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Genetics

Écrans un hybride levure améliorée afin d’identifier le facteur de Transcription lie à des séquences de l’ADN humain

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/59192
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici une levure améliorée hybride un filtrage de protocole afin d’identifier les facteurs de transcription (TFs) qui peuvent se lier à une région d’ADN humaine d’intérêt. Cette méthode utilise un pipeline de criblage à haut débit qui peut interroger la liaison de > 1 000 TFs dans une expérience simple.

Abstract

Identifier les ensembles de facteurs de transcription (TFs) qui régissent chaque gène humain est une tâche ardue qui nécessite l’intégration de nombreuses approches expérimentales et informatiques. Une de ces méthodes est l’essai (Y1H) un hybride de levure, quelles interactions entre TFs et ADN régions sont testées dans le milieu du noyau de la levure à l’aide de gènes rapporteurs. Y1H essais comportent deux volets : un « ADN-appât » (par exemple., promoteurs, exhausteurs, silencieux, etc.) et une « TF-proie, » qui peut être projetée pour l’activation du gène rapporteur. Plus les protocoles publiés pour l’exécution de Y1H écrans sont basées sur la transformation des bibliothèques TF-proies ou des tableaux dans les souches de levures ADN-appât. Ici, nous décrivons une canalisation, appelée Y1H améliorée (eY1H) essais, où les interactions ADN-TF sont interrogées par l’accouplement d’ADN-appât souches avec une collection déployèrent de souches de TF-proies à l’aide d’une matrice haute densité plate-forme de robotique (HDA) qui permet le dépistage dans un 1 536 format de la colonie. Ce qui permet une augmentation dramatique du débit (60 séquences ADN-appâts contre > 1 000 TFs prend deux semaines par chercheur) et reproductibilité. Nous illustrons les différents types de résultats escomptés en testant les séquences promoteur humain contre un tableau de 1 086 TFs humaines, ainsi que des exemples des problèmes qui peuvent survenir pendant les écrans et comment les résoudre.

Introduction

Un problème central dans le domaine biomédical consiste à déterminer les mécanismes par lequel chaque gène humain est réglementé. La transcription est la première étape dans le contrôle des niveaux d’expression de gène, et elle est régulée par des ensembles de facteurs de transcription (TFs) qui sont uniques à chaque gène. Étant donné que les humains codent pour > 1 500 TFs1,2, identifier l’ensemble des TFs qui contrôlent l’expression de chaque gène reste un défi ouvert.

Deux types de méthodes permet de mapper des interactions ADN-TF : méthodes TF-centrée et axée sur l’ADN3 (Figure 1 a). Dans les méthodes axées sur la TF, TF d’intérêt est sondé pour lier à des régions d’ADN génomiques ou pour déterminer sa spécificité de liaison de l’ADN. Ces méthodes incluent immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) suivie de séquençage haut-débit, protéine liant microarrays et SELEX4,5,6. Dans les méthodes axées sur l’ADN, une séquence d’ADN d’intérêt est sondée pour déterminer l’ensemble des TFs qui se lient à la séquence d’ADN. La plus largement appliquée de telles méthodes est essais (Y1H) de levure un hybride, quelles interactions entre TFs et ADN régions sont testées dans le milieu du noyau de la levure à l’aide de gènes de journaliste pour7,8,9.

Y1H essais comportent deux volets : un « ADN-appât » (p. ex., promoteurs, exhausteurs, silencieux, etc.) et une « TF-proie, » ce qui peut être projetée pour le journaliste gene activation9,10 (Figure 1 b). L’ADN-appât est cloné en amont du reporter deux gènes (LacZ et HIS3) et les deux constructions de DNA-bait::reporter sont intégrées dans le génome de la levure pour générer des chromatinized « ADN-appât souches. » La TF-proie, encodée dans un plasmide qui exprime une TF fusionné au domaine d’activation (AD) de la levure Gal4 TF, est introduite dans la souche ADN-appât pour pêcher des interactions ADN-TF. Si la TF-proie se lie à la séquence de l’ADN-appât, puis l’annonce présente dans la TF-proie entraînera l’activation de ces deux gènes rapporteurs. Ainsi, les cellules avec une interaction positive peuvent être sélectionnés pour la croissance sur plaques manque histidine, mais aussi de surmonter un inhibiteur compétitif, 3-Amino-1,2,4-triazole (3-AT) et visualisées comme colonies bleues en présence de le X-gal. Parce que la levure puissante Gal4 AD est utilisé, Y1H essais peuvent détecter des interactions impliquant des activateurs de la transcriptionnelles, mais aussi des répresseurs. En outre, étant donné que TF-proies sont exprimés à partir d’un promoteur fort levure (ADH1), des interactions peuvent être détectées même pour TFs qui ont des niveaux de faible expression endogènes, qui sont difficiles à détecter par puce11,12.

Plus les protocoles publiés pour effectuer des essais de Y1H reposent sur introduction TF-proies dans les souches de levure ADN-appât en transformant regroupées TF-proie bibliothèques, suivies par la sélection, la colonie cueillette et séquençage d’identifier l’interaction TF ou par transformer des clones8,9. Voici les protocoles chronophages, limitant le nombre de séquences d’ADN qui peuvent être testés par chercheur. Une amélioration récente des essais de Y1H, appelé enhanced Y1H (eY1H), a considérablement accru le débit de dépistage à l’aide d’une plateforme robotique de haute densité (HDA) de tableau se pour accoupler des souches de levures ADN-appât avec une collection de souches de levures, chacune exprimant un autre TF-proie10,13 (Figure 1). Ces écrans emploient une colonie 1 536 format permettant de tester TFs plus humaines en quatre exemplaires, à l’aide de seulement trois besants. En outre, étant donné que les interactions ADN-TF sont analysées d’une manière par paires, cette approche permet de comparer les interactions entre l’ADN-appâts (par exemple, deux variantes de nucléotides non codantes) et entre différents TFs ou TF variantes11,12 ,,14.

Utilisant l’eY1H, nous avons délimité l’homme plus grand et Caenorhabditis elegans TF-ADN ADN-centrée interactions entre réseaux à ce jour. En particulier, nous avons identifié 2 230 interactions entre 246 exhausteurs de développement humains et 283 TFs12. En outre, nous avons utilisé des épreuves d’eY1H pour découvrir la liaison TF modifiée à 109 variantes non codantes nucléotide, associées à des maladies génétiques telles que la malformation du développement, le cancer et des troubles neurologiques. Plus récemment, nous avons utilisé eY1H pour délimiter un réseau comprenant 21 714 interactions entre 2 576 promoteurs de gènes de c. elegans et 366 TFs11. Ce réseau a contribué à révéler le rôle fonctionnel de dizaines de c. elegans TFs.

Les protocoles pour générer des taches de l’ADN-appâts et évaluer les niveaux d’activité de journaliste de fond ont été signalés ailleurs15,16,17. Nous décrivons ici un pipeline eY1H qui peut être utilisé pour n’importe quelle région d’ADN génomique humaine contre un tableau de 1 086 TFs humaines de l’écran. Une fois une levure souche ADN-appât est générée et un tableau de TF-proies est repéré sur les plaques correspondantes, l’ensemble du protocole peut être effectué en deux semaines (tableau 1). Plus important encore, le protocole peut être parallélisé afin qu’un seul chercheur peut dépister 60 séquences ADN-appât en même temps. Pour illustrer le protocole, les auteurs ont criblé les promoteurs des deux gènes de cytokines CCL15 et IL17F. En outre, nous montrons résultats à partir des écrans ayant échouées pour illustrer les types de problèmes qui peuvent survenir lors de l’exécution des essais eY1H et comment les résoudre.

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Protocol

1. les préparatifs

  1. SC −U −H boîtes (150 mm pétri)
    Remarque : Ces plaques serviront pour les souches de levure ADN-appâts de plus en plus.
    1. Dissoudre le mélange de l’abandon, levure azote base (YNB), adénine hemisulfate et sulfate d’ammonium à 920 mL d’eau et le pH à 5,9 avec 5 M NaOH (environ 1 mL / litre de médias ; voir le tableau 2 pour la composition). Verser dans un flacon de 2 L et ajouter un.
    2. Dans un deuxième flacon de 2 L, ajoutez l’agar à 950 mL d’eau (ne pas ajouter une barre de remuer ce qui provoquerait l’agar à ébullition à feu à l’autoclave).
    3. Stériliser pendant 40 minutes à 15 lb/po2 sur un cycle de liquid.
    4. Versez immédiatement le contenu du premier ballon, y compris la barre de l’émoi, dans la gélose contenant la fiole. Ajouter le glucose, mélanger bien sur une plaque de remuer et laisser refroidir à 55 ° C dans un bain d’eau.
    5. Ajouter la leucine et le tryptophane aux médias. Mélanger bien sur une plaque de remuer et verser dans les plats de pétri stérile de 150 mm (~ 80 mL par plat). Sécher pendant 3 à 5 jours à température ambiante, envelopper dans des sacs en plastique et conserver à température ambiante pendant 6 mois.
  2. Plaques rectangulaires YAPD
    Remarque : Ces plaques serviront pour la culture de la pelouse pour la souche ADN-appât et pour s’accoupler avec la collection de tableau TF.
    1. Dissoudre les poudres (voir le tableau 3 pour la composition), à l’exception de l’agar, en 950 mL d’eau dans un flacon de 2 L et ajouter un.
    2. Dans un deuxième flacon de 2 L, ajoutez l’agar à 950 mL d’eau (ne pas ajouter une barre de remuer ce qui provoquerait l’agar à ébullition à feu à l’autoclave).
    3. Stériliser pendant 40 minutes à 15 lb/po2 sur un cycle de liquid.
    4. Versez immédiatement le contenu du premier ballon, y compris la barre de l’émoi, dans la gélose contenant la fiole.
    5. Ajouter le glucose, mélange bien sur une assiette pour remuer et laisser refroidir à 55 ° C. Introduire des médias dans les boîtes rectangulaires (voir Table des matières; ~ 70 mL par plaque) à l’aide d’une pompe péristaltique (5 mL/s) et un tube de 6 mm. Sec 1 nuit à température ambiante, envelopper dans des sacs en plastique et stocker dans la chambre froide jusqu'à 6 mois.
      Remarque : Bien que le volume de médias suggérée est 70 mL par plaque, 50 à 80 mL par plaque peut être utilisé. Les trois éléments essentiels à considérer quelle battante plaques sont 1) qu’ils sont mis à niveau afin que le milieux gélosés a tout au long de la plaque de la même épaisseur (utiliser une table nivelé ou la surface pour le coulage de la plaque et ne pas verser dans les piles de plus de sept assiettes) 2) pour assurer l’absence de bulles dans l’agar médias (bulles doivent être sautés à l’aide d’une aiguille stérile) et 3) séchage des plaques pour une seule journée et les plaques d’emballage dans des sacs en plastique pour éviter les échecs en épinglant la levure.
  3. SC −Trp et plaques rectangulaires de Sc −U −Trp
    Remarque : Ces plaques serviront pour la culture de la collection de tableau TF (Sc −Trp) et de sélectionner des levures diploïdes après l’accouplement (Sc −U −Trp).
    1. Dissoudre le mélange de l’abandon, YNB, adénine hemisulfate et sulfate d’ammonium à 920 mL d’eau et le pH à 5,9 avec NaOH 5M (environ 1 mL par litre de médias) (voir le tableau 4 pour la composition). Verser dans un flacon de 2 L et ajouter un.
    2. Dans un deuxième flacon de 2 L, ajoutez l’agar à 950 mL d’eau (ne pas ajouter une barre de remuer ce qui provoquerait l’agar à ébullition à feu à l’autoclave).
    3. Stériliser pendant 40 minutes à 15 lb/po2 sur un cycle de liquid.
    4. Versez immédiatement le contenu du premier ballon, y compris la barre de l’émoi, dans la gélose contenant la fiole. Ajouter le glucose, mélanger bien sur une plaque de remuer et laisser refroidir à 55 ° C.
    5. Ajouter la leucine, histidine et uracile (omettre l’uracile pour les plaques de −Trp Sc −U).
    6. Mélanger bien sur une plaque de remuer et verser dans des plaques rectangulaires (~ 70 mL par plaque) à l’aide d’une pompe péristaltique (5 mL/s) et le tube de 6 mm. Sécher pendant 1 journée à température ambiante, envelopper les plaques dans des sacs en plastique et ranger dans la chambre froide jusqu'à 3 mois.
  4. SC −U −H −Trp + 3AT + plaques rectangulaires X-gal
    Remarque :     ces plaques serviront de plaques d’affichage pour des dosages eY1H.
    1. Dissoudre le mélange de l’abandon, YNB, adénine hemisulfate et sulfate d’ammonium dans 850 mL d’eau (voir tableau 5 pour la composition). Ne pas le pH. Verser dans un flacon de 2 L et ajouter un.
    2. Dans un deuxième flacon de 2 L, ajoutez l’agar à 850 mL d’eau (ne pas ajouter une barre de remuer ce qui provoquerait l’agar à ébullition à feu à l’autoclave).
    3. Stériliser pendant 40 minutes à 15 lb/po2 sur un cycle de liquid.
    4. Préparer 10 x BU sels (1L) en combinant 900 mL d’eau, 70 g de Na2HPO4∙7H2O et 34,5 g NaH2PO4∙H2Mix O. utilisation d’une barre de remuer pour dissoudre les poudres et ajuster le pH à 7.0 à l’aide de 5 M de NaOH. Ajouter l’eau pour porter à 1 L et autoclave.
    5. Préparer la solution de X-gal en ajoutant 3,5 g de poudre de X-gal à un tube en plastique de 50 mL contenant 42,5 mL de diméthylformamide. Ajouter la poudre de X-gal au diméthylformamide se dissoudre plus facilement (cela prend 30 min). Conserver la solution stock dans l’obscurité (utilisation opaque 50 ml tube ou couvercle en aluminium). Conserver à-20 ° C.
    6. Versez immédiatement le contenu du premier ballon, y compris la barre de l’émoi, dans la gélose contenant la fiole. Ajouter le glucose et le 10 x sels BU (voir tableau 5 pour la composition), mélanger bien sur une plaque de remuer et laisser refroidir à 55 ° C.
    7. Ajouter la leucine 3AT et X-gal (voir tableau 5 pour la composition).
    8. Mélanger bien sur une plaque de remuer et verser dans les plaques rectangulaires (~ 70 mL par plaque) à l’aide d’une pompe péristaltique (5 mL/s) et un tube de 6 mm. Sec 1 nuit à température ambiante, envelopper dans des sacs en plastique et stocker dans la chambre froide, couverte de papier d’aluminium (3AT et X-gal sont sensibles à la lumière) pendant environ 1 mois.

2. repérer un tableau TF

  1. Dégel du tableau TF-proie
    1. Décongeler les plaques stock de glycérol de levure avec le tableau de TF-proie sur la glace.
      Remarque : Tableaux de TF-proies peuvent être générées comme précédemment publié10,12,13,18.
    2. Remettre en suspension de la levure à l’aide d’une pipette de 12 canaux 1 – 3 min avant l’étape suivante.
  2. Repérer la levure en Sc −Trp plaques rectangulaires
    1. Dans le robot HDA (voir Table des matières), sélectionnez 96 plaques puits multiples comme source, 96 plaques d’agar comme cible et tapis de goujon long 96.
      Remarque : Pin pads ne sont pas réutilisables et doivent être jetés.
    2. Sélectionnez le programme Répliquer beaucoup pour faire deux copies par plaque à 96 puits. Ne pas utiliser la corbeille ou revoir les options pour éviter la contamination des stocks congelés de dos.
    3. Sélectionnez l’option pour l’agiter de haut en bas dans la source de mélanger la levure.
    4. Sac le tableau tacheté et incuber les agar-à 30 ° C pendant 2 à 3 jours.
  3. Génération de 384 tableaux de colonie en plaques rectangulaires de Sc −Trp
    1. Dans le robot, sélectionnez 96 plaques d’agar comme source, 384 gélose comme cible et 96 broches courtes plaquettes.
    2. Sélectionnez le programme tableau 1:4 . De cette façon, des plaques de quatre 96 colonie (contenant chacune un TF différente) seront regroupés en plaque une 384 colonie. Ne pas utiliser la corbeille ou revoir les options pour éviter toute contamination entre les différentes plaques.
    3. Sac les plaques et incuber le tacheté tableau 384-colonie agar-à 30 ° C pendant 2 jours.
  4. Générant des baies de la colonie 1 536 en plaques rectangulaires de Sc −Trp
    Remarque : Cela se traduira par des tableaux qui contiennent quatre colonies pour chaque TF-proies.
    1. Dans le robot, sélectionnez 384 boîtes de gélose comme source, les géloses 1 536 comme cible et 384 tampons pieu court.
    2. Sélectionnez le programme de source unique de dosage de 1:4. L’objectif consiste à copier chaque colonie dans quatre colonies pour obtenir quadruplicates. Utilisez la corbeille et revoir les options car il implique la copie des quatre fois chaque colonie.
    3. Sac les plaques et incuber le tacheté 1536-colonie tableau agar-à 30 ° C pendant 3 jours.
  5. Amplifier le tableau de la colonie 1 536 en plaques rectangulaires de Sc −Trp
    1. Dans le robot, sélectionnez 1 536 géloses comme source, 1 536 géloses comme cible et 1 536 tampons de pieu court.
    2. Sélectionnez le programme Répliquer beaucoup de reproduire des copies de 3 – 4. Utilisez la corbeille et revisiter l’option, mais jeter le patin lors du passage à une assiette différente du tableau pour éviter la contamination croisée.
    3. Sac les plaques et incuber le tacheté 1536-colonie tableau agar-à 30 ° C pendant 3 jours à utiliser pour l’accouplement des étapes (voir ci-dessous). Après cela, gardez les plaques à température ambiante et copie à nouveau après 7 jours pour un nouveau cycle de projection.

3. eY1H écran

  1. Préparation des pelouses de souche ADN-appât pour accouplement
    1. Repérer la levure souches ADN-appât sur une plaque −H −U Sc et pousse pendant 3 jours à 30 ° C.
    2. Ensemencer la levure dans un 15 cm plaque −H −U Sc à l’aide d’un cure-dent stérile, afin que chaque plaque s’adapte à différentes souches 12 – 16. Incuber un jour à 30 ° C.
    3. Ensemencer la levure dans un 15 cm plaque −H −U Sc à l’aide d’un cure-dent stérile, afin que chaque assiette correspond à 4 souches différentes. Incuber pendant une journée à 30 ° C.
    4. Grattez la levure à l’aide d’un cure-dent stérile, en veillant pas à gratter tout agar et ajouter dans un tube de 1,5 avec 500 µL d’eau stérile.
    5. Ajouter des perles de verre stérile de 10 – 15 sur une plaque rectangulaire de YAPD. Ajouter la suspension de levure sur la plaque et secouer énergiquement dans toutes les directions pendant 1 min pour s’assurer que la levure se propage à travers toute la plaque.
    6. Inverser la plaque immédiatement et tapoter afin que les perles aller au couvercle. Enlever et recycler les perles.
    7. Sac les plaques et incuber agar-côté vers le bas pendant 1 à 2 jours à 30 ° C. Puis passez à l’étape correspondante.
  2. Accouplement de levure ADN-appâts et TF tableau souches
    1. Transférer le tableau TF dans une plaque rectangulaire de YAPD avec le robot. Sélectionnez la gélose 1 536 comme source et cible et le tampon de 1 536 pieu court. Sélectionnez le programme Répliquer beaucoup . Chaque plaque de tableau TF peut être utilisé pour transférer aux plaques de YAPD de 3 – 4 (selon le nombre de plaques dans le tableau). Les plaques de tableau TF utilisés pour l’accouplement doivent être âgé de 2 à 3 jours mais pas plus que l’accouplement peuvent être inefficace.
    2. Transférer la pelouse d’une souche ADN-appât pour les plaques YAPD contenant déjà le tableau TF avec le robot. Sélectionnez la gélose 1 536 comme source et cible et le tampon de 1 536 pieu court. Sélectionnez le programme Répliquer beaucoup . Utilisent un décalage aléatoire dans la source d’un rayon de ~0.6 mm pour éviter de prendre la levure au même endroit et mélanger à la cible pour faciliter le contact entre les souches de levures. Utiliser la pelouse contenant les souches d’ADN-appâts (section 3.1) comme source, et les plaques YAPD contenant le tableau TF repéré à l’étape 3.2.1 comme cible.
    3. Sac les plaques et incuber les agar-à 30 ° C pendant 1 nuit.
  3. Sélection de levure diploïde
    1. Transférer la levure collée sur les plaques YAPD aux plaques de −Trp Sc −U avec le robot. Sélectionnez la gélose 1 536 comme source et cible et le tampon de 1 536 pieu court. Sélectionnez le programme à répliquer . Mélanger sur la source et cible.
    2. Sac les plaques et incuber les agar-à 30 ° C pendant 2 – 3 jours (plus longue incubation mène à activité de journaliste de fond élevé).
  4. Transfert aux plaques de lecture
    1. Transférer la levure diploïde des plaques −Trp Sc −U au lecture plaques rectangulaires Sc −U −H −Trp + 5mM 3AT + 0,4 mM X-gal à l’aide du robot. Sélectionnez les géloses 1 536 comme source et cible et le tampon de 1 536 pieu court. Sélectionnez le programme à répliquer .
    2. Sac les plaques et incuber les agar-à 30 ° C pendant 7 jours.
  5. Imagerie des plaques de lecture
    1. Pour les souches d’ADN-appât avec activité de journaliste de haut fond, prendre des photos 2, 3 et 4 jours. Sinon, prendre des photos 4 et 7 jours. Des interactions positives sont identifiées par la couleur bleu et la croissance des colonies levure et peuvent être vérifiées manuellement, ou il peut être déterminé à l’aide de logiciels d’analyse image.

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Representative Results

Trois facteurs principaux sont à considérer lorsque analyse résulte d’essais d’eY1H : l’activité de journaliste d’arrière-plan de la souche ADN-appât, la force de l’activité de journaliste, correspondant à des interactions ADN-TF et le nombre de colonies positives. L’activité de journaliste d’arrière-plan (p. ex., autoactivity) de la souche ADN-appât se réfère à la croissance globale et la couleur des colonies de levure la plaque de lecture, même en l’absence d’un TF-proie. Idéalement, non-autoactive souches présentent une fond blanc ou clair couleur brun, avec des colonies d’interactions positives étant plus grand et bleu. Autoactive ADN-appât souches montrent une croissance de levure dans des milieux dépourvus d’histidine et une couleur bleue en présence de le X-gal pour toutes les colonies dans la plaque, qui est probablement reliée à la liaison des activateurs transcriptional de levure pour l' ADN-appât8. L’intensité de l’activité de journaliste correspondant aux interactions ADN-TF détectées (par exemple, la taille de la colonie) et l’intensité de bleu dépend de nombreux paramètres tels que l’affinité, le niveau d’expression de TF dans la levure, le nombre de liaison de sites et la distance les promoteurs de levure minimes situés en amont des gènes journaliste et de l’activité de journaliste d’arrière-plan de la souche ADN-appât. Par exemple, une interaction faible peuvent être facilement détectée chez un appât à faible bruit de fond mais peuvent être difficile à détecter dans un autoactive ou l’appât du fond inégal. Il est également important de noter cette activité de journaliste niveaux chez les levures non nécessairement corrélés avec l’activité de régulation dans les cellules humaines, comme la structure de la chromatine, nucléosome, positionnement, et les effets de la distance sont différents entre la levure et humain. De plus, les interactions chez l’homme sont susceptibles d’être influencées par la liaison d’autres cofacteurs et TFs ou peuvent être masquées par redondants fonctionnellement TFs8. Enfin, les interactions sont considérées comme positives dans les essais eY1H quand au moins deux des quatre colonies montre l’expression du rapporteur au-dessus des niveaux de fond. Cependant, nous avons constaté qu’environ 90 % des interactions identifié résultent de toutes les quatre colonies correspondant à un TF étant positif10,12,19.

Pour illustrer le type de résultats qui peuvent être obtenus en utilisant l’eY1H nous avons criblé les régions promotrices (2 kb en amont les sites de début de transcription) des gènes CCL15 et IL17F, contre un tableau de 1 086 TFs humaines (Figure 2). Le promoteur de la CCL15 est un exemple d’un ADN non-autoactive-appât où les interactions, même les plus faibles, peuvent être facilement détectés (Figure 2 a). Le promoteur de la IL17F est un exemple d’un autoactive ADN-appât avec activité de fond inégal de journaliste, où certaines interactions peuvent être détectées tandis que pour plusieurs TFs, il est incertain si l’activité de journaliste est supérieure à fond (Figure 2 b).

Problèmes que l'on peut rencontrer lors de l’exécution des essais d’eY1H

Bien que la projection eY1H protocole est simple et robuste, plusieurs problèmes peuvent être rencontrés au cours de l’écran :

1) Colonies sont trop petits et ne parviennent pas à transfert (Figure 3 a) : bien qu’il est prévu que certaines levures exprimant TFs exogènes peut afficher une croissance lente étant donné que l’expression des gènes levure peut être dysrégulation, environ 95 % des colonies de TF-proie affichent habituellement normale croissance. Si plus de 10 % des colonies ne parviennent pas à se développer, les causes les plus fréquentes sont des problèmes avec les médias ou avec le transfert de la levure. Croissance sous-optimale est fréquemment liée à l’une des composantes médias perdre l’activité (p. ex., uracile, histidine ou leucine), qui peut être résolue par la préparation des supports neufs avec des solutions mères fraîches. Alternativement, cela peut aussi être lié à un décalage épinglage qui affecte le transfert de la colonie. Dans ce cas, vérifiez que les patins 1 536 épingler au centre des colonies de levures dans les plaques de la source.

2) aucune croissance de levure dans une partie de la plaque (Figure 3 b) : ce problème est généralement lié avec un échec lors de l’étape correspondante si le pad de la broche 1 536 omet de faire contact avec la levure dans la pelouse de souche ADN-appât, le tableau TF, ou dans la plaque d’accouplement. Dans presque tous les cas, c’est niveau média agar inégale au cours de la plaque coulée ou en raison de trop de séchage de la plaque.

3) aucune interaction ne détectée (Figure 3 et D) : cette question est souvent liée à deux mutations inactivant involontaires dans les gènes de journaliste, en particulier LacZ (Figure 3), ou à haute autoactivity qui masquent les interactions (Figure 3D). pour résoudre ce problème, il est recommandé d’écran correspondant à l’ADN-appât même d’une autre souche obtenue indépendamment.

4) la plaque présente des taches bleues au hasard (Figure 3E) : cette question est souvent liée à une contamination bactérienne. Pour résoudre ce problème, faire des rayures dans la levure pour obtenir des colonies individuelles et répétez l’écran.

Ce qui précède est les problèmes les plus fréquents rencontrés lors de l’exécution des essais d’eY1H. Si autres problèmes surgissent, préparation des nouveaux médias, confirmant que les paramètres appropriés pour le robot HDA servaient, et tester de multiples souches par ADN-appât résoudrait probablement la plupart des problèmes.

Figure 1
Figure 1 : Aperçu des écrans de test eY1H. (A) comparaison entre les méthodes TF-centrée et axée sur l’ADN pour identifier les interactions protéine-ADN. Schematics (B) des essais d’eY1H. Une séquence d’ADN d’intérêt (promoteur, enhancer, silencieux, etc.) cloné en amont du reporter HIS3 et LacZ gènes est intégré dans le génome de la levure. La souche ADN-appât qui en résulte est accouplée à une collection de souches de levures nourrissait TFs fusionnés au domaine d’activation Gal4 (AD). Des interactions positives sont déterminées par la capacité de la levure de se développer sans histidine et surmonter l’inhibiteur compétitif de la 3-AT et vire au bleues en présence de le X-gal. Pipeline (C) pour les écrans eY1H. Une pelouse d’une levure ADN-appât souche cultivée dans une plaque YAPD est accouplée à une plaque YAPD dans un tableau de la colonie 1 536 exprimant TFs fusionnées à AD cultivé sur une plaque de −Trp Sc. Après un jour, la levure est transférée à un Sc −U −Trp pour sélectionner des levures diploïdes. Après une incubation de 2 à 3 jours, la levure est transférée à un Sc −U −H −Trp + 3 X-gal (plaque d’affichage) pour identifier les interactions protéine-ADN. Chaque interaction est testée en quatre exemplaires.  S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Exemples de plaques de lecture d’eY1H. (A) les Interactions impliquant le promoteur de la CCL15, un appât non-autoactive. Activité de journaliste de fond pour cet appât est faible (réduction de la croissance en l’absence de l’histidine et l’absence de couleur bleue pour TFs sans interaction). (B) les Interactions impliquant le promoteur de la IL17F, un appât autoactive. Activité de journaliste de fond pour cet appât est élevée (croissance en l’absence d’histidine et fond bleu couleur tout au long de la plaque) et inégale, rendant difficile d’identifier les interactions protéine-ADN. Forte, moyenne et les interactions faibles sont carrés en rouge, orange et jaune, respectivement. Les noms HGNC le TFS interaction apparaissent. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Des problèmes dans les écrans eY1H. (A) TF-proie array où plusieurs colonies n’ont pas poussé. (B) lecture plaque où colonies dans le coin inférieur gauche n’ont pas réussi à transférer. (C) souche Non-autoactive ADN-appât qui n’affiche pas les interactions positives. (D) hautement autoactive ADN-appât souche qui n’affiche pas les interactions positives. (E) plaque de lecture affichant plusieurs colonies bleues dues à la contamination. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Repérer un tableau TF
Jour 1 Repérer les levures dans Sc – Trp plaque au format 96 colonie (2.1 et 2.2)
Jour 4 Générer 384 colonie TF tableau (2.3)
Jour 6 Générer le tableau TF 1 536 colonie (2.4)
Jour 9 Amplifier les tableau TF 1 536 colonie (2.5)
Préparation des pelouses de souche ADN-appât pour accouplement
Jour 6 Repérer la levure souches ADN-appâts (3.1.1)
Jour 9 Levure de strie, 12-16 souches par plaque (3.1.2)
Jour 10 Levure de strie, 4 souches par plaque (3.1.3)
Jour 11 Préparer les pelouses de l’ADN-appâts (3.1.4 et 3.1.5)
Accouplement de levure ADN-appâts et TF tableau souches
Jour 12 Accouplement en plaques YAPD (3.2)
Sélection de levure diploïde
Jour 13 Sélection de levure diploïde en plaques – U – Trp de Sc (3.3)
Transfert aux plaques de lecture
Jour 15 Transfert de levure diploïde aux plaques de lecture (3.4)
Imagerie des plaques de lecture
Jours 17-22 Acquisition d’images de plaques de lecture selon le contexte (3.5)

Tableau 1 : Tableau de FFT.

RÉACTIF QUANTITÉ (pour 2 L)
Abandon mélange synthétique moins riche adénine, tryptophane, histidine et uracile, leucine (2 g) w/o d’azote de levure base 2,6 g
Azote de levure base sans acides aminés et sans sulfate d’ammonium (YNB) 3,4 g
Adénine hemisulfate dihydrate 160 mg
Sulfate d’ammonium 10 g
Agar 35 g
Glucose (40 %, p/v) dans l’eau, stérile 100 mL
Leucine (100 mM), stérile filtré 16 mL
Tryptophane (40 mM), stérile filtré 16 mL

Tableau 2 : Réactif de la liste I.

RÉACTIF QUANTITÉ (pour 2 L)
Peptone 40 g
Extrait de levure 20 g
Adénine hemisulfate dihydrate 0,32 g
Glucose (40 %, p/v) dans l’eau, stérile 100 mL
Agar 35 g

Tableau 3 : Liste de réactifs II.

RÉACTIF QUANTITÉ (pour 2 L)
Abandon de mélange synthétique moins histidine, leucine, tryptophane et uracile, riches adénine (2 g) w/o d’azote de levure base 2,6 g
Azote de levure base sans acides aminés et sans sulfate d’ammonium (YNB) 3,4 g
Adénine hemisulfate dihydrate 160 mg
Sulfate d’ammonium 10 g
Agar 35 g
Glucose (40 %, p/v) dans l’eau, stérile 100 mL
Leucine (100 mM), stérile filtré 16 mL
Histidine (100 mM), stérile filtré 16 mL
Uracile (20 mM), stérile filtrée (omettre pour plaques de Trp – – U Sc) 16 mL

Tableau 4 : Liste de réactifs III.

RÉACTIF QUANTITÉ (pour 2 L)
Abandon de mélange synthétique moins histidine, leucine, tryptophane et uracile, riches adénine (2 g) w/o d’azote de levure base 2,6 g
Azote de levure base sans acides aminés et sans sulfate d’ammonium (YNB) 3,4 g
Adénine hemisulfate dihydrate 160 mg
Sulfate d’ammonium 10 g
Agar 35 g
Glucose (40 %, p/v) dans l’eau, stérile 100 mL
10 x BU sels 200 mL
Leucine (100 mM), stérile filtré 16 mL
3at (2 M), filtré stérile 5 mL
X-gal (80 mg/mL) dans le DMF 4 mL

Tableau 5 : Liste de réactifs IV.

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Discussion

L’approche de dépistage accouplement eY1H robotique décrit ici grandement augmente le débit afin d’identifier l’ensemble des TFs qui se lient à une région d’intérêt, par rapport à la précédente projection de bibliothèque ou approches de dépistage déployèrent basées sur la transformation de l’ADN. En outre, les interactions ADN-TF détectées par eY1H les dosages sont hautement reproductibles comme 90 % des interactions détectées sont positifs pour tous les quatre colonies testées par TF, et 90 % des interactions retester dans un écran indépendant du même souche levure ADN-appât10 , 12 , 19. plus important encore, les interactions ADN-TF détectées par eY1H valider à un taux de 40 % à 70 % lors d’un essai chez journaliste humain essais12,20, dans les cellules humaines primaires (résultats non publiés) et chez c. elegans knockout animaux 11. il s’agit d’un taux de validation similaire à celle observée pour les ChIP-seq données21.

Bien que les interactions identifiées par eY1H sont hautement reproductibles lorsqu’un nouvel essai de la levure de même souche ADN-appât, essais de souches de levures différentes pour le même ADN-appât donne parfois différentes, mais qui se chevauchent, ensembles des interactions ADN-TF. C’est généralement due aux différences dans l’activité de journaliste de fond entre les souches. En outre, tests des fragments d’une séquence d’ADN entraîne la détection de plus d’interactions ADN-TF que les essais de la séquence complète, en particulier lorsque des fragments qui se chevauchent sont testés. Cela peut être lié avec le test étant plus performant dans l’identification des interactions qui sont proches les promoteurs minime de journaliste, et parce que les tests qui se chevauchent des fragments réduit les chances qu’un site de liaison peut-être être obstrués par des nucléosomes de la levure. Ainsi, pour les projets à petite échelle, il est recommandé que 0,5 – 1 qui se chevauchent Ko fragments d’une région régulatrice sont testés et que deux souches indépendants sont testées pour chaque séquence de l’ADN-appât8.

Il y a plusieurs étapes cruciales dans l’eY1H filtrage de protocole afin d’éviter certains des problèmes présentés à la Figure 3. Tout d’abord, bien que la plupart des ingrédients de médias sont stables pendant plusieurs mois (à l’exception des 3AT et X-gal), un manque de bonne colonie croissance probable indique qu’au moins un des ingrédients peut-être avoir perdu activité et devrait être remplacé. Deuxièmement, il est important de préparer les plaques rectangulaires afin que l’agar est nivelé et afin qu’ils ne pas faire sécher pendant plus d’une journée éviter les pannes en épinglant lors de l’utilisation de la plateforme robotique. Enfin, il est essentiel d’utiliser les programmes de la plateforme robotique comme il est indiqué dans le protocole (revoir, recycler, mélange, etc.) pour la levure à transférer efficacement, pour s’accoupler pour être efficace et à éviter toute contamination croisée entre les clones de levure.

Les exemples que nous avons choisi pour illustrer l’utilisation d’écrans d’eY1H correspondent aux promoteurs de gènes humains. Cependant, des autres régions régulatrices peuvent être testées comme exhausteurs et silencieux. Par exemple, nous avons utilisé eY1H tests pour évaluer la liaison TF exhausteurs de développement humains et c. elegans premier introns12,22. En outre, étant donné que les interactions sont analysées d’une manière par paires, des essais d’eY1H peuvent servir à comparer les interactions entre les variantes non codante et entre les variantes de séquence codantes TF. Par exemple, utilisant l’eY1H que nous avons identifié altéré la liaison TF à 109 variantes non codantes associée à différentes maladies génétiques, ainsi que des profils d’interaction différentielle pour 58 TF mutations faux-sens12,14. Bien que ce protocole met l’accent sur l’évaluation de liaison TF pour les régions régulatrices humaines, régions de l’ADN des autres espèces peuvent être testées aussi autant qu’un TF-proies est disponible ou peut être généré. En effet, baies de TF-proies ont été générés pour c. elegans10, Drosophila melanogaster,23, Mus musculus24, Arabidopsis thaliana25,26, et Zea mays 27. ainsi, avec les ressources de plus en plus disponibles, eY1H essais peuvent être appliquées à des systèmes additionnels.

Bien que les essais eY1H ont contribué à identifier le répertoire des TFs qui se lient aux différentes régions régulatrices chez les espèces humaines et autres, ils ne sont pas libres de mises en garde8,11,12,19 ,20,25. Une des limites est que les interactions sont testées dans le milieu du noyau levure et, bien que l’ADN-appâts sont chromatinized, la structure de la chromatine dans la levure peut-être ne pas refléter la structure de la chromatine en l’espèce d’origine de l’ADN-appât et ne reflète pas les différences de type cellulaire observées in vivo. Ainsi, identifiées par des analyses eY1H des interactions doivent être validées à reporter ou autres tests fonctionnels. De note, nous et d’autres ont trouvé des interactions ADN-TF détectées par eY1H valider à un taux de 40 % à 70 % dans les essais fonctionnels11,12,20,23. Une autre limitation d’eY1H essais, c’est qu’il ne peut pas détecter des interactions impliquant des TFs qui nécessitent des modifications post-traductionnelles absent chez la levure pour lier à l’ADN, TFs qui ne sont pas correctement pliés dans la levure lorsque fusionnés à l’AD et TFs qui ne figurent pas dans le tableau 8. en outre, dans le format actuel, eY1H essais ne détectent pas interactions impliquant des hétérodimères TFs, que chaque colonie de levures dans le tableau TF exprime une seule proie-TF. Ainsi, outre des améliorations dans le dosage augmentera l’étendue des TFs qui peuvent être testés et d’étendre les fonctionnalités d’eY1H tests pour identifier les nouvelles interactions ADN-TF

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health [R35-GM128625 à J.I.F.B.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

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References

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Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C.… More

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

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