Hefe S. cerevisiae fungieren kann, hat die Entwicklung verschiedener funktioneller Assays ermöglicht, um die Auswirkungen von 1) Bindungsstellen zu untersuchen [d.h. Das Ansprechelement (RE)] Sequenzvarianten auf P53-Transaktivierungsspezifität oder 2) TP53-Mutationen, koexprimierte Kofaktoren oder kleine Moleküle bei P53-Transaktivierungsaktivität. Es wurden verschiedene Basis- und translationale Forschungsanwendungen entwickelt. Experimentell nutzen diese Ansätze zwei wesentliche Vorteile des Hefemodells aus. Einerseits ermöglicht die einfache Genombearbeitung den schnellen Aufbau qualitativer oder quantitativer Reportersysteme, indem isogene Stämme genutzt werden, die sich nur auf der Ebene eines spezifischen P53-RE unterscheiden, um die sequenzionizifizium abhängige P53-abhängige Transaktivierung. Andererseits ermöglicht die Verfügbarkeit regulierter Systeme für die ektopische P53-Expression die Auswertung der Transaktivierung in einer Vielzahl von Proteinexpressionen. Bewertet in diesem Bericht sind ausgiebig verwendete Systeme, die auf Farbreporter-Gene, Luziferase und das Wachstum von Hefe basieren, um ihre wichtigsten methodischen Schritte zu veranschaulichen und ihre Vorhersagekraft kritisch zu bewerten. Darüber hinaus kann die extreme Vielseitigkeit dieser Ansätze leicht genutzt werden, um verschiedene TFs zu untersuchen, einschließlich P63 und P73, die andere Mitglieder der TP53-Genfamilie sind.

Introduction

Die Transkription ist ein äußerst komplexer Prozess, bei dem die dynamische, räumliche und zeitliche Organisation von Transkriptionsfaktoren (TFs) und Kofaktoren für die Rekrutierung und Modulation von RNA-Polymerasen in Chromatinregionen als Reaktion auf spezifische Reize1 . Die meisten TFs, einschließlich des menschlichen P53-Tumorsuppressors, erkennen bestimmte cis-wirkende Elemente in Form von DNA-Sequenzen, sogenannten Response-Elementen (REs), die aus einzelnen (oder mehreren) einzigartigen Motiven bestehen, die 6-10 Nukleotide lang sind. Innerhalb dieser Motive können einzelne Positionen verschiedene Variabilitätsgrade2aufweisen, in der Regel nach Positionsgewichtsmatrizen (PWM) oder Logos3,4zusammengefasst.

Die Hefe S. cerevisiae ist ein geeignetes Modellsystem zur Untersuchung verschiedener Aspekte menschlicher Proteine durch Komplementierungs-Assays, ektopische Expression und funktionelle Assays, selbst wenn ein orthologoxes Hefegen nicht vorhanden ist5, 6 , 7. Aufgrund der evolutionären Konservierung von Basalkomponenten des Transkriptionssystems8können viele menschliche TFs (wenn sie ektopisch in Hefezellen ausgedrückt werden) die Expression eines Reportergens modulieren, indem sie durch Promotoren wirken, die entsprechende REs enthalten. Das hier vorgestellte Transkriptionsmodellsystem für humane P53 zeichnet sich durch drei Hauptvariablen aus, deren Wirkungen moduliert werden können: 1) die Modalität der Expression und Art von P53, 2) die RE-Sequenz, die P53-abhängige Transkription steuert, und 3) die Art der Reportergen (Abbildung 1A).

Hinsichtlich der Modalität des P53-Ausdrucks ermöglicht S. cerevisiae die Wahl zwischen induzierbaren, druckbaren oder konstitutiven Promotoren9,10,11. Insbesondere erlaubt der induzierbare GAL1-Promotor die basale (mit Raffinose als Kohlenstoffquelle) oder variable (durch Änderung der Galaktosemenge in den Medien) Expression eines TF in Hefe. Tatsächlich stellt der fein abgestimmte Ausdruck eine kritische Entwicklung dar, um nicht nur P53 selbst, sondern auch andere Proteine der P53-Familie12,13zu studieren.

In Bezug auf die Art der REs, die den P53-abhängigen Ausdruck steuern, ermöglicht S. cerevisiae die Konstruktion verschiedener Reporterstämme, die einzigartige Unterschiede im RE-Interesse in einem ansonsten isogenen Hintergrund aufweisen. Dieses Ziel wird mit einer Anpassung eines besonders vielseitigen Genom-Editing-Ansatzes erreicht, der in S. cerevisiaeentwickelt wurde, genannt delitto perfetto12,14,15,16.

Darüber hinaus können verschiedene Reportergene (d. h. URA3, HIS3 und ADE2) verwendet werden, um transkriptionelle Aktivitäten menschlicher TFs in S. cerevisiaequalitativ und quantitativ zu bewerten. auf experimentelle Bedürfnisse zugeschnitten sein17,18,19,20,21. Die Expression dieser Reportergene verleiht Uracil, Histidin und Adeninprototrophie. Der URA3-Reporter lässt auch das Wachstum von Zellen in Gegenwart von 5-FOA nicht zu und kann somit gegengewählt werden. Das ADE2-Reportersystem hat den Vorteil, dass es neben der Ernährungsauswahl die Identifizierung von Hefezellen ermöglicht, die Wildtyp (d. h. funktional bei ADE2-Expression) oder mutiert (d. h.nicht funktionsfähig auf ADE2) exprimieren. ) P53 aus der Koloniefarbe.

Zum Beispiel erzeugen Hefezellen, die das ADE2-Gen exzieren, normalerweise große weiße Kolonien auf Platten, die begrenzende Mengen an Adenin (2,5-5,0 mg/L) enthalten, während solche, die es schlecht oder nicht transkribieren, auf derselben Platte wie kleinere rote (oder rosa) Kolonien. Dies ist auf die Anhäufung eines Zwischenprodukts im Biosynthetischen Adenin (d. h. P-Ribosylamino-Imidazol, das zuvor Amino-Imidazol-Ribot oder AIR genannt wurde), das zu einem roten Pigment umgewandelt wird. Das qualitative farbbasierte ADE2-Reportergen wurde seitdem durch das quantitative Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22ersetzt. In jüngerer Zeit wurde der ADE2-Reporter mit dem lacZ-Reporter in einem leicht zu bewertenden, semi-quantitativen Doppelreporter-Assay kombiniert, der genutzt werden kann, um P53-Mutanten nach ihrem Restfunktionsgrad zu unterklassifizieren. 23.

Fluoreszierende Reporter wie EGFP (enhanced green fluorescent protein) oder DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein) wurden auch für die quantitative Bewertung der Transaktivierungsaktivität im Zusammenhang mit allen möglichen Missense-Mutationen in der TP53-Codierungssequenz24. Schließlich hat die Chance, abstimmbare Promotoren für die P53-Allelexpression mit isogenen Hefestämmen zu kombinieren, die sich für das RE- und/oder Reportergen unterscheiden, zur Entwicklung einer Datenmatrix geführt, die eine verfeinerte Klassifizierung von krebsassoziierter und Keimbahn erzeugt. Mutante P53 Allele25,26,27.

Die oben beschriebenen Ansätze werden verwendet, um die Transkriptionsaktivität des P53-Proteins zu messen. Die Expression von Wildtyp P53 in der Hefe S. cerevisiae28 und Schizosaccharomyces pombe29 kann jedoch zu Wachstumsverzögerungen führen, die mit Zellzyklusstillstand28,30 oder Zelltod31. In beiden Fällen wird die Hefewachstumshemmung durch eine hohe P53-Expression ausgelöst und mit einer möglichen transkriptionellen Modulation endogener Hefegene korreliert, die am Zellwachstum beteiligt sind. Zur Untermauern dieser Hypothese störte der Funktionsverlustmutant P53 R273H das Wachstum der Hefezellen nicht, wenn er auf ähnlichen Ebenen wie wildartig P5332ausgedrückt wurde. Umgekehrt verursachte die Expression des toxischen Mutanten P53 V122A (bekannt für eine höhere Transkriptionsaktivität im Vergleich zum Wildtyp P53) in Hefe eine stärkere wachstumshemmende Wirkung als der Wildtyp P5332.

Zusätzlich wurde gezeigt, dass humanes MDM2 in der Lage war, die menschliche P53-Transkriptionsaktivität in Hefe zu hemmen und seine Ubiquitination und den anschließenden Abbau zu fördern33. Dementsprechend wurde die Fähigkeit von humanem MDM2 und MDMX, P53-induzierte Hefewachstumshemmung zu hemmen,32,34gezeigt. In einer zusätzlichen Studie wurde eine Korrelation zwischen der Transkriptionsaktivität P53 und den Actin-Expressionsspiegeln festgestellt, wobei ein vermeintliches P53 RE vor dem ACT1-Gen in Hefe32identifiziert wurde. Konsequentwurde die Actin-Expression durch den Wildtyp P53 und noch mehr durch P53 V122A, nicht aber durch mutierte P53 R273H verstärkt. Umgekehrt verringerte sich die Aktinexpression durch P53 in der Kopräsenz der P53-Inhibitoren MDM2, MDMX oder Pifithrin-A (ein kleinmolekularer Inhibitor der P53-Transkriptionsaktivität), die mit den Ergebnissen auf der Grundlage des Hefewachstums-Assays übereinstimmten. Wichtig ist, dass diese Ergebnisse eine Korrelation zwischen der P53-induzierten Wachstumshemmung und dem Grad ihrer Aktivität in Hefe feststellten, die auch genutzt wurde, um kleine Moleküle zu identifizieren und zu untersuchen, die P53-Funktionen modulieren28,34 , 35.

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Protocol

1. Bau von ADE2- oder LUC1-Reporterhefestämmen, die einen spezifischen RE (yAFM-RE oder yLFM-RE) enthalten

  1. Streak a yAFM-ICORE oder yLFM-ICORE Stamm12,14 (ICORE = I, ISce-I Endonuklease unter GAL1 Promoter; CO = zählerlich wählbar URA3; RE = Reporter KanMX4 verleiht Kanamycin-Widerstand; Tabelle 1) aus einem 15% Glycerinbestand, der bei -80 °C auf einer YPDA-Agarplatte gelagert wird (Tabelle 2). Lassen Sie es für 2-3 Tage bei 30 °C wachsen.
  2. Nehmen Sie eine Hefekolonie von der frischen Platte (nicht mehr als 3 Wochen alt) und legen Sie sie in einen kleinen Kolben mit 5 ml YPDA (Tabelle 2). Bei 30 °C über Nacht inkubieren, bei 150-200 Umdrehungen von 150 bis 200 Umdrehungen von 150 Rpm schütteln.
  3. Am nächsten Tag, um alle Spuren von Dextrose zu entfernen, pellet die Zellen für 2 min bei 3.000 x g und entsorgen Sie den Überstand durch Umkehrung des Rohres.
    HINWEIS: Führen Sie alle Zentrifugationen in diesem Protokoll bei Raumtemperatur (RT) durch.
  4. Das Zellpellet in 30-50 ml vorgewärmtem CM (vollständiges Medium) mit Galaktose (Tabelle2) wieder auftragen und 4 h bei 30 °C inkubieren, bei 150-200 Rpm schütteln (notwendig für die Induktion von I-SceI).
  5. Zentrifugieren Sie die Zellen für 2 min bei 3.000 x g und entsorgen Sie den Überstand durch Umkehrung des Rohres.
  6. Das Zellpellet in 30-50 ml sterilem Wasser wieder aufsetzen. Wiederholen Sie Schritt 1.5.
  7. Das Zellpellet in 10 ml sterilem Wasser wieder aufsetzen. Wiederholen Sie Schritt 1.5.
  8. Setzen Sie das Zellpellet in 5 ml sterilem LiAcTE (Tabelle 3) wieder aus, einer ionischen Lösung, die die DNA-Aufnahme begünstigt. Wiederholen Sie Schritt 1.5.
  9. Setzen Sie das Zellpellet in 250 l sterilem LiAcTE wieder auf und übertragen Sie die Zellen in ein 1,5 ml-Rohr. Wiederholen Sie Schritt 1.5 und setzen Sie das Zellpellet in 300-500 l sterilem LiAcTE wieder auf.
  10. Während der Wähme denaturieren Sie eine 10 mg/ml-Lösung von Lachssperma-DNA-Träger für 10 min bei 100 °C und kühlen Sie sofort auf Eis, um es als einsträngige DNA zu erhalten.
  11. In einem separaten 1,5 ml-Rohr 500 Picomole des gewünschten Oligonukleotids (Tabelle 3), 5 l der gekochten Lachs-Spermaträger-DNA, 300 l steriler LiAcTE PEG (Tabelle 3) und 50 l der Hefezellsuspension (ab Schritt 1,9) hinzufügen.
  12. Wirbeln Sie die Rohre für 10 s zu mischen und für 30 min bei 30 °C zu brüten, schütteln bei 150-200 U/min. Legen Sie die 1,5 ml Rohre auf die Seite, um schütteln zu begünstigen.
  13. Hitze schockt die Hefezellen für 15 min bei 42 °C in einem Heizblock, zentrifugieren sie dann die Zellen für 20 s bei 10.000 x g. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml sterilem Wasser wieder aus.
  14. 100 l der Zellsuspension auf der YPDA-Agarplatte verteilen und 1 Tag bei 30 °C inkubieren (umgedreht). Um sicherzustellen, dass gut getrennte Kolonien erhalten werden, verteilen Sie auch 100 l einer Verdünnung von 1:10.
  15. Am nächsten Tag, Replik Platte mit sterilem Samt auf CM AgarPlatte mit Dextrose und 5-FOA (Tabelle 2). Betrachten Sie eine zweite Replikplatte auf einer neuen Platte, wenn viele Zellen übertragen werden (d. h. ein gewisses Wachstum von URA3-Zellen).
  16. Drei Tage später, Replik Platte auf nicht-selektiven YPDA und YPDA enthält G418 (ein Aminoglykosid-Antibiotikum ähnlich Kanamycin) Agar-Platten (Tabelle 2), Markierung jeder Platte, um ihren späteren Vergleich zu erleichtern. Die Platten über Nacht bei 30 °C inkubieren.
  17. Identifizieren Sie am nächsten Tag die Kandidatenreporterstämme aus Kolonien, die G418-empfindlich sind, aber auf YPDA-Platten wachsen (z. B. yLFM- oder yAFM-RE-Kolonien). Streifen Sie die identifizierten Kolonien (3-6 Kolonien) auf einer neuen YPDA-Platte, um einzelne Kolonieisolate zu erhalten und sie für 2 Tage bei 30 °C wachsen zu lassen.
  18. Patch einzelne Hefekolonien auf einer YPDA-Platte, um die Kolonien für weitere Analysen zu isolieren. Nach 24 h bei 30 °C, testen Sie sie durch Nachahmung auf einer YPGA-Agarplatte (Tabelle 2), die das Wachstum von zierlichen Mutanten (d. h. Atemnoten)) verhindern. Zur gleichen Zeit, Replik Platte auf einer neuen YPDA Agar Platte.
  19. Testen Sie die richtigen Pflaster (d. h. Wachstum auf YPDA- und YPGA-Agarplatten; 1-3 Kolonien) ab Schritt 1.18 auf das Vorhandensein einer korrekten Oligonukleotid-Integration durch Kolonie PCR. Montieren Sie einen Reaktionsmix, indem Sie 5 l mit 10x PCR-Puffer (1,5 mM MgCl2), 2 l mit 10 Picomoles/L-Primern (Tabelle3),4 l mit 2,5 mM dNTPs, 0,25 l 5 U/L Taq-Polymerase und Wasser zu einem Endvolumen von 50 l hinzufügen. Multiplizieren Sie den Reaktionsmix für die Anzahl der Hefekolonien, die gesiescreent werden müssen, und aliquot 50 l in jedes PCR-Rohr. Mit einer Pipette eine sehr kleine Menge Hefezellen aus der YPDA Agarplatte in einen einzigen PCR-Reaktionsmix geben.
  20. Führen Sie die PCR-Reaktion mit folgendem Programm durch: 94 °C für 8 min, gefolgt von 35 Denaturierungszyklen für 1 min bei 94 °C, Primern, die 1 min bei 55 °C glühen, und Verlängerung um 2 min bei 72 °C.
  21. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, laden Sie ein Aliquot der PCR-Reaktion (etwa ein Zehntel des Volumens) auf ein Agarose-Gel, um die richtige Größe zu überprüfen (ca. 500 bp).
  22. Sequenzieren Sie das PCR-Produkt nach der Reinigung mit einem kommerziellen Kit, um die Integration der gewünschten RE-Sequenz mit den gleichen Primern von Schritt 1.19 zu bestätigen.
  23. Nach der Validierung der korrekten Sequenz einen 15% Glycerinbestand an yAFM-RE oder yLFM-RE Dehnungskultur (in YPDA) machen und bei -80 °C lagern.

2. Bewertung der Transaktivierungsfähigkeit des P53-Proteins mit dem qualitativen farbbasierten ADE2-Hefetest

  1. Wiederholen Sie die Schritte 1.1 und 1.2 mit dem yAFM-RE Stamm (Tabelle 1).
  2. Am Tag danach die Zellkultur (1:10) in 30-50 ml vorgewärmter YPDA verdünnen und bei 30 °C durch Schütteln weiter inkubieren, bis die OD600nm 0,8-1,0 erreicht.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 1.5-1.10.
  4. In einem separaten 1,5 ml-Rohr 300-500 ng Hefe-P53-Expressionsvektor (oder Kontroll-Expressionsvektor) hinzufügen (Tabelle 4), 5 l des gekochten Lachs-Sperma-DNA-Trägers, 300 l steriler LiAcTE PEG und 50 l Hefezellsuspension.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 1.12 und 1.13, aber setzen Sie das Zellpellet in 300 l sterilem Wasser wieder auf.
  6. Verteilen Sie 100 l der Zellsuspension auf synthetische selektive (für P53-Expression oder Kontrollvektor) Platten, die Dextrose als Kohlenstoffquelle und hohe Menge an Adenin enthalten (Tabelle 2), und dann 2-3 Tage bei 30 °C inkubieren (umgedreht).
  7. Streifen einzelne Hefe transformant Kolonien (2-6 Streifen pro Platte) auf einer neuen selektiven Platte und lassen Sie sie über Nacht bei 30 °C wachsen.
  8. Am Tag danach, mit sterilen Samt Replik Platte auf neue selektive Platten, die für die Beurteilung der Farbe Phänotyp ermöglichen (d. h. Platten mit Dextrose als Kohlenstoffquelle, aber Begrenzung der Menge an Adenin; Tabelle 2). Die Platten 3 Tage lang bei 30 °C auf den Kopf stellen. Optional, um die Temperaturempfindlichkeit von P53-Protein zu bewerten, inkubieren bei drei verschiedenen Temperaturen für 3 Tage: 24 °C, 30 °C und 37 °C.
    HINWEIS: Derselbe Streifen kann mehrmals nachgebaut werden.
  9. Um die Transaktivierungsfähigkeit des P53-Proteins zu bewerten, überprüfen Sie den farbbasierten Phänotyp von Hefekolonien und vergleichen Sie den P53-Protein-Phänotyp in Bezug auf P53-Wildtyp- und leere Vektor-Phänotypen.

3. Bewertung der Transaktivierungsfähigkeit von P53-Proteinen mit dem quantitativen Lumineszenz-basierten LUC1-Hefetest

  1. Transformieren Sie Hefezellen mit P53-Expressionsvektoren (oder Steuerelementen) (Tabelle 4) mithilfe der LiAc-basierten Methode, die in Protokoll 2 beschrieben ist. Verwenden Sie yLFM-RE-Stamm (Tabelle 1).
  2. Einzelne Transformanten auf einer neuen selektiven Platte mit der hohen Menge an Glukose enthaltendem Adenin als Kohlenstoffquelle aufflicken und über Nacht bei 30 °C wachsen lassen. Erstellen Sie für jeden Transformationstyp 5-7 verschiedene Patches.
  3. Nach dem über Nacht Wachstum, resuspendieren Sie eine kleine Menge von Hefezellen mit einem sterilen Zahnstocher oder Pipettenspitze von der Platte in synthetischen selektiven Medium mit Dextrose oder Raffinose als Kohlenstoffquelle (200 l Endvolumen in einer transparenten 96-Well-Platte, mit einer runden oder flachen Boden). Wenn das Experiment eine induzierbare P53-Expression erfordert, fügen Sie dem Raffinosemedium Galaktose hinzu, um den Induktionsgrad zu modulieren (Tabelle 2).
    HINWEIS: Diese Zellsuspensionen sollten eine OD600nm von etwa 0,4 und nicht höher als 1 haben.
  4. Messen Sie die Absorption jedes Brunnens bei OD600nm nach induzierbarem P53-Ausdruck (4-8 h bei 30°C bei 150-200 Rprossen) mit einem Multilabel-Plattenleser. Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspensionen homogen sind, indem Sie jeden Brunnen mit einer Mehrkanalpipette mischen.
  5. 10-20 l Zellsuspension von der transparenten 96-Wellplatte in eine weiße 384 (oder 96) Wellplatte übertragen und mit einem gleichen Volumen (10-20 l) Lysepuffer mischen. 10-15 min bei RT auf einem Shaker (150-200 Rpm) inkubieren, um eine Permeabilisierung der Zelle auf das Luziferasesubstrat zu erreichen.
  6. Fügen Sie 10-20 L Firefly-Luziferase-Substrat hinzu und messen Sie die Lichteinheiten (LU) durch einen Multi-Label-Plattenleser.
  7. Um die Transaktivierungsfähigkeit des P53-Proteins zu bestimmen, normalisieren Sie die LUs jedes Brunnens auf die entsprechende OD600nm (relative Lichteinheit, RLU). Berechnen Sie die durchschnittliche RLU und Die Standardabweichung von 3-4 Flecken Hefetransformant Kolonien.
  8. Vergleichen Sie die P53-Protein-Transaktivierungsdaten in Bezug auf P53-Wildtyp und leeren Vektor, entweder durch Subtrahieren der mit dem leeren Vektor erhaltenen Werte oder durch die Division durch die Werte, die mit dem leeren Vektor (d. h. Rechenfalte der Induktion) erhalten wurden.
    HINWEIS: Die Transaktivierungsaktivität P53 kann auch mit demselben Versuchsaufbau in Gegenwart von P53-interagierenden Proteinen (d. h. MDM2 und MDMX) und/oder einschließlich medikamentöser Behandlung bewertet werden.

4. Bewertung der P53-Proteinwachstumshemmung mit dem Hefe-Phänotyppicken-Assay

  1. Transformieren Sie Hefezellen mit P53/MDM2/MDMX(oder Steuer-) Expressionsvektoren (Tabelle 4) mit der liAc-basierten Methode, die in Abschnitt 2 beschrieben wird. Verwenden Sie den Stamm CG379 (Tabelle 1) und verteilen Sie Hefetransformationants auf minimal selektiven Platten (Tabelle 2).
  2. Wachsen Sie transformierte Zellen in minimalem selektiven Medium (Tabelle 2) auf ca. 1 OD600nm.
  3. Verdünnn Sie Hefezellen auf 0,05 OD600nm im selektiven Induktionsmedium (Tabelle 2), und fügen Sie optional ein ausgewähltes kleines Molekül der entsprechenden Konzentration (oder nur Lösungsmittel) hinzu, um ihre Wirksamkeit bei der Reaktivierung des Mutmittels P53 oder bei der Hemmung von MDM2- /MDMX-P53-Interaktionen.
  4. Inkubieren Sie Zellen bei 30 °C unter kontinuierlichem Orbitalschütteln (200 U/min) für ca. 42 h (Zeit, die von Negativkontrollhefe benötigt wird, um die Mid-Log-Phase zu erreichen, ca. 0,45 OD600nm).
  5. Spot 100 L Aliquots von Hefezellkulturen auf minimalen selektiven Platten (Tabelle 2).
  6. 2 Tage bei 30 °C inkubieren.
  7. Messen Sie das Hefewachstum, indem Sie die Anzahl der Kolonien zählen, die in den 100-L-Kulturtropfen (Koloniebildeinheit, KBE-Zahlen) erhalten wurden. Berechnen Sie z. B. die mutierte reaktivierende Wirkung von Verbindungen, wobei das Wachstum von Wildtyp P53, der Hefe als maximal möglichen Effekt ausdrückt (auf 100% eingestellt), während das Wachstum von Zellen, die mutierteP53 (aber der Lösungsmittelkontrolle ausgesetzt) die Null-Stufe der Reaktivierung.

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Representative Results

Bau von ADE2 oder LUC1 Reporter Hefe-Stämme

Derdelitto perfettoapproach12,14,15,16 wurde angepasst, um den Bau von P53 Reporter Hefestämmen zu ermöglichen ( Abbildung1B). Bei der Methode werden ein- oder doppelsträngige Oligonukleotide verwendet, die an beiden Enden mindestens 30 Nukleotide enthalten, die dem gewählten Integrationsort homologe sind. Insbesondere entspricht die Homologie Sequenzen, die den Integrationsort der Doppelmarkerkassette ICORE flankieren, die das KlURA3 und kanMX4 (Reporter-Gen mit Resistenz gegen Geneticin, G418) enthält, die zuvor an der die gewünschte Zielstelle15,16. Diese Kassette enthält auch die Hefe-I-SceI-Endonuklease-Codierungssequenz unter dem induzierbaren GAL1-Promoter und seiner kognaten Ziel-Site. Daher führt ein Wechsel in galactosehaltigem Medium direkt vor der Transformation von Hefezellen mit der gewünschten Sequenz zu Einer I-SceI-Expression und der daraus resultierenden Generierung eines einzelnen Doppelstrangbruchs (DSB) am Standort der ICORE-Integration. Das Vorhandensein eines DSB stimuliert die Häufigkeit von Targeting-Ereignissen stark, wobei mehr als 1.000 Ersatzereignisse mit einer einzigen Transformation erhalten werden.

Am Ende des Targeting- und Auswahlprozesses basierend auf der erworbenen Resistenz gegen 5-FOA und der Empfindlichkeit gegenüber G418 werden Kandidatenklone durch kolonie-PCR-basierte Amplifikation des modifizierten Lokus und Sanger-Sequenzierung bestätigt, um die korrekte Integration der gewünschte P53 RE (Abbildung 1C). Am Ende des Dehnungsbauprotokolls, das in etwa einer Woche abgeschlossen werden kann, wird eine Gruppe isogener Reporterhefestämme erhalten, anhand derer beurteilt werden kann, wie Unterschiede in der Reihenfolge der REs die Transaktivierungskapazität des P53 beeinflussen. protein.

Funktionell heterogene Mutanten P53s

Bei menschlichen Tumoren ist das TP53-Gen hauptsächlich von einzelnen Missense-Mutationen betroffen, die in der Regel sechs wichtige Hotspot-Rückstände (R175, G245, R248, R249, R273 und R282) in der zentralen DNA-Bindungsdomäne (DBD) des P53-Proteins beinhalten. Jedoch, mehr als 2.000 einzelne P53 Aminosäure Substitutionen wurden aufgezeichnet, darunter einige, die selten beobachtet werden27. Mutante P53s können je nach Wirkung der Aminosäuresubstitution auf den DNA-Proteinkontakt (z.B. R273H) oder die Proteinstruktur (z.B. R175H)36als DNA-Kontakt oder strukturell mutierte Mutanten klassifiziert werden. Einzelne TP53-Fehlsinne-Mutationen wirken sich auf P53-Funktionen aus und erzeugen eine breite Palette funktioneller Vielfalt, die wichtige klinische Merkmale wie Tumoraggressivität, Chemoresistenz und metastasisches Potenzial beeinflussen kann37, 38 , 39.

Das Konzept, dass Mutanten P53 funktional heterogen sind, hat sich in den letzten 15 Jahren durch eine große Menge experimenteller Daten ergeben, die in TP53-Mutationsdatenbanken verfügbar sind (z.B. )27. Es wurden verschiedene funktionelle Assays auf der Grundlage von Hefe- und/oder Säugetierreportersystemen entwickelt, die die unterschiedlichen Eigenschaften von Mutanten P53s (d. h. Transaktivierung, Temperaturempfindlichkeit, dominant-negatives Potenzial, Interferenzen mit Mitglieder der P53-Familie und Interaktionen mit anderen TFs)13,24,40,41,42,43,44. Die umfassendste funktionelle Studie untersuchte mehr als 2.300 Mutanten in einem hefebasierten Assay, indem sie ihre Transaktivierungsaktivität in Richtung acht verschiedener P53 REs24charakterisierte.

Die Daten bestätigten, dass fast alle mutierten P53miten mit Hotspot-Rückständen Funktionsverlust sind (d. h. sie haben die Transaktivierungsaktivität vollständig verloren). Umgekehrt sind mutierte P53s, die andere Positionen des P53-Proteins treffen und in der Regel bei krebsschwacher bis niedriger Häufigkeit gefunden werden, teilfunktionelle Mutanten, die ein gewisses Maß an Transaktivierungsaktivität auf P53 REs13 beibehalten. 17. Ein Beispiel für die Verwendung des ADE2-Assays zur Untersuchung der beschriebenen P53-Proteine funktionelle Heterogenität ist in Abbildung 2Adargestellt. Während R175H eine Funktionsverlust-Mutation ist, die rote Kolonien in jedem getesteten Zustand produziert, zeigte R282W eine Temperaturempfindlichkeit, die mit Galactose-abhängiger P53-Expression deutlicher wurde (d. h. der rote Sektor bei 37 °C im P21-5'-RE-Stamm im Platte mit niedrigeren Galaktose, die in der höheren Galactoseplatte rosa wird). Abbildung 2B zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse für ein erweitertes Panel von P53-Mutanten und Reporterstämmen.

Die Existenz dieser p53-Funktionsheterogenität veranlasste die Erforschung, ob eine solche Heterogenität mit der heterogenen Heterogenität vergleichbar ist, die auf klinischer Ebene bei Probanden mit TP53-Keimbahnmutationen beobachtet wurde. TP53-Keimbahnmutationen unterlegen die molekulare Grundlage einer Gruppe von Krebsveranlagungsstörungen, einschließlich der schwereren Li-Fraumeni (LFS) und Li-Fraumeni-ähnlichen (LFL) Syndrome, und der weniger schweren nicht-syndromischen Veranlagung mit (FH) oder ohne (keine FH) Familiengeschichte46.

Das Protokoll hob Genotyp-Phänotyp-Korrelationen hervor, indem die Hefe-Assay-basierten Transaktivierungsfähigkeiten aller TP53-Keimbahn-Mutationsallele mit entsprechenden klinischen Daten aus der IARC-Datenbank abgegleicht wurden. Funktionsverlust P53-Mutationen wurden bei schwereren Krebsneigungssyndromen gefunden, während Partielle P53-Mutanten bei weniger schweren Krebserkrankungen gefunden wurden. Dies deutet darauf hin, dass P53 Resttransaktivierungsfähigkeit den klinischen Phänotyp bei Patienten beeinflusst, die TP53-Mutationen vererbt und Krebsentwickelt haben 25,26.

Nukleotid-Sequenzen Variationen innerhalb von REs regeln P53 Transaktivierungspotenzial

Human P53 ist ein tetrameres (Dimer von Dimeren) TF. Jeder P53-Dimer erkennt einen RE, der aus 10 Nukleotiden (RRRCWWGYYY, R = A oder G; W = A oder T; Y = C oder T)47,48. Zwei solcher Halbstandorte können entweder durch bis zu 13-20 Nukleotide nebeneinander oder voneinander entfernt sein, was eine funktionelle P53 RE darstellt. Dennoch zeichnen sich P53 REs mit Abstandsabstand durch eine geringere P53-Affinität und Transaktivierung als P53 REs ohne Abstandsabstand49,50, in verschiedenen funktionstüchtigen Assays aus verschiedenen Systemen aus.

Kürzlich wurde gezeigt, dass Halbstandorte P53-Tetramere rekrutieren können, die halbherspezifisch51gebunden sind, zusammen mit funktionellen Assays und Chromatin-Immunpräzipitierststudien, diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass P53 auch bei nicht-kanonischen REs wirken kann, 48,52. Darüber hinaus stellt die Tatsache, dass das volle Konsens-P53 RE-Motiv sehr degeneriert ist (RRRCWWGYYY)2, die Möglichkeit vor, dass einzelne REs sich in Sequenz und Bindungsaffinität wesentlich unterscheiden können. Wenn man bedenkt, dass Hunderte von P53-Zielgenen im menschlichen Genom41,48identifiziert wurden, zeigten praktisch alle P53 REs eine nicht identische Sequenz zwischen einander. Darüber hinaus wurde vermutet, dass REs mit einer ausgeprägten DNA-Bindungsaffinität in den Promotoren von P53-Zielgenen ausgewählt werden, die an Zellzyklusarrest oder Apoptose53beteiligt sind.

Die Analyse vieler Varianten des P53 RE an einem konstanten genomischen Standort in Hefe an einem konstanten genomischen Ort ermittelte die Auswirkungen von Nukleotid-Varianten, Abstandsraum und Organisation von RE-Halbstellen auf die Transaktivierungskapazität49. Es führte sogar zur Entdeckung von polymorphen P53 REs mit den beiden Allelen deutlich unterschiedlich in der Reaktionsfähigkeit eines assoziierten Promotors auf P5314,54,55. Kürzlich wurden Informationen, die von P53 RE-Sequenzfeatures und hefebasiertem Transaktivierungspotenzial herleiteten, in p53 Retriever kodiert, einem Mustersuchalgorithmus, der in der Lage ist, sowohl kanonische als auch nicht-kanonische REs entsprechend ihren prognostizierte Transaktivierungspotenziale im gesamten menschlichen Genom52.

Als Beispiel für die Verwendung des Assays zur Untersuchung des sequenzspezifischen P53-Transaktivierungspotentials ist hier ein Vergleich zwischen dem menschlichen Wildtyp P53 und dem evolutionären entfernten P53-Protein von Caenorhabditis elegans (Abbildung 3). Diese Ergebnisse sind eine Folgevon einer aktuellen Studie, in der die evolutionäre Divergenz der Transaktivierungssspezifität zwischen P53-Proteinen untersucht wurde56. Isogene yLFM-RE Reporterstämme wurden wie im Protokoll beschrieben entwickelt. Konkret wurden der aus dem ced13-Gen 57abgeleitete Cep-1 P53 RE und vier Varianten (V1-V4) verglichen (Abbildung 3A). Die RE-Varianten wurden konstruiert, um die Wirkung der Unterschiedlichen der Länge des Abstandsrichters zu untersuchen, die die beiden decamerischen Motive trennt (die in ced13 aus 28 Nukleotiden bestehen) und Veränderungen der Nukleotide zu untersuchen, die das CWWG-Kernmotiv flankieren (die in ced13 A/T-reich sind; während in der höchsten Affinität menschliche P53 REs, sind G /C reich)58. Die Ergebnisse zeigen deutlich, wie cep1 und Human P53 in Bezug auf die Transaktivierungssspezifität voneinander abweichen. Während die humane P53-vermittelte Transaktivierung durch das Vorhandensein eines Abstandsraums stark gehemmt wird (Abbildung 3B), wird die Cep-1-Aktivität durch die Entfernung des Abstandsspacers gehemmt (Abbildung 3C). Darüber hinaus wird die Cep-1-vermittelte Transaktivierung abgeschafft, wenn der RE von A/T- in G/C-reich geändert wird. Weder human P53 noch Cep-1 können von einem einzelnen Decamer transaktivieren, der aus dem ced13 RE abgeleitet ist.

Suche nach kleinen Moleküldisruptoren von P53-MDM2/MDMX-Wechselwirkungen und Reaktivatoren der mutierten P53-Aktivität

Die festgestellte Korrelation zwischen der wachstumshemmenden Wirkung des menschlichen P53 und dem Grad seiner Aktivität in Hefe führte zu einem vereinfachten Screening-Assay auf der Grundlage von Messungen des Hefezellwachstums, um die Auswirkungen von Störfaktoren auf die P53-Aktivität zu analysieren (Abbildung4 ). Die Wirksamkeit des hefe-phäkotypischen Assays zum Abschirmen auf potenzielle Krebsmittel wurde in mehreren Arbeiten nachgewiesen. Mit Hilfe von Hefezellen, die P53 und seine Inhibitoren MDM2 und/oder MDMX koexziert, wurden neue Disruptoren dieser Wechselwirkungen durch ihre Fähigkeit identifiziert, die negativen Auswirkungen von MDMs auf P53 zu hemmen und so die Wildtyp-P53-induzierte Hefewachstumshemmung wiederherzustellen ( Abbildung 4A). Insbesondere führte dieser Test zur Entdeckung von 1) Pyranoxanthon 1 als erstem P53-MDM2-Wechselwirkungshemmer mit einem Xanthongerüst34 und 2) Oxazoloisoindolinon-Inhibitoren der P53-MDM2-Wechselwirkung59. Zusätzlich wurden mit diesem Test erstmals Mangostin und Gambogsäure als potenzielle Inhibitoren der P53-MDM2-Wechselwirkung30beschrieben.

Später zeigte derselbe Test, dass die Pränylierung von Chalcones ihre Fähigkeit verbessert, die P53-MDM2-Interaktion zu stören60. Interessanterweise führte dieser Hefetest auch zur Entdeckung von zwei Inhibitoren der P53-MDM2/MDMX-Wechselwirkungen: dem von Tryptophanol abgeleiteten Oxazolopiperidon-Lactam OXAZ-161 und dem von Tryptophanol abgeleiteten Oxazoloisoindolinon DIMP53-162.

Die reduzierten Auswirkungen des Funktionsverlusts mutierenden P53 auf das Wachstum von Hefezellen wurden auch untersucht, um auf mutierte P53-reaktivierende Medikamente zu untersuchen, die durch die Fähigkeit gekennzeichnet sind, wildtypartige Wachstumshemmniszumutungsaktivität auf mutierte P53 (Abbildung4B) wiederherzustellen. Mit diesem Hefe-Assay wurde ein Reaktivator des Mutanten P53 R280K, das enantiopure Tryptophanol-abgeleitete Oxazoloisoindolinone SLMP53-163, identifiziert. Abbildung 4CzeigtD repräsentative Ergebnisse, die in Hefe mit der Expression von P53 oder Behandlungen mit dem Inhibitor der P53-MDM2-Wechselwirkung Nutlin-3a oder mit dem Reaktivator von P53-Mutant Y220C PhiKan083 erzielt wurden.

Validierung des molekularen Wirkmechanismus dieser Verbindungen als P53-aktivierende Wirkstoffe sowie deren Antitumoraktivität, sowohl in den menschlichen Tumorzelllinien34,60,61,62,63 und Tiermodelle62,63, zeugt von dem großen Potenzial des Hefe-Phänose-Assays bei der Entdeckung von Medikamenten.

Figure 1
Abbildung 1 : Merkmale von Hefe-basierten P53-Transaktivierungstests und Workflow für den Aufbau von P53-Reporter-Hefestämmen. (A) Die Leichtigkeit der Genommanipulation und der kontrollierten ektopischen Genexpression macht Hefe einem "in vivo-Reagenzglas" ähnlich, in dem mehrere Variablen, die für die Untersuchung von P53-Transaktivierungsfunktionen relevant sind, streng untersucht werden. Diese Variablen umfassen die Expressionsniveaus eines Wildtyps oder mutierten P53-Proteins, die Sequenz des RE und den Typ des Reportergens [qualitativ/semiquantitativ (z. B. ADE2 und LACZ) oder quantitativ (z. B. LUC1)]. Die Konsens-RE-Sequenz ist stark degeneriert (RE = RRRCWWGYYY-n-RRRCWWGYYY; R = Purin; W = A/T; Y = Pyrimidin; CWWG = CORE-Sequenz, n = 0-13 bps Abstandsabstand). Die Anzahl der Inkongruenzen in Bezug auf den Konsens, die CORE-Sequenz und die Anzahl der Basispaarabstandser beeinflussen die Transaktivierungsaktivität. Dieses Panel wurde aus einer früheren Publikation64geändert. (B) Schema des delitto perfetto-Ansatzes zur Einführung eines gewünschten P53 RE vor dem minimalen Promotor, der die ADE2- oder LUC1-Reportergenexpression antreibt. Das Protokoll wurde von früheren Veröffentlichungen12,15,16angepasst. (C) Beispiel für die Ergebnisse der PCR-Verstärkung der Hefekolonie in der Region um den Oligo-RE-Integrationsstandort. Das Bild der Elektrophorese stellt das Amplifikationsergebnis von zwei vermeintlich positiven Kolonien (URA3 minus und G418 empfindlich) mit der entsprechenden PCR-Negativkontrolle neben der 1 kb DNA-Leiter (Promega) dar. Das in Tabelle 3 beschriebene Band mit 500 nt kann sequenziert werden, um die korrekte Promotorbearbeitung zu bestätigen, wie im Elektropherogramm dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 : P53-Proteine weisen RE-spezifisches und temperaturempfindliches Transaktivierungspotenzial auf. Wildtyp P53 und die angegebenen TP53-Missense-Mutationen wurden mit dem qualitativen farbbasierten Reporter-Assay in Hefe und ausnutzenden Reporterstämmen getestet, die verschiedene P53-REs beherbergen, die die ADE2-Genexpression steuern. (A) Ein Beispiel für den Koloniefarbphänotyp für P53 Wildtyp, R175H und R282W mit dem PUMA (BBC3) und den P21-5' REs bei 30 °C und 37 °C wird gezeigt. Mäßig (0,008% Galaktose) und hoher (0,12% Galaktose) P53-Ausdruck wird verglichen. (B) Ergebnisse, die mit einem erweiterten Satz von P53-Mutanten und Hefereporterstämmen erzielt wurden, die bei drei Temperaturen (24°C, 30 °C und 37 °C) auf den P53-abhängigen Koloniefarbphänotyp untersucht wurden. Die Ergebnisse veranschaulichen die funktionelle Heterogenität mutierter P53-Allele und werden in einem Tabellenformat zusammengefasst. Zum Beispiel ist R175H ein Funktionsverlust-Mutant, während G199H Wild-Typ P53-like ist. K139E und R282W behalten die Teilfunktion und weisen eine Kalt- bzw. Wärmeempfindlichkeit auf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 : Human P53 und credited ortholog Cep-1 weisen stark divergierte Transaktivierungsspezifitätauf. (A) Sequenzen der: menschlichen P53 RE Konsenssequenz, Cep-1 P53 RE abgeleitet aus dem ced13-Gen und vier Varianten (V1-V4), die in den funktionellen Assays getestet wurden. (B) Die Transaktivierung wurde gemessen, nachdem die humane P53-Expression für 8 h unter Verwendung von drei verschiedenen Kohlenstoffquellen gemessen wurde, um eine niedrige, moderate und hohe Expression zu erreichen (0,008%, 0,032%, 0,12% Galaktose, die selektivem Medium mit 2% Raffinose zugesetzt wurde). Die Ergebnisse werden als durchschnittliche relative Lichteinheiten (RLU) und Standardfehler von vier Replikationen ausgedrückt. Reporteraktivität für Zelle, die mit leerem Ausdrucksvektor transformiert wurde, wurde subtrahiert. (C) Transaktivierungssspezifität von Cep1 gemessen in (B). Bei beiden Proteinen waren die Transaktivierungswerte proportional zur Galaktosemenge. Die höheren Lichteinheiten, die gemessen werden, wenn menschliches P53 exprimiert wird, können von unterschiedlichen Mengen an Proteinmengen abhängig sein, die aufgrund unterschiedlicher Proteinlänge und möglicherweise auch der Codon-Nutzung produziert werden. Die beiden Proteine zeichnen sich durch eine unterschiedliche Transaktivierungssspezifität gegenüber den verschiedenen getesteten REs aus und diese Eigenschaft wird durch mögliche Unterschiede in der relativen Proteinmenge nicht beeinflusst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4 : Kleine Molekülaktivatoren von P53 identifiziert mit dem Hefe-Phenotyppick-Assay. (A) Hefezellen, die den menschlichen Wildtyp P53 und MDM2 oder MDMX mitexzipieren, wurden verwendet, um nach Inhibitoren der Wechselwirkungen P53-MDM2 und P53-MDMX zu suchen. In diesem System stellen Wechselwirkungsinhibitoren die P53-induzierte Hefewachstumshemmung in Hefezellen wieder her, die P53 und MDM2 oder MDMX koexieren. Dieser Ansatz ermöglichte die Identifizierung von Inhibitoren der P53-MDM2-Wechselwirkung und die Identifizierung von Dual-Inhibitoren von P53-MDM2- und P53-MDMX-Wechselwirkungen. (B) Hefezellen, die menschlicheMutanten P53 exdrücken, wurden zur Suche nach mutierten P53-Reaktivatoren verwendet und sind in der Lage, die wildtypartige P53-induzierte Hefewachstumshemmung in mutierten P53-exemittierenden Hefezellen wiederherzustellen. (C) Repräsentative Bilder des Plattenfleck-Assays, die den Einfluss von Wildtyp P53 oder Mutanten Y220C auf das Wachstum der Hefekolonie im Vergleich zum leeren Vektor zeigen (siehe Schritt 4.5). (D) Quantitative Ergebnisse des Wachstumstestes: 10 M Nutlin-3a stellt die P53-induzierte Hefewachstumshemmung in Zellen wieder her, die MDM2 koexziert; 50 M PhiKan083 stellt wildtypartige P53-induzierte Hefewachstumshemmung zu mutiertem P53 Y220C wieder her. Beide Effekte werden relativ zur Hefewachstumshemmung des Wildtyps P53, der als eins festgelegt wurde, dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Stammname und Genotyp Spezifische Verwendung Protokollnummer
yAFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::ADE2 Es wird für den Bau des yAFM-RE-Stamms (MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::ADE2), das im qualitativen, farbbasierten ADE2-Test ausgenutzt wird. Protokolle 1,2
yLFM-ICORE: MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; ICORE::pCyc1::LUC1 Es wird für den Bau des yLFM-RE-Stamms (MATa leu2-3,112 trp1-1 his3-11,15 can1-100; ura3-1; RE::pCyc1::LUC1), die im quantitativen Lumineszenz-basierten LUC1-Assay ausgenutzt wird. Protokolle 1,3
CG379: MATa, ade5 his7-2 leu2-112 trp1-289aura3-52 [Kil-O] Es wird für den phänotischen Wachstumstest verwendet. Protokoll 4

Tabelle 1: Hefe-Stämme.

Medienname und Rezept Spezifische Verwendung Protokollnummer
YPDA (2% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Dextrose, 200 mg/L Adenin) + 2% Agar YPDA ohne Agar wird vorzugsweise durch Filtration sterilisiert. YPDA + Agar wird durch Autoklavieren sterilisiert; es ist möglich, Dextrose aus dem Rezept wegzulassen und Dextrose aus einer 20% filtersterilisierten Lösung in Wasser hinzuzufügen, bevor die Platten gegossen werden. Protokolle 1-4
CM [0,17% Hefestickstoffbasis ohne AA und Ammoniumsulfat, 0,5% Ammoniumsulfat, 5% (Volumen/Volumen, v/v) nicht-essentielle Aminosäurelösung, 20 mg/L Histidin, 20 mg/L Tryptophan, 20 mg/L Uracil, 30 mg/L Lysin, 100 mg/L Leucin, 200 mg/L Adenin +] 2% Galaktose Das Medium wird durch Filtern sterilisiert. Die folgenden sterilen Stofflösungen werden in Wasser hergestellt (mit Ausnahme von Uracil, das in 0,1 M NaOH gelöst wird) durch Filterung: nicht-essentielle Aminosäurelösung (0,04% Arginin, 0,04% Methionin, 0,06% Isoleucin, 0,1% Phenylalanin, 0,2% Glutamin Säure, 0,2% Aspartinsäure, 0,3% Valin, 0,4% Threonin, 0,8% Serin), 1% Histidin, 1% Tryptophan, 1% Uracil, 1% Lysin, 1% Leucin, 0,5% Adenin, 20% Galaktose. Adenin-Stammlösung darf nicht im Kühlschrank aufgrund der Bildung und Sedimentation von Kristallen gelagert werden. Tryptophan-Lagerlösung muss im Dunkeln gelagert werden. Protokoll 1
CM (siehe oben) + 2% Dextrose + 1g/L 5-FOA + 2% Agar Die Medien (enthält die Hefestickstoffbasis ohne AA und Ammoniumsulfat, Ammoniumsulfat und Agar) werden durch Autoklavieren sterilisiert. Die anderen Komponenten werden nach dem Autoklavieren hinzugefügt, um hitzelabile Inhaltsstoffe zu erhalten; Das 5-FOA-Pulver kann direkt in den Medien zugegeben werden, sobald es auf ca. 55°C abgekühlt ist. Protokoll 1
YPDA + 400 g/mL G418 + 2% Agar G418 muss nach dem Autoklavieren hinzugefügt werden, sobald die Medien auf etwa 55°C abgekühlt sind. Wenn sie mit Pulver beginnt, kann eine 50 mg/ml G418-Stammlösung in Wasser hergestellt und durch Filtration sterilisiert werden. Protokoll 1
YPGA [2% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glycerin (v/v), 200 mg/L Adenin] + 2% Agar Die Medien werden durch Autoklavieren sterilisiert. Protokoll 1
Synthetische selektive Platte: [0,17% Hefestickstoffbasis ohne AA und Ammoniumsulfat, 0,5% Ammoniumsulfat, 5% (v/v) nicht-essentielle Aminosäurelösung (0,04% Arginin, 0,04% Methionin, 0,06% Isoleucin, 0,1% Phenylalanin, 0,2% Glutaminsäure, 0,2% Aspartinsäure, 0,3% Valin, 0,4% Threonin, 0,8% Serin), 20 mg/L Histidin, 20 mg/L Uracile, 20 mg/L Tryptophan (je nach Vektorauswahlmarker), 30 mg/L Lysin, 100 mg/ml Leucin (je nach Vektorauswahlmarker), 5 mg/L oder 200 mg/L Adenin] + 2% Dextrose + 2% Agar Die Medien (enthält die Hefestickstoffbasis ohne AA und Ammoniumsulfat, Ammoniumsulfat und Agar) werden durch Autoklavieren sterilisiert. Die anderen Komponenten werden nach dem Autoklavieren hinzugefügt, um hitzelabile Inhaltsstoffe zu erhalten. Bei Verwendung von pLS- und pLSG-basierten Vektoren bereiten Platten ohne Leucin vor. Bei Verwendung von pTS- und pTSG-basierten Vektoren bereiten Platten ohne Tryptophan vor. Protokolle 2-3
Synthetische selektive Medien: [0,17% Hefestickstoffbasis ohne AA und Ammoniumsulfat, 0,5% Ammoniumsulfat, 5% (v/v) nicht-essentielle Aminosäurelösung (0,04% Arginin, 0,04% Methionin, 0,06% Isoleucin, 0,1% Phenylalanin, 0,2% Glutaminsäure, 0,2% Asparsäure, 0,3% Valin, 0,4% Threonin, 0,8% Serin), 20 mg/L Histidin, 20 mg/L Uracile, 20 mg/L Tryptophan (je nach Vektorauswahlmarker), 30 mg/L Lysin, 100 mg/ml Leucin (je nach Vektorauswahlmarker), 200 mg/L Adenin] + 2% Dextrose oder Raff  Das Medium wird durch Filtration sterilisiert. Bei der Verwendung von pLS- oder pTS-basierten Vektoren in der medikamentösen Behandlung bereiten Sie Medien ohne Leucin oder Tryptophan vor, enthalten jedoch 2% Dextrose. Bei Verwendung von pLSG- oder pTSG-basierten Vektor enduzierbaren P53-Expression mit oder ohne medikamentöse Behandlung bereiten Medien ohne Leucin oder Tryptophan, aber mit 2% Raffinose und variabler Menge an Galaktose, um P53-Expression zu modulieren. Das Ausmaß der P53-Induktion kann auch durch Variation der Inkubationszeit moduliert werden. Protokoll 3
Minimale selektive Platten: 2% Glukose, 0,7% Hefestickstoffbasis (ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat), 50 mg/L Adenin, 50 mg/L Uracil, 50 mg/L Histidin, 50 mg/L Tryptophan (je nach Vektorauswahlmarker), 50 mg/L Leucin (je nach Vektorauswahlmarker), 2% Agar Das Medium wird durch Autoklavieren sterilisiert. Bei verwendung von pLS89-basierten Vektoren bereiten Medium ohne Tryptophan. Verwenden Sie pLS89-leerer Vektor (ohne Protein ausdrückend) als Negative Kontrolle. Bei Verwendung von pLS89-basierten und pGADT7-MDM2-Vektoren (Co-Expression von P53 und MDM2) bereiten Sie Medium ohne Leucin und Tryptophan vor. Verwenden Sie pLS89-empty und pGADT7 (beide ohne Protein) als Negativkontrollen. Bei Verwendung von pLS76-basierten Vektoren bereiten Medium ohne Leucin. Verwenden Sie pRS315 Vektor (kein Protein ausdrücken) als negative Kontrolle. Protokoll 4
Minimales selektives Medium: als minimale selektive Platten, aber ohne Agar Das Medium wird durch Filtration sterilisiert. Protokoll 4
Selektives Induktionsmedium: als minimales selektives Medium, aber mit 2% Galaktose statt Glukose Das Medium wird durch Filtration sterilisiert. Protokoll 4

Tabelle 2:Hefemedien.

Lösungsname und Rezept oder Primername und Sequenz Spezifische Funktionen und Verwendung Protokollnummer
LiAc/TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, mit 1 mM EDTA und 0,1 M Lithiumacetat Die folgenden sterilen Lagerlösungen in Wasser werden durch Autoklavieren hergestellt: 1M Lithiumacetat pH 7.5, 1 M Tris-HCl / 0.1 M EDTA pH 8.0 (TE Puffer 10X). Protokolle 1-4
PEG/LiAc/TE: 40% Polyethylenglykol (PEG) in 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, mit 1 mM EDTA und 0,1 M Lithiumacetat Folgende sterile Lagerlösungen in Wasser werden durch Autoklavieren hergestellt: 1 M Lithiumacetat pH 7,5, 1 M Tris-HCl / 0,1 M EDTA pH 8,0 (TE-Puffer 10X), 50% PEG (Molekulargewicht 3350). Protokolle 1-4
Homologieschwänze für die RE-Oligonukleotide:
5'-gcggaattgactttttttgaataatacat-RE-gcagatccgccaggcgtgtatatagcgtgg-3'		 Vorausgesetzt ist die Sequenz der Homologieschwänze, die den Chromosomensequenzen entspricht, die die integrierte ICORE-Kassette flankieren; RE = RE-Sequenz. Protokoll 1
Primer: Ade2 Fw: 5'-AAGTTGCCTAGTTTCATGAA-3';
Ade2 Rv: 5'-GGAGCCATTAACGGTCAT-3';
Luc1-Rv: 5'-CATAGCTTCTGCCAACCGAA-3'		 Für yAFM-RE Dehnung (PCR und Sequenzierung) kombinieren Ade2 Fw mit Ade2 Rv Primer. Für yLFM-RE Dehnung (PCR und Sequenzierung) kombinieren Ade2 Fw mit Luc1-Rv Primer. Protokoll 1

Tabelle 3: Lösungen und Oligonukleotide.

Arten von Vektoren Positive und negative Kontrollen Protokollnummer
P53-Vektoren (oder Steuerelement-Vektoren).
pLS- oder pLSG-basiert: P53-Proteinexpression unter konstitutivem ADH1-Promotor bzw. Galactose-induzierbarem GAL1-Promotor (LEU2 als Selektionsmarker).
pTS- oder pTSG-basiert: P53-Proteinexpression unter konstitutivem ADH1-Promotor bzw. Galactose-induzierbarem GAL1-Promotor (TRP1 als Auswahlmarker)		 pLS- und pLSG-basiert: Verwendung als Positivkontrolle die pLS76- bzw. pLSG-P53-Vektoren (Ausdrücke des Wildtyps P53); als Negativkontrollvektor pRS315 (kein Protein exsemitt).
pTS- und pTSG-basiert: verwenden sie als Positivkontrolle die pTS76- bzw. die pTSG-P53-Vektoren (ausdrückender Wildtyp P53); als Negativkontrollvektor pRS314 (kein Protein exemitt).		 Protokoll 2,3
P53- und MDM2-Vektoren (oder Steuerungsvektoren).
pLS89-basiert: Wildtyp P53-Proteinexpression unter Galactose induzierbarem GAL1-Promotor (TRP1 als Auswahlmarker).
pLS76-basiert: mutierte P53-Proteinexpression unter konstitutivem ADH1-Promotor (LEU2 als Selektionsmarker).
pGADT7-basiert: MDM2-Proteinexpression unter konstitutivem ADH1-Promotor (LEU2 als Selektionsmarker)		 pLS89-basiert: Verwendung als Positivkontrolle den pLS89-P53-Vektor (Ausdrücke des wilden Typs P53); als Negativkontrolle pLS89-leer (kein Protein exsekt).
pLS76-basiert: verwendung als Positivkontrolle den pLS76-mutierten P53-Vektor (Exzessierter Mutant P53); als Negativkontrollvektor pRS315 (kein Protein exsemitt).
pGADT7-basiert: Verwendung als Positivkontrolle den pGADT7-MDM2-Vektor (ausdrückender Wildtyp MDM2); als Negativkontroll-pGADT7-Vektor (kein Protein exemitt).		 Protokoll 4

Tabelle 4: Hefeausdrucksvektoren.

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Discussion

Hefebasierte Assays haben sich als nützlich erwiesen, um verschiedene Aspekte der P53-Proteinfunktionen zu untersuchen. Diese Assays sind besonders empfindlich für die Bewertung des P53-Transaktivierungspotenzials gegenüber Varianten von RE-Zielstandorten, einschließlich der Bewertung funktioneller Polymorphismen. Der Einsatz von Farbreportern sowie die Miniaturisierung des Luziferase-Assays führen zu kostengünstigen und relativ skalierbaren Assays. Außerdem ist der Wachstumsinhibitionstest potenziell für den Einsatz im chemischen Bibliotheksscreening geeignet, wodurch die Quantifizierung der Hefezelllebensfähigkeit durch die Messung der Absorption automatisiert wird. Während begrenzte Durchlässigkeit aufgrund der Zellwand und Wirkung von ABC-Transportern als eine Einschränkung bei der Verwendung von Hefe für das Arzneimittelscreening angesehen wurde, wurden genetische Modifikationen zur Verbesserung der Aufnahme erfolgreich entwickelt22,65.

Im Vergleich zu säugetierzellbasierten Assays kann der Hefe-basierte P53-Assay die Identifizierung von direkten Treffern verbessern, da P53 von der erstaunlichen Komplexität von Kofaktoren und signalierenden Kaskadenwegen isoliert ist, die seine Funktionen in höheren Eukaryoten modulieren. Hefebasierte funktionelle Assays waren auch teilweise erfolgreich bei der Überwachung der Wechselwirkung von P53 mit Proteinkofaktoren (nämlich MDM2 und MDMX22,32,33,34) und Moleküle (wie Nutlin-3a) auf diese Wechselwirkungen. Die Empfindlichkeit und Vorhersagekraft von Hefe-basierten Assays zur Untersuchung von Crosstalk zwischen P53 und interagierenden Proteinen kann jedoch etwas begrenzt sein, je nachdem, wie diese Wechselwirkungen in vivo von posttranslationalen Modifikationen und artenspezifische Signalkaskaden.

Die hier beschriebenen Systeme können einfach an andere TFs angepasst werden. Tatsächlich wurden Hefe-Funktionsassays für P53-bezogene P63- und P73-Proteine42,49 sowie Mitglieder der NF-B-Familie66,67 [oder sogar für einige Homeobox und Basis-Helix-Loop-Helix (bHLH) entwickelt. TFs68,69]. Menschliche Kernrezeptoren wurden auch in Hefe exprimiert und nachweislich als Liganden-abhängige, sequenzspezifische TFs70wirken. Ein begrenzender Faktor wurde in der schwachen Fähigkeit einiger Säugetier-Transaktivierungsdomäne (TAD) identifiziert, mit der Hefebasal-Transkriptionsmaschinerie8zu interagieren, ein Manko, das durch die Verwendung von chimarischen Konstrukten einschließlich einer aktiven heterolog tad68,69.

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Disclosures

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Acknowledgments

Wir danken der Europäischen Union (FEDER-Fonds POCI/01/0145/FEDER/007728 durch Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) und nationalen Fonds (FCT/MEC, Fundaéo para a Ciéncia e Tecnologia und Ministério da Educaéo e Ciéncia) unter der Partnerschaftsabkommen PT2020 UID/QUI/50006/2019 und die Projekte (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. FCT-Stipendien: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Diese Arbeit wurde von der Compagnia S. Paolo, Turin, Italien (Projekt 2017.0526) und dem Gesundheitsministerium(Projekt 5x1000, 2015 und 2016; aktuelle Forschung 2016) unterstützt. Wir danken Dr. Teresa Lépez-Arias Montenegro (Universität Trient, Lehrlaboratorien für experimentelle Wissenschaften) für die Unterstützung bei der Videoaufzeichnung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-Aspartic acid SIGMA 11189
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104
L-Phenylalanine SIGMA 78019
Peptone BD Bacto 211677
Yeast ex+A2:C26tract BD Bacto 212750
Difco Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate BDTM 233520
Lithium Acetate Dihydrate SIGMA 517992
Bacteriological Agar Type A Biokar Diagnostics A1010 HA
G418 disulfate salt SIGMA A1720
Ammonium Sulfate SIGMA A2939
L-Arginine Monohydro-chloride SIGMA A5131
Adenine Hemisulfate Salt SIGMA A9126
Passive Lysis Buffer 5x PROMEGA E1941
Bright-Glo Luciferase Assay System  PROMEGA E2620
5-FOA Zymo Research F9001
D-(+)-Galactose SIGMA G0750
L-Glutamic acid SIGMA G1251
Dextrose  SIGMA G7021
L-Histidine SIGMA H8125
L-Isoleucine SIGMA I2752
L-Lysine SIGMA L1262
L-Leucine SIGMA L8000
L-Methionine SIGMA M2893
PEG SIGMA P3640
D-(+)-Raffinose Pentahydrate SIGMA R0250
L-Serine SIGMA S4500
L-Tryptophan SIGMA T0271
L-Threonine SIGMA T8625
Uracil SIGMA U0750
L-Valine SIGMA V0500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Krebsforschung Ausgabe 150 P53 Hefe Ansprechelement funktioneller Assay Transkription Wachstumshemmung
Hefe als Chassis für die Entwicklung von funktionellen Assays zur Untersuchung von Human P53
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Monti, P., Bosco, B., Gomes, S., Saraiva, L., Fronza, G., Inga, A. Yeast As a Chassis for Developing Functional Assays to Study Human P53. J. Vis. Exp. (150), e59071, doi:10.3791/59071 (2019).

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