Summary
Cette étude détaille le processus des quantités précises de gavage des probiotiques pour souris néonatales. Le montage expérimental a été optimisé afin d’inclure, sans s’y limiter aux probiotiques dosage, méthodes d’administration et la quantification des bactéries dans les intestins.
Abstract
Modèles de souris adultes ont été employé couramment pour comprendre le mécanisme derrière la progression de la maladie chez les humains. L’applicabilité des études réalisées dans les modèles de souris adultes aux maladies néonatales est limitée. Pour mieux comprendre la progression de la maladie, réactions de l’hôte et l’impact à long terme des interventions chez les nouveau-nés, un modèle de souris néonatales probable est un meilleur ajustement. L’utilisation clairsemée de modèles murins néonataux est attribuable en partie aux difficultés techniques de travailler avec ces petites bêtes. Un modèle de souris néonatales a été développé pour déterminer les effets de l’administration de probiotiques en début de vie et d’évaluer plus précisément la capacité d’établir de colonisation dans le tractus intestinal des souris nouveau-nées. Plus précisément, pour évaluer la colonisation des probiotiques chez la souris néonatale, Lactobacillus plantarum (LP) a été livré directement dans le tube digestif de la souris néonatales. À cette fin, LP a été administré à des souris en se nourrissant par intra-oesophagiens gavage (IE). A développé une méthode hautement reproductible pour uniformiser le processus de gavage IE qui permet une administration précise des doses de probiotiques tout en minimisant le traumatisme, un aspect particulièrement important étant donné la fragilité des souris nouveau-nées. Limites de ce processus incluent les possibilités d’irritation oesophagienne ou de dommages et d’aspiration si gavés incorrectement. Cette approche représente une amélioration sur les pratiques actuelles parce que le gavage d’IE dans le œsophage distal diminue les risques d’aspiration. Après le gavage, le profil de colonisation des probiotiques a été tracé à l’aide quantitative PCR (qPCR) de l’extrait d’ADN intestinal avec des amorces spécifiques de LP. Les paramètres différents de la litière et les techniques de gestion de cage ont été utilisées pour évaluer le potentiel de propagation de la colonisation. Le protocole décrit en détail les subtilités de gavage de souris néonatales de IE et de la quantification de la colonisation subséquente avec LP.
Introduction
Chez les nourrissons, une exposition précoce probiotiques a été associée liée des effets immunomodulateurs conduisant à la réduction de l’incidence des maladies comme l’entérocolite nécrosante, la dermatite atopique et septicémie1,2,3, 4 , 5. Toutefois, le mécanisme derrière cette réponse immunomodulatrices est difficile à étudier compte tenu de la limitation à un échantillonnage dans des essais humains nouveau-né (tirages de sang séquentiels et biopsies). Modèles de souris néonatales peuvent aider à étudier les mécanismes d’action impliquée dans la régulation immunitaire néonatale, associée à l’utilisation de probiotiques et les changements de la microflore intestinale. Malheureusement, la plupart des modèles souris pour les probiotiques ont largement porté sur des souris adultes ; Toutefois, l’impact des probiotiques est susceptible d’être plus tôt dans la vie, ce qui suggère des modèles spécifiques pour ce groupe d’âge sera utile3,6. En outre, les modèles murins néonataux conviennent mieux à l’étude des maladies et des interventions prévues pour l’application au début de la vie des bébés humains qu’ils sont censés imiter davantage un système immunitaire et microbienne en développement7,8 ,9,10. Le but était d’étudier l’étendue et les patrons de colonisation des probiotiques de souris néonatales en mettant l’accent sur l’interaction mécanique entre l’hôte et son microbiome. Adapté descriptions des modèles nouveaux-nés ne se trouvaient pas dans la littérature, et donc un besoin pour l’élaboration d’une méthode robuste et standardisée a été adressé.
Les méthodes établies de l’administration orale de divers composés à des souris nouveau-nées incluent transfert maternel de composés désirés par le lait en traitant la source d’eau pour les mères enceintes11 ou en utilisant des aiguilles alimentation pour faciliter l’administration de la composés désirés dans l' oropharynx12. Ces méthodes sont utiles pour des expériences qui n’ont pas d’exigences de dosage précis et où le traitement est facilement ingéré par la souris destinataire. Les probiotiques sont souvent administrés en combinaison avec un prébiotique tels que galactooligosaccharide et fructo-oligosaccharide (FOS) qui servent comme source de nutrition pour les bactéries probiotiques ; ces composés font la solution visqueuse et difficiles à administrer via les méthodes mentionnées ci-dessus. Mettre au point une méthode pour administrer des quantités précises des probiotiques et des prébiotiques à des souris nouveau-nées commençant dès le premier jour de vie (DOL) était nécessaire. Dans le processus de développement de la technique de gavage, la possibilité de colonisation-propagation (tel qu’observé dans d’autres études de probiotiques entre le traitement et le contrôle bras13,14,15,,16) a été testé et l’abondance relative des colonisés Lactobacillus plantarum (LP) dans l’intestin des chiots avec des calendriers différents de gavage a été évaluée. La préparation de probiotiques utilisée dans les expériences se composait de 109 unités formant colonie (UFC) par gavage de LP (souche ATCC-202195), mélangé à FOS (prébiotique) et maltodextrine (excipient) tel que décrit dans le récent procès humain3. La livraison de probiotiques a été réalisée à l’aide de gavage de l’IE et le processus est détaillé dans le protocole ci-dessous. Le profil de colonisation des probiotiques a été évalué à l’aide en temps réel l’amplification de l’ADN extrait des intestins tout en utilisant des amorces spécifiques de LP.
Protocol
Toutes les procédures ont été menées concernant les lignes directrices établies par le personnel de soutien à l’Animal Care Facility à l’Université de la Colombie-Britannique, et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité de protection des animaux UBC.
1. quantification des probiotiques administrés
Remarque : Cette étape est recommandée pour déterminer le montant exact des probiotiques UFC qui peut être administré en dose unique. La quantité de probiotiques et de véhicule (FOS et maltodextrine) déterminent les conditions de saturation de la solution. De l’expérience, pas plus de 30 µL (~ 20 mL / kg) de fluide peut être administré à des souris sur DOL 2 comme n’importe quel grand volume augmente le risque d’aspiration.
- Préparer six tubes de microcentrifuge de 1,5 mL pour les dilutions en série avec chaque tube contenant 180 µL de solution saline stérile dextrose 5 %.
- Peser une quantité de 0,2 g d’un mélange de probiotiques-prébiotiques et dissoudre dans 1 mL de solution saline dextrose 5 % de façon stérile.
- Vortexer pendant 30 secondes et pipette briser les mottes. Répétez jusqu'à ce qu’aucun touffes visibles ne sont observées.
NOTE : Maltodextrine rend la solution visqueuse et contribuer à la saturation de la solution. - Effectuer une dilution en série à l’aide de tubes préparées à l’étape 1.1. Vortex pour mélanger.
- Plaque de 40 µL de chaque dilution sur un quadrant marqué de la gélose MRS. Planche de chaque dilution en double exemplaire.
- Incuber en anaérobie (ou microaérophiles) conditions à 37 ° C pendant 48 h dans un bocal vide à l’aide d’un pack de gaz.
- Compter chaque plaque dans une fourchette de 20 à 70 colonies par quadrant. Plaque moyenne compte avec la même dilution et calculer le retour à l’unité désirée.
2. préparation des probiotiques et des prébiotiques pour gavage
NOTE : La bonne dissolution de probiotiques et de prébiotiques est nécessaire pour assurer l’injection lisse du liquide par le biais de l’alimentation de l’aiguille pendant le gavage.
- Combiner la quantité requise de probiotiques lyophilisés organisme avec les montants souhaités des prébiotiques et des véhicules dans un tube de microcentrifuge stérile.
- Ajouter des quantités appropriées de solvant (saline de dextrose 5 %) pour dissoudre le mélange de probiotiques-prébiotiques.
Remarque : La capacité de dissolution est limitée par le prébiotique et véhicule utilisé. De l’expérience, la combinaison symbiotique (avec FOS et maltodextrine) atteint une saturation à environ 0,3 g/mL tout en se dissolvant dans un tube de microcentrifuge de 2 mL à l’aide de 1 mL de solvant. - Vortex à mélanger jusqu'à ce que toutes les matières solides dissoutes. Utiliser une pipette pour briser les globules de particules solides dans le solvant par pipetage de haut en bas.
- Incuber la solution dans un bain-marie à 37 ° C pendant 20 min.
Remarque : Cette étape peut être ignorée si la solution probiotiques-prébiotiques est issue d’une culture vivante. - Une série de cinq sur plaque dilution 10 fois sur plaques de gélose MRS avant le gavage de quantifier avec précision les probiotiques administrés pour le chiot. Cette étape peut être sautée si le nombre d’UFC précis n’est pas nécessaire.
3. préparation de la biosécurité du cabinet
- Utilisez une enceinte de sécurité biologique lorsque vous travaillez avec des probiotiques pour maintenir une technique aseptique. Définir la cage avec les mères et les petits sur une couverture chauffante (ensemble à environ 38 ° C) sur une moitié de la couverture. Placer une cage animale propre et vide sur l’autre moitié de la couverture chauffante.
- Place un absorbant désinfecté ou stérilisé, tampon sur la couverture chauffante pour s’occuper de la souris pendant le gavage.
- Collecter les matériaux de nidification pour les chiots du haut du nid existant, créé par barrage et créer une nouvelle coupe de nidification conique à l’aide des mains gantées, désinfecté avec de l’éthanol à 70 % et séché. Placez ce nouveau nid dans la cage tenue propre et vide. Ceci facilite le transfert de l’odeur du nid aux mains gantées et minimise ainsi l’introduction d’autres parfums sur le chiot lors de leur traitement pour la procédure, réduisant le risque de cannibalisation.
- Déplacer les petits dans le nid conique tenant cage et enlever la cage avec le barrage de l’armoire. Cela diminue le stress pour le barrage en l’empêchant d’entendre les chiots au cours de la procédure.
Remarque : Si le probiotique est un colonisateur connu des intestins murins, les conditions de traitement doivent être séparées par cages ou encore différente biosécurité armoires pour éviter la possibilité de traverser la colonisation.
4. Intra-oesophagiens gavage de souris néonatale
- Ouvrez l’emballage de la seringue pour un accès facile. Ouvrez l’emballage de l’aiguille de façon stérile et l’attacher à la tête de la seringue. Laver l’aiguille avec l’éthanol à 70 % et les stériliser avant l’intervention. Utiliser différents jeux d’aiguilles pour le traitement et le groupe de contrôle pour éviter la contamination.
- Dessiner un peu plus que la quantité désirée de probiotiques-colorant solution dans la seringue. Tenez la seringue vers le haut. Puis tirer vers le bas encore et feuilleter avec le doigt pour déloger les bulles et pousser sur le piston pour expulser les bulles et le volume de liquid supplémentaire jusqu'à ce que le volume désiré est atteint. Cela garantit qu’il n’y a aucun espace d’air dans l’aiguille. Pour DOL 2 souris, le volume de gavage ne doit pas dépasser 30 µL.
- Placez le chiot sur le tampon stérile absorbant sur le dessus du coussin chauffant. Utilisez l’aiguille alimentation (calibre 24, 1" longueur des aiguilles, diamètre boule 1,25 mm) externe pour mesurer la longueur de l’oesophage en plaçant le ballon de l’aiguille juste en dessous du processus xiphoïde (extrémité inférieure du sternum). Marquer l’aiguille au niveau du museau de noter la limite d’insertion de l’aiguille (Figure 1). Observer le chiot pour des signes de santé, qui comprennent une respiration régulière et une coloration rose de la peau.
- Trempez la pointe de l’aiguille dans le solvant de trempage (solution saline dextrose à 5 % ou - le moyen utilisé pour dissoudre les probiotiques et prébiotiques) pour lubrifier les surfaces externes de l’aiguille d’alimentation. Cela facilite l’entrée harmonieuse de l’aiguille dans le œsophage, de la souris.
- Soulevez le chiot par la peau du cou ou en appuyant doucement la tête et le corps entre le pouce et l’index. S’assurer que la tête, le cou et corps se déroulent dans une position droite. Ne tenez pas le chiot par la peau du cou pour plus de 60 s car il y a un risque d’obstruction de la trachée conduisant à l’asphyxie. S’assurer que le chiot peut respirer. Signes de scruffing trop dur peuvent inclure incapacité de respirer, haletant significative et la la langue sur la bouche. Surveiller la couleur du chiot et la respiration pendant toute la procédure.
- Insérez l’ampoule de l’aiguille au centre de la bouche du chiot à un angle de 45° sur le plan du torse jusqu'à ce qu’il atteigne le fond de la gorge.
- Modifier légèrement l’angle de l’aiguille en pivotant sur l’ampoule de l’aiguille et passer la seringue à l’abri de la personne de gavage (vers le côté dorsal du chiot) jusqu'à ce qu’elle est parallèle au plan de la colonne vertébrale du pup. Scruffing le pup permet de garder l’aiguille en place à l’arrière de la gorge et empêche également la souris se tortillant. Assurez-vous que le ballon de l’aiguille ne pas avancer ou exercez aucune pression contre le fond de la gorge pendant le changement de l’angle.
- Si la souris tente d’avaler l’aiguille, laissez-la naturellement glisser vers le bas et arrêter le mouvement lorsque le marquage sur l’aiguille s’aligne sur le museau. La seringue et l’aiguille sont généralement assez lourdes pour glisser le bas de la due à la gravité. Prise en charge du poids de l’aiguille en tout temps afin que l’aiguille glisse facilement vers le bas de le œsophage sans pression à la baisse de la personne qui remplit le gavage.
- Si l’aiguille rencontre la résistance à l’arrière de la gorge, retirer l’aiguille de gavage légèrement pour déloger la boule de l’aiguille et re-angle de l’aiguille à l’intérieur de la bouche vers la gauche de la souris (droit du gestionnaire) lentement en petits incréments de 1 mm. L’aiguille devrait commencer à glisser facilement vers le bas de le œsophage.
- Si l’aiguille s’arrête avant que le marquage sur l’aiguille atteint la bouche, ne pas injecter la solution.
- Ne gardez pas l’aiguille insérée pendant plus de 20 s. Dans ce cas, remonter l’aiguille lentement tout en gardant la seringue parallèle au torse et laisser le chiot reposent sur l’essuie-tout pour 30 s à 1 min. Try gavage à nouveau après la surface externe de l’aiguille avec le solvant de graissage.
NOTE : Anesthésie n’est pas utilisé pour la procédure comme réponse de la souris est nécessaire pour évaluer le succès de gavage.
- Lorsque le marquage sur l’alimentation de l’aiguille est au-dessus du museau et aligné avec la pointe du museau, ne laissez pas l’aiguille se déplacer ou tout avancer davantage. Injecter lentement le volume souhaité de liquide. Si le liquide est aspiré ou observé à bulle par le nez, arrêter l’injection immédiatement et rétracter lentement l’aiguille.
- Placez le chiot debout sur la serviette de papier sur le coussin chauffant pour aider à sa restauration. Surveiller de près pour les problèmes de respiration continue ou changement de couleur du chiot qui indique l’aspiration. Euthanasier les chiots qui ont aspiré immédiatement.
- Une fois que le gavage est terminée, Retirez doucement l’aiguille alimentation selon le même angle, qu'il a été inséré. Placez le chiot sur la serviette de papier sur le coussin chauffant chauffée. Attendre 10 s pour le chiot de retrouver une activité normale et la respiration. Une teinte rose saine doit apparaître sur le corps du chiot et le colorant ne devrait être visible dans le compartiment de l’estomac. Le ramener à la cage avec les autres programmes potentiellement indésirables.
NOTE : Colorant alimentaire bleu gavage est un excellent moyen de pratiquer la procédure décrite ci-dessus. Si le gavage est réussie, l’estomac de la souris sera visible comme une teinte bleue. Si la teinture bleue se trouve à l’extérieur de l’estomac du chiot (cou, poitrine ou région axillaire), l’animal devrait être humainement euthanasié (selon les règles de protection des animaux), car cela indique une rupture de le œsophage ou l’aspiration.
5. prélèvement d’échantillons d’intestional pour l’analyse de la colonisation
- Pendant le suivi ultérieur ou gavage, prélever des échantillons de selles microbiome des chiots.
Remarque : Le chiot souvent urine et défèque lorsque gavés et ce temps peut être utilisé comme une occasion pour recueillir les échantillons les microbiome analyse. - Pour la terminaison des expériences, recueillir les intestins du duodénum rectum après l’euthanasie des petits. Épingler le chiot à un Conseil chirurgical et désinfecter la peau avec l’éthanol à 70 %. Découper la peau en quatre quadrants sans endommager la couche péritonéale à l’aide d’outils stérilisés avec l’éthanol à 70 % et une stérilisation boudin chaud à 250 ° C.
- Utiliser un autre ensemble d’outils stériles pour couper le péritoine en quatre quadrants et éloignez-le de la centre de sorte que les organes viscéraux sont exposés.
- Localisez l’estomac et utilisez une pince à pincer sous le sphincter pylorique et à la fin du rectum. Courent la longueur de l’intestin à l’aide d’un outil pointu ou une pince pour rationaliser l’intestin et le libérer du tissu conjonctif et tissu mésentérique. Une fois que toute la longueur de l’intestin a été libérée du tissu conjonctif, coupé aux extrémités fixées.
- Marquer le papier d’aluminium avec l’orientation de l’intestin, envelopper d’une manière sûre et congeler à-80 ° C.
Remarque : La procédure d’extraction de l’ADN est réalisable à ce stade sans congélation. Le colorant bleu a également été vu passer dans l’intestin en 24 h et prélèvement d’échantillons pour analyse de colonisation est meilleur lorsque les intestins sont collectées au moins 24 heures après le gavage dernier. Signaux pourraient être amplifiées avant que validant par les bactéries non-respecté transitoirement en passant par le mélange de gavage.
6. extraction de l’ADN des intestins pour l’analyse de la colonisation
Remarque : L’extraction de l’ADN se faite à l’aide d’une trousse commerciale avec optimisation des modifications apportées au protocole pour l’extraction d’ADN intestin. S’assurer que l’appareil de chauffage est réglée à la température désirée et les solutions qui ont besoin de modifications ou de préchauffage sont préparées convenablement.
- Préparer le tampon de lyse enzymatique (ELB) comme suit : faire une solution avec le 20 mM Tris-Cl, EDTA sodique de 2 mM et 1,2 % X-100 Triton. Ajuster le pH à 8.0. Juste avant d’utiliser ELB, ajouter lysozyme à une concentration finale de 20 mg/mL.
- Pré peser les tubes de perles grenat sur balance analytique avec les bouchons enlevés.
NOTE : Ceci est fait afin que si le poids requis est dépassé, il est plus facile de supprimer le contenu intestinal. - Coupez les intestins en petits segments à l’aide d’un scalpel stérile jetable et ramasser les segments souhaités dans les tubes de perles de grenat pré-pesés.
Remarque : Veillez à modifier les bistouris entre chaque échantillon ADN est omniprésent et peut affecter les résultats de PCR. - Ajouter 1 mL de ELB avec lysozyme (de l’étape 6.1) dans chaque tube, placer sur le batteur de perle de vortex et démarrer à réglage maximum (14) pendant 5 minutes.
- Une fois que le tissu est perturbé, transférer les tubes dans le bain-marie à 37° C et incuber pendant 30 minutes.
Remarque : Cette étape est faite pour activer lysozyme et provoquer la rupture du peptidoglycane de la paroi cellulaire des bactéries gram-positives. - Préparer les tubes avec 20 µL de protéinase K pour chaque échantillon à une concentration de 600 mAU / mL.
- Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 10 minutes. Le lysat devrait regard clair avec des résidus de tissus sur le dessus des perles.
- Transférer 180 µL de liquide surnageant (la phase supérieure) dans un tube contenant la protéinase K et puis ajouter 200 µL de tampon de AL dans le tube. Vortexer pendant 15 s pour mélanger.
- Placer les tubes sur le bloc de chauffage à 56 ° C pendant 10 minutes.
- Ajouter 200 µL d’éthanol à 100 % dans le tube et mélanger au vortex pendant 15 s.
- Ajouter environ 600 µL de lysat de la colonne (du jeu).
- Centrifuger pendant 1 minute à 8 000 x g. Jeter les traversent.
- Répétez l’étape 6.12 jusqu'à ce que tous le lysat a été attirée par le biais de la colonne.
- Placer la colonne dans un nouveau tube de prélèvement. Ajouter 500 µL de tampon de AW1 et centrifuger à 8 000 x g pendant 1 minute.
- Jeter le débit à travers. Ajouter 500 µL de tampon AW2 et centrifuger à 8 000 x g pendant 3 min.
- Jeter le débit à travers et centrifuger la colonne dans un tube de collection vide à 8 000 x g pendant 3 min.
- Transférer la colonne de tube d’élution de l’ADN. Ajouter 60 µL d’eau ultrapure de PCR grade directement sur la membrane et incuber pendant 2 minutes à température ambiante.
- Utiliser l’eau de l’élution pré chauffé à 37 ° C pour éluer. L’élution peut être faite deux fois en utilisant la moitié du volume d’élution finale et répéter l’étape 6.15 deux fois pour augmenter le rendement.
- Centrifuger pendant 1 minute à 8 000 x g pour éluer ADN.
- Mesurer la concentration de l’ADN élué à l’aide de la méthode de quantification souhaitées. Les rendements du processus d’extraction sont de l’ordre de 10 à 40 ng/µL ADN.
- Stocker l’ADN éluée à-20 ° C.
7. installation de qPCR
- Conditions d’amplification
- Allumez la machine et charger le programme dans le tableau 1 dans une machine de qPCR en temps réel.
- Boucle d’étapes 3 à 5 dans le tableau 1 pour 40 cycles et maintenir l’échantillon à 4 ° C à la fin de la réaction.
- Montage expérimental de PCR
- Utilisez les amorces et la température figure au tableau 2. Utilisez les concentrations et les conditions de la réaction au tableau 3. Mettre en place chaque réaction en trois exemplaires au contrôle des variations procédurale.
- Placer la tubes/plaque de réaction PCR dans le système de qPCR et l’exécution du programme chargé dans le système de l’étape 7.1.
- Retirer le tube à la fin de la course, placez-le sur la 4 ° C et préparer pour le gel de chargement.
8. la quantification de la colonisation de LP
- Préparer qPCR mélanges 10 µL ou 20 µL réactions, selon le tableau 3.
- LP genomic DNA courbe standard 107 à 101 copies/µL
Remarque : Étant donné que 4 µL de chaque dilution va être plaqué, 107 exemplaires en 4 µL ou 2,5 x 106 copies par µL est nécessaire dans le stock de départ. Utiliser le même principe pour le reste de la courbe.- Préparer une dilution 1:4:107 copies par µL dans 50 µL.
3.147 µL de LPDNA + 46.85 µL de dH2O = 2,5 x 106 copies par µL - En série diluer 10 fois : ajouter 5 µL 45 µL dH2O pour 1,25 x 105 copies/µL.
- Plaque 4 µL par dilution / puits.
- Préparer une dilution 1:4:107 copies par µL dans 50 µL.
- Visualisation des amplicons LP
- Utiliser un gel d’agarose à 2 % pour atteindre une séparation nette entre le ~ 197 fragments amplifiés de la LP bp.
- Charge 9 µL de chaque produit de la PCR dans le gel.
- Exécutez le gel pendant 30 minutes à 120 V.
Representative Results
L’originalité de cette méthode réside dans son adaptation de la technique de gavage à la taille et la fragilité d’une souris néonatale. La section précédente décrit les étapes importantes dans l’accomplissement d’une procédure de gavage avec succès sur une souris 2 DOL. Pour établir une échelle de quantification bonne, une courbe d’étalonnage a été générée à l’aide de pure LP ADN avec trois répétitions techniques (Figure 2). La courbe d’étalonnage fournie une gamme dynamique de détection de l’ADN de LP en utilisant les amorces. La dynamique se situait entre 7 et 28 cycles où une gamme de 101 107 copies de l’ADN de LP a été détecté. La pente régulière de la courbe standard représenté l’efficacité et l’évolutivité de la réaction.
La procédure de gavage IE a été utilisée chez la souris adulte avec une relative facilité. Toutefois, le tube digestif supérieur d’une souris néonatal est fragile et requis mouvements calibrés le gavage d’aiguille au cours de la procédure. Gavages répétés pourraient augmenter les chances d’intra-oesophagiens irritations, blessures et échec ou rejet par le barrage en raison de la manipulation. Ainsi, deux annexes de gavage différentes ont été testés et la colonisation de l’intestin a été quantifiée à l’aide d’ADN des homogénats entier intestins. Les souris étaient gavés de DOL 2 à 8 de DOL avec probiotique administrée tous les jours ou tous les deux jours (Figure 3). Chaque échantillon contenait une adaptation technique et toutes les conditions avaient au moins deux réplicats biologiques. Les chiots gavés chaque jour avec 7 doses avaient environ 103 copies de LP tandis que les petits gavées tous les deux jours avec 4 doses ont environ 105 exemplaires. La cohérence des résultats entre les réplicats ajouter du crédit à la précision de la technique. Il n’y avait plus LP détectée dans les intestins des bébés gavés tous les deux jours par rapport aux rejetons qui ont reçu par gavage tous les jours. Compte tenu de cela, expériences ultérieures ont été mis en place avec un calendrier de gavage des alternats puisqu’il réduit également le stress pour les chiots.
Il est important d’éviter les probiotiques intra-litière contamination croisée lorsque vous travaillez avec des probiotiques. Le microbiome de même portée devait être similaire qu’ils partagent la même mère et l’environnement de nidification. Cela s’avère un problème pour les études des probiotiques, si les conditions de traitement et de contrôle étaient présentes au sein de la même portée que l’organisme de probiotiques a le potentiel pour devenir une partie de la microflore ("répandre la colonisation '). Pour déterminer si un probiotique va contaminer et coloniser non traitées de même portée, la moitié d’une litière a été gavés comme ci-dessus et les intestins ont été recueillies pour qPCR. Analyse de qPCR intestinale de souris DOL 10 a montré attendue d’amplification d’ADN de LP chez les souris gavées, mais aussi, dans une moindre mesure dans la même portée non gavés (Figure 4). Les intestins des souris DOL mêmes dans une cage non traitée ont montré aucune amplification ou l’amplification minimale à cycles supérieur à 32. Cela a prouvé pour le partage communautaire du microbiome dans une litière dans une cage. Ainsi, pour des expériences avec des probiotiques, les groupes de traitement doivent être séparés par cages au contrôle de la variabilité par contamination croisée. L’utilisation de barrages nourriciers sont envisageables si une expérience doit être mis en place dans un réglage de la litière, mais les effets de confusion comme soins diminuée du barrage nourricier et rejet devrait être évaluée et optimisé pour. Lorsque les souris gavées jusqu'à DOL 8 ont été laissés sans traitement pendant six jours et l’ADN intestinale a été analysée à DOL 14, environ 10 copies de LP ont été trouvées (Figure 5). Ainsi, la colonisation du LP s’est avérée pour être transitoire et la population détectable a diminué au fil du temps.
Figure 1 . Mesurer la longueur entre le processus xiphoïde (extrémité inférieure du sternum) et le museau à rendre maximale d’insertion marquant pour l’aiguille. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Courbe d’étalonnage établie à l’aide des amorces de LP et ATCC LP ADN. Une dilution en série de l’ATCC LP ADN a été effectuée pour déterminer la fourchette détectable dynamique pour les amorces utilisées dans l’étude. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Amplification de LP de l’ADN intestinale de DOL 10 petits traités entre DOL 2 et 8 DOL de gavages réguliers tous les jours (7 doses) et tous les autres jours (4 doses). Gavage tous les deux jours a montré supérieur LP intestinale en comparaison de gavage tous les jours. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Amplification de LP de l’ADN intestinale de DOL 10 petits avec 2 traités et 2 n’est pas traité dans une portée de 4 chiots. Le gavage était entre DOL 2 et 8 de DOL en gavages réguliers tous les jours (7 doses). Le probiotique deux traités chiots spectacle le profil d’amplification attendu. Les chiots non traitées montrent l’amplification variable de LP indiquant le partage des communaux de l’organisme de probiotiques dans une litière. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Amplification de LP de l’ADN intestinale de DOL 14 petits traités entre DOL 2 et 8 DOL de gavages réguliers tous les jours (7 doses) et tous les autres jours (4 doses). Les baisses de charge LP ci-dessous cycle 28 indiquant apurement des LP au cours des 6 jours post dernier probiotique gavage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Étape | Température | Temps |
| 1 | 50 ° C | 2 minutes |
| 2 | 95 ° C | 3 minutes |
| 3 | 95 ° C | 30 secondes |
| 4 | 58 ° C | 30 secondes |
| 5 | 72 ° C | 30 secondes |
Table 1. conditions d’amplification de qPCR. La température et un certain nombre de conditions de cycle pour la réaction PCR.
| Objectif | Espaceur intergénique 16 s-23 s |
| Taille des fragments attendus | 144 bp |
| Apprêt Tm | 58˚C |
| Avant apprêt (FP) | LPN-1 : TGG ATC ACC TCC TTT CTA AGG AAT |
| Apprêt inverse (RP) | LPN-2 : CAT CGG TTT TCT TGT TAT GAA AAA ATA |
Le tableau 2. Détails des composants de la réaction de qPCR. Les détails sur les amorces, leur température de recuit et de taille des fragments attendus lors de la réaction PCR.
| Concentration de | Réaction de 10µl | Réaction de 20 µL | |
| Modèle de l’ADN | 200 pg/µL | 1 ΜL | 1 ΜL |
| SYBR Master Mix | - | 5 ΜL | 10 ΜL |
| FP | 10 ΜM | 0,3 ΜL | 0,6 ΜL |
| RP | 10 ΜM | 0,3 ΜL | 0,6 ΜL |
| dH2O | - | 3.4 ΜL | 8.8 ΜL |
Tableau 3. Par les concentrations et volumes de la réaction. La concentration des réactifs et des volumes pour les réactions.
Discussion
La procédure de gavage IE a été développée pour gérer en toute sécurité une dose précise d’un probiotique à souris néonatales. De petites quantités de liquide sont livrées pour le tube digestif supérieur en utilisant une aiguille alimentation afin d’éviter l’aspiration tout en assurant la livraison de la posologie à titre confidentiel. Les intestins des souris ont été prélevés pour analyse de colonisation deux et six jours après gavage. La procédure d’extraction de l’ADN a été modifiée afin d’assurer un rendement élevé de l’organisme de bactéries gram-positives de probiotiques. L’analyse de qPCR de l’ADN extrait deux jours post dernier gavage a montré relativement plus élevée colonisation de LP chez les souris gavées tous les deux jours par rapport aux souris gavées tous les jours entre DOL 2-8. Il y avait aussi une diminution de la quantité de LP sur six jours, montrant ce probiotique un organisme transitoire dans l’intestin de la souris. Les résultats de ces expériences établissent les conditions pour mener des recherches avec une grande rigueur dans ce groupe d’âge.
Pour observer les effets à long terme des probiotiques chez les souris néonatales, il a été administré à des souris néonatales sur 2 de DOL ; un temps de départ similaire point à l’essai chez l’humain. L’alimentation oropharyngée de souris néonatales est décrit précédemment dans la littérature et a été effectuée seulement après DOL 5-812,17 , lorsque le risque d’aspiration est plus faible en raison d’une mécanique bien développée de déglutition. Cependant, oropharyngée alimentation n’est pas bien adapté pour DOL 2 souris que des taux plus élevés d’aspiration ont été observés dans l’étude pilote (données non présentées). La nature visqueuse des probiotiques et prébiotique solution ajoutée au risque d’aspiration. Conformément à la procédure de gavage IE réduit au minimum les risques d’aspiration dans DOL 2 souris tout en fournissant le volume désiré directement au tube digestif supérieur. Le succès de la procédure a été tout d’abord validé à l’aide de colorant alimentaire infusé probiotique gavage. Le colorant alimentaire agit comme un marqueur qui est visible à travers la peau du chiot. Pas d’effets négatifs ont été observés chez les souris gavées avec colorant alimentaire, et il est recommandé de valider la procédure de gavage de cette manière avant d’entreprendre des expériences à grande échelle. La résolution rapide de l’halètement gavage réflexe post vu également utilisable comme un indicateur additionnel pour un gavage réussie. Une fois que la souris est placée sur la couverture chauffante après gavage, le réflexe haletante se calmer et on observera une augmentation de la fréquence de la respiration dans les 20 secondes. La poursuite du réflexe haletante pendant plus de 30 secondes indique un échec de gavage. Gavage réussie dépend également approprié d’insertion de l’aiguille d’alimentation avec l’ampoule assis juste au-dessus de l’ouverture du sphincter cardiaque de l’estomac. Cela peut être facilité en veillant à ce que le marquage sur l’aiguille, mesurer la longueur entre le processus xiphoïde et la pointe du museau, ne va pas passé le museau de la souris pendant le gavage. Cela minimise les risques de blessures à la souris. La fréquence de gavage peut avoir un impact significatif sur les résultats expérimentaux. Gavage fréquente peut également créer plus de stress pour les chiots et la mère en raison de la perturbation constante de la cage et le nid. Le calendrier de gavage plus optimal est lorsque les gavages sont les moins fréquentes et sur une durée plus courte de temps sans perdre l’effet escompté dans le système. Pour assurer la sécurité et la stérilité de la procédure le gavage aiguille doit être stérilisé par lavage et utilisation entre-deux autoclavage. Laver rigoureusement sur l’extérieur avec un gommage et l’intérieur en forçant l’eau à travers l’aiguille à l’aide d’une seringue avant autoclavage est nécessaire que les particules restes peuvent incruster sur l’aiguille durant l’autoclavage et peuvent interférer avec la procédure de gavage.
Colonisation de LP plus élevée a été observée chez les chiots qui ont été gavés chaque autre jour comparativement à petits gavés chaque jour. Cela peut être dû à la réduction du stress sur les chiots gavés tous les deux jours et, éventuellement, le probiotique plus d’éléments nutritifs : alertez les relativement plus de lait ingéré par ces chiots. La dépendance de dose du traitement probiotique a été étudiée précédemment dans des souris modèles18,19 , et l’administration de la dose correcte est donc importante. La solution probiotique préparée est plaquée avant chaque gavage pour obtenir un compte précis des UFC administré. Si l’organisme de probiotique est anaérobie, il est important de voir s’il y a différence dans UFC lorsqu’il est cultivé par voie aérobie ou anaérobie. Étant donné que le LP est une anaérobie facultatif, il était cultivé en utilisant les deux méthodes et a observé aucune différence dans l’UFC.
L’analyse de la charge de LP intestinale post gavage a été fait à l’aide d’échantillons d’ADN de qPCR et de qualité. Pour minimiser la contamination de LP ADN entre le traitement et les groupes témoins, différentes aiguilles, l’alimentation biosécurité armoires et appareils d’électrochirurgie servaient à assurer la plus haute qualité des échantillons. La mesure exacte des probiotiques dans l’intestin requis une méthode d’extraction de l’ADN optimisée. Méthodes les plus efficaces pour l’extraction de l’ADN dans les selles implique plusieurs perle battant étapes20,21,22. Cette méthode a été adoptée pour l’extraction des bactéries intestinales à l’aide de coups de talon et observée une représentation réduite (< 102 exemplaires récupérés) de LP dans l’intestinale entier extraction de l’ADN. LP est un organisme de Gram positif avec une quantité substantielle de peptidoglycane de la paroi cellulaire, le protocole a été optimisé avec une étape de dissolution de peptidoglycane à l’aide de lysozyme23,24 , ajoutée au tampon de lyse enzymatique. Cette augmentation de la représentation de LP dans le même échantillon intestinale de plus de deux fois. Le traitement de lysozyme assure la dissolution de la couche externe, tandis que le talon battant étape facilite la lyse de l’organisme. Optimisation de la quantité de tissu, du type de perle grenat et la durée de la perturbation à l’aide des perles sont nécessaires pour l’obtention des produits ADN optimales pour effectuer l’analyse PCR.
L’impact positif des probiotiques administrés en prophylaxie ou traitement chez les nouveau-nés prématurés et à terme est attestée dans les récentes études25,26,27,28. La mise en place d’un modèle de souris néonatales appropriée pour les probiotiques est garanti pour décompresser l’effet protecteur des probiotiques. Ce protocole décrit ici représente un guide pour les chercheurs peu familiers avec le travail de souris néonatales à l’aide de probiotiques. Malgré les problèmes avec les rongeur microbiote tout en étudiant la maladie et la santé humaine, cette méthode peut être étendue à la recherche visant à comprendre les changements de la microbiome due à des probiotiques. Ce modèle fournit également une plate-forme pour étudier l’interaction hôte-microbe et les réponses immunitaires au cours des différentes étapes du développement.
Disclosures
Aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Merci pour le personnel de l’établissement de soins des animaux et les vétérinaires de l’UBC pour la formation et l’aide à la souris travaillent au BC Children Hospital Research Institute. Merci à l’Université de la Colombie-Britannique et au département de médecine expérimentale pour l’étude de financement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL tuberculin syringe with slip tip | BD | 309659 | |
| 1.2% Triton X-100 | Millipore-Sigma | X100-100ML | |
| 2 mM sodium EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | |
| 20 mM Tris·Cl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| 5% dextrose and 0.9% NaCl injection solution | Baxter Corp. | JB1064 | |
| Alphaimager | Alpha Innotech | N/A | Gel imaging system |
| Anaerobic jar | Millipore-Sigma | 28029-1EA-F | 2.5 L |
| BD GasPak EZ anaerobe container system sachets | BD | 260678 | |
| BD Difco Lactobacilli MRS Broth | BD | 288130 | |
| Disruptor Genie | Scientific Industries Inc. | SI-D236 | |
| Feeding/oral gavage needles for newborn mice and rats | Cadence Science Inc. | 01-290-1 | 24 Gauge, 1” needle length, 1.25 mm ball diameter |
| Fructooligosaccharides | Millipore-Sigma | F8052 | from chicory |
| Garnet bead tubes 0.70 mm | Qiagen | 13123-50 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 172-5120 | |
| Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al. | ATCC | BAA-793 | for qPCR standard curve |
| Lyophilized probiotic bacteria | N/A | N/A | |
| Lysozyme | Thermo Fisher Scientific | 89833 | |
| Maltodextrin | Millipore-Sigma | 419672 | dextrose equivalent 4.0-7.0 |
| Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 1704406 | Gel chamber |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAamp Blood and Tissue kit | Qiagen | 51504 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4376600 | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| Ultrapure dH2O | Invitrogen | 10977023 |
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