Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/59192
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University
* These authors contributed equally

Summary

כאן, נציג של שמרים משופר אחד-היברידית הקרנת פרוטוקול כדי לזהות את גורמי שעתוק (TFs) ניתן לאגד לאזור ה-DNA האנושי של עניין. שיטה זו משתמשת צינור ההקרנה תפוקה גבוהה אשר ניתן לחקור את הכריכה של > 1,000 TFs בניסוי יחיד.

Abstract

זיהוי קבוצות גורמי שעתוק (TFs) המסדירים כל הגן האנושי היא משימה מרתיעה הדורש שילוב של גישות ניסוייות וחישוביות רבים. שיטה אחת כזו היא וזמינותו (Y1H) אחד-היברידית שמרים, באיזו מתגובות. הגומלין בין שר ה-DNA אזורים נבדקים את חצרו של גרעין שמרים באמצעות כתב גנים. מבחני Y1H כולל שני רכיבים: על "ה-DNA-פיתיון' (למשל., היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים, משתיקי קול, וכו '), 'TF-טרף,' אשר יכולים להיות מוקרן על הפעלת גנים כתב. ביותר שפורסמה בפרוטוקולים לביצוע מסכי Y1H מבוססים על להפוך ספריות TF-טרף או מערכים זני שמרים DNA-פיתיון. כאן, אנו מתארים צינור, שנקרא Y1H משופרת (eY1H) מבחני, איפה TF-DNA אינטראקציות הם שנחקרו על-ידי הזדווגות זנים DNA-הפיתיון עם אוסף ערוכים של זנים TF-טרף באמצעות מערך צפיפות גבוהה פלטפורמה רובוטית (HDA) המאפשר הקרנה ב- 1536 תבנית של המושבה. דבר זה מאפשר עלייה דרמטית בערך תפוקה (רצפי DNA-פיתיון 60 נגד > 1,000 TFs לוקח שבועיים לכל חוקר) ו הפארמצבטית. אנו מדגימים סוגים שונים של התוצאות הצפויות על-ידי בדיקת יזם האנושי רצפים נגד מערך של 1,086 TFs האנושית, כמו גם דוגמאות של בעיות שעשויות להתרחש במהלך מסכי וכיצד לפתור אותם.

Introduction

בעיה מרכזית בתחום הביו-רפואי הוא בקביעת המנגנון שבאמצעותו מוסדר כל הגן האנושי. תמלול היא הצעד הראשון בשליטה על רמות ביטוי גנים, זה מוסדר על ידי קבוצות של גורמי שעתוק (TFs) ייחודיים לכל הגנים. נתון כי בני אדם קידוד עבור > 1,500 TFs1,2, המזהה את הערכה המלאה של TFs השולטים הביטוי של כל הגן נותר אתגר פתוח.

שני סוגים של שיטות יכול לשמש כדי למפות TF-DNA אינטראקציות: שיטות ממורכז TF וממורכז הדנ א3 (איור 1 א'). בשיטות TF ממורכז, TF עניין הוא נחקר עבור איגוד לאזורים דנ א גנומי או כדי לקבוע שלה ירידה לפרטים איגוד ה-DNA. שיטות אלה כוללות immunoprecipitation כרומטין (ChIP) ואחריו רצף תפוקה גבוהה, מיקרו-מערכים מחייב חלבון ו- SELEX4,5,6. בשיטות ממורכז דנ א, רצף ה-DNA של עניין הוא נחקר כדי לקבוע את קבוצת שר זה לאגד רצף ה-DNA. אפלייד נרחב ביותר של שיטות כאלה היא מבחני שמרים אחד-היברידית (Y1H), באיזו מתגובות. הגומלין בין שר ה-DNA אזורים נבדקים את חצרו של גרעין שמרים באמצעות כתב הגנים7,8,9.

מבחני Y1H כולל שני רכיבים: על "ה-DNA-פיתיון' (למשל, היזמים, מוצרי טיפוח טבעיים, משתיקי קול, וכו '), 'TF-טרף,' אשר יכולים להיות מוקרן כתב ג'ין הפעלה9,10 (איור 1B). דנ א-הפיתיון שוכפל במעלה הזרם של כתב שני גנים (LacZ ו HIS3) וקבועים DNA-bait::reporter שני משולבים לתוך הגנום שמרים ליצירת chromatinized 'DNA-פיתיון זנים.' TF-הטרף, המקודדת על פלסמיד המבטאת של TF התמזגו לתחום הפעלה (AD) של השמרים Gal4 TF, מוחדרים המתח DNA-פיתיון לדוג עבור אינטראקציות TF-DNA. אם TF-הטרף נקשר רצף ה-DNA-פיתיון, ואז המודעה נוכח TF-הטרף יוביל להפעלת שתי גנים כתב. כתוצאה מכך, תאים עם השפעה חיובית הדדית יכול להיות שנבחר עבור הצמיחה על צלחות חסר היסטידין, כמו גם התגברות על מעכב תחרותי, 3-אמינו-1,2,4-triazole (3-AT), דמיינו כמו מושבות כחול בנוכחות X-גל. כי חזק שמרים Gal4 לספירה משמש, מבחני Y1H יכול לזהות אינטראקציות מעורבים activators תעתיק וכן repressors. בנוסף, לאור העובדה TF-הטרף באים לידי ביטוי של מקדם חזק שמרים (ADH1), ניתן להבחין אינטראקציות אפילו בשביל TFs בעלי רמות ביטוי אנדוגני נמוכה, אשר הם מאתגרים לזהות על-ידי שבב11,12.

ביותר שפורסמה בפרוטוקולים לביצוע מבחני Y1H מבוססים על ידביקו TF-הטרף זנים DNA-פיתיון שמרים בהפיכת ספריות TF-טרף במאגר עקב בחירה, המושבה איסוף, ורצף כדי לזהות את TF אינטראקציה, או על ידי שינוי צורה של הפרט שיבוטים8,9. אלה הם פרוטוקולי גוזלת זמן, הגבלת מספר רצפי דנ א יכול להיבדק לכל חוקר. שיפור האחרונות של מבחני Y1H, שנקרא משופרת Y1H (eY1H), גדל באופן דרמטי את התפוקה הקרנה באמצעות פלטפורמה רובוטית של המערך (HDA) צפיפות גבוהה להזדווג זני שמרים DNA-הפיתיון עם אוסף של זני שמרים כל ביטוי שונה TF-טרף10,13 (איור 1C). המסכים הבאים מעסיקים של המושבה 1,536 פורמט המאפשר מבחן TFs האנושי ביותר באמצעות לוחות רק שלוש ארבע פעמים. עוד יותר, בהתחשב בעובדה TF-DNA אינטראקציות נבדקים באופן pairwise, גישה זו מאפשרת להשוואת אינטראקציות בין DNA-פיתיונות (כגון שתי גרסאות noncoding נוקלאוטיד יחיד) ובין שר אחר או TF גרסאות11,12 ,14.

באמצעות מבחני eY1H, לנו יש מאפשרת את האדם הגדול ואת Caenorhabditis elegans ממורכז DNA TF-DNA אינטראקציות רשתות עד היום. בפרט, זיהינו 2,230 אינטראקציות בין 246 משפרי התפתחותית האנושי 283 TFs12. יתר על כן, יש לנו עובדים eY1H מבחני לחשוף מחייב TF שינו 109 נוקלאוטיד יחיד noncoding משתנים הקשורים עם מחלות גנטיות כגון מום התפתחותית, סרטן, הפרעות נוירולוגיות. לאחרונה, השתמשנו eY1H על רשת הכוללת 21,714 אינטראקציות בין היזמים ג'ין C. elegans 2,576 366 TFs11. רשת זו הייתה לחשוף את תפקיד פונקציונלי של עשרות TFs C. elegans .

הפרוטוקולים להפיק DNA-פיתיון כתמי ולהעריך את הרמות של פעילות עיתונאית הרקע היה דיווח במקום אחר15,16,17. כאן, אנו מתארים של צינור eY1H יכול לשמש למסך בכל אזור דנ א גנומי האנושי נגד מערך של 1,086 TFs אנושי. ברגע שמרים DNA-פיתיון המתח נוצר מערך TF-טרף ניצפית על גבי הלוחות המתאימים, ניתן לבצע פרוטוקול כולו בעוד שבועיים (טבלה 1). וחשוב מכך, יכול להיות parallelized הפרוטוקול כך חוקר יחיד. באפשרותך לסנן רצפי DNA-פיתיון 60 בו זמנית. כדי להדגים את הפרוטוקול, הוקרנו היזמים של שני גנים ציטוקינים CCL15 ו- IL17F. בנוסף, אנו מראים תוצאות המסכים שנכשלו להמחשת סוגי הבעיות שעלולות להתעורר בעת ביצוע מבחני eY1H וכיצד לפתור אותם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תכשירים

  1. Sc-−U-−H-צלחות (צלחות פטרי 150 מ מ)
    הערה: הצלחות האלה ישמש לגידול זני שמרים את הדנ א-פיתיון.
    1. להמיס את הנשירה תערובת בסיס חנקן שמרים (YNB), hemisulfate אדנין, אמוניום סולפט בשנת 920 מ של מים, ו pH אל 5.9 עם NaOH M 5 (כ 1 מ"ל לליטר של מדיה; ראה בטבלה 2 עבור הרכב). שופכים לתוך בקבוקון 2 ל' והוסף בר מערבבים.
    2. בקבוקון 2 ל' השני, הוסף את אגר עד 950 מ"ל של מים (אין להוסיף בר מערבבים כמו זה יגרום את אגר לרתיחה ב החיטוי).
    3. אוטוקלב למשך 40 דקות-15 psi על מחזור נוזלי.
    4. ומיד שופכים את תכולת הבקבוק הראשון, כולל שורת stir, לתוך אגר המכיל את הבקבוק. להוסיף את הסוכר, מערבבים היטב על צלחת stir, מגניב עד 55 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
    5. להוסיף את לאוצין, טריפטופן את התקשורת. לערבב היטב על צלחת מערבבים ויוצקים לתוך צלחות פטרי סטריליות 150 מ מ (~ 80 מ לכל מנה). יבש 3-5 ימים בטמפרטורת החדר, לעטוף בשקיות פלסטיק, וכדי לאחסן בטמפרטורת החדר עד 6 חודשים.
  2. צלחות מלבניות YAPD
    הערה: הצלחות האלה ישמש לגידול הדשא לזן של ה-DNA-פיתיון ועבור הזדווגות עם אוסף מערך TF.
    1. להמיס אבקות (ראו טבלה 3 עבור הרכב), למעט אגר, ב- 950 מ"ל בקבוקון 2 ל' מים ולהוסיף בר מערבבים.
    2. בקבוקון 2 ל' השני, הוסף את אגר עד 950 מ"ל של מים (אין להוסיף בר מערבבים כמו זה יגרום את אגר לרתיחה ב החיטוי).
    3. אוטוקלב למשך 40 דקות-15 psi על מחזור נוזלי.
    4. ומיד שופכים את תכולת הבקבוק הראשון, כולל שורת stir, לתוך אגר המכיל את הבקבוק.
    5. להוסיף את הסוכר, מערבבים טוב על מערבבים בצלחת של מגניב עד 55 מעלות צלזיוס. שופכים את המדיה לתוך הצלחות מלבני (ראה טבלה של חומרים; ~ 70 מ לכל צלחת) באמצעות משאבה סחרור (5 מ ל/שניה) אבובים 6 מ מ. יבש ליום 1 בטמפרטורת החדר, לעטוף בשקיות פלסטיק, ולאחסן את החדר הקרה עד 6 חודשים.
      הערה: למרות שעוצמת media המוצע הוא 70 מ לכל צלחת, 50-80 מ לכל צלחת יכול לשמש. בעיות קריטיות שלושה לשקול מתי שוטף צלחות 1) כי החלקתן כך התקשורת אגר יש עובי אותה ברחבי הבסיס (השתמש בטבלה מפולס או משטח למזיגה צלחת ויוצקים לא בערימות של יותר משבע צלחות) 2) כדי לוודא העדר של בועות אגר המדיה (בועות צריך להיות popped באמצעות מחט סטרילית) ו- 3) ייבוש הלוחות ליום אחד בלבד והגלישה הלוחות בשקיות פלסטיק כדי למנוע כשלים להצמדת שמרים.
  3. Sc −Trp ו- Sc −U −Trp צלחות מלבניות
    הערה: הצלחות האלה ישמש לגידול האוסף מערך TF (Sc −Trp) וכדי לבחור שמרים דיפלואידי לאחר ההזדווגות (Sc −U −Trp).
    1. להמיס את הנשירה לערבב YNB, hemisulfate אדנין, אמוניום סולפט בשנת 920 מ של מים, ו pH אל 5.9 עם NaOH 5 מ' (כ 1 מ"ל לליטר של מדיה) (ראה טבלה 4 עבור הרכב). שופכים לתוך בקבוקון 2 ל' והוסף בר מערבבים.
    2. בקבוקון 2 ל' השני, הוסף את אגר עד 950 מ"ל של מים (אין להוסיף בר מערבבים כמו זה יגרום את אגר לרתיחה ב החיטוי).
    3. אוטוקלב למשך 40 דקות-15 psi על מחזור נוזלי.
    4. ומיד שופכים את תכולת הבקבוק הראשון, כולל שורת stir, לתוך אגר המכיל את הבקבוק. להוסיף את הסוכר, מערבבים היטב על צלחת stir, להצטנן עד 55 מעלות צלזיוס.
    5. הוסף את לאוצין, היסטידין אורציל (להשמיט את אורציל עבור לוחות −Trp −U Sc).
    6. לערבב היטב על צלחת מערבבים ויוצקים לתוך צלחות מלבניות (~ 70 מ לכל צלחת) באמצעות משאבת סחרור (5 מ ל/שניה) אבובים 6 מ מ. מתייבשים ליום 1 בטמפרטורת החדר, לעטוף את הצלחות בשקיות פלסטיק, לאחסן בחדר קר עד 3 חודשים.
  4. Sc −U −H −Trp + 3AT + צלחות מלבניות X-גל
    הערה:     הצלחות האלה ישמש בתור readout לוחות עבור מבחני eY1H.
    1. להמיס את הנשירה לערבב YNB, hemisulfate אדנין, אמוניום סולפט ב- 850 מ ל מים (ראה טבלה 5 עבור הרכב). לא pH. שופכים לתוך בקבוקון 2 ל' והוסף בר מערבבים.
    2. בבקבוקון 2 ל' השני, להוסיף את אגר 850 מ ל מים (אין להוסיף בר מערבבים כמו זה יגרום את אגר לרתיחה ב החיטוי).
    3. אוטוקלב למשך 40 דקות-15 psi על מחזור נוזלי.
    4. הכינו 10 x BU מלחי (1 ליטר) על ידי שילוב של 900 מ ל מים, 70 גרם של נה2HPO4∙7H2O ו- g 34.5 NaH2PO4∙H2O. לערבב באמצעות בר מערבבים כדי להמיס אבקות ולהתאים את רמת החומציות אל 7.0 באמצעות 5 M NaOH. מוסיפים מים כדי להביא 1 ליטר, תא לחץ.
    5. הכינו את הפתרון X-גל על-ידי הוספת 3.5 גר' אבקה X-גל צינור פלסטיק 50 מל המכיל 42.5 מ של דימתיל formamide. להוסיף אבקת X-גל דימתיל formamide כדי להמיס בקלות רבה יותר (זה לוקח 30 דקות). שמור פתרון מניות בחושך (שימוש אטום 50 מ ל צינור או לכסות בנייר). חנות ב-20 ° C.
    6. ומיד שופכים את תכולת הבקבוק הראשון, כולל שורת stir, לתוך אגר המכיל את הבקבוק. הוסף את הגלוקוז 10 x BU מלחי (ראה טבלה 5 עבור הרכב), לערבב היטב על צלחת stir, להצטנן עד 55 מעלות צלזיוס.
    7. הוסף את לאוצין, 3AT X-גל (לקבלת הרכב, ראה טבלה 5 ).
    8. לערבב היטב על צלחת מערבבים ויוצקים לתוך הצלחות מלבני (~ 70 מ לכל צלחת) באמצעות משאבה סחרור (5 מ ל/שניה) אבובים 6 מ מ. יבש ליום 1 בטמפרטורת החדר, לעטוף בשקיות פלסטיק, ולאחסן את החדר הקרה מכוסה בנייר אלומיניום (3AT ו- X-גל הם רגיש אור) עד כחודש.

2. איתור מערך TF

  1. מפשיר את המערך TF-טרף
    1. הפשרת שמרים גליצרול צלחות מניות עם המערך TF-טרף על קרח.
      הערה: ניתן להפיק TF-טרף מערכים כמו שפורסמו בעבר10,12,13,18.
    2. Resuspend שמרים באמצעות פיפטה של 12 ערוצים בתוך 1-3 דקות לפני השלב הבא.
  2. הבחינה השמרים לתוך Sc −Trp צלחות מלבניות
    1. ב HDA הרובוט (ראה טבלה של חומרים), בחר 96 צלחות רב טוב כמו המקור, פלטות אגר 96 היעד, וכן סיכת ארוך 96 רפידות.
      הערה: רפידות pin אינם לשימוש חוזר, צריכים להיות מושלך.
    2. בחר את התוכנית לשכפל רבים לעשות שני עותקים לכל צלחת 96-ובכן. אין להשתמש המיחזור או ולבקר אפשרויות כדי למנוע זיהום האחורי של המניות קפוא.
    3. בחר באפשרות הכוריאוגרף למעלה ולמטה במקור כדי לערבב את השמרים.
    4. תיק המערך מנומר, דגירה אגר בצד למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים.
  3. יצירת מערכים המושבה 384 ב- Sc −Trp צלחות מלבניות
    1. הרובוט, בחר פלטות אגר 96 כמו המקור, צלחת אגר 384 כמטרה 96 רפידות פין קצר.
    2. בחר את התוכנית מערך 1:4 . בדרך זו, מאוחדים המושבה 96 ארבע צלחות (המכילים כל אחד של TF שונים) לתוך צלחת אחת 384 המושבה. אין להשתמש המיחזור או ולבקר אפשרויות כדי למנוע תקשורת בין לוחות שונים.
    3. תיק הלוחות, דגירה אגר-לצד מערך 384-המושבה הבחין למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
  4. יצירת מערכים המושבה 1,536 ב- Sc −Trp צלחות מלבניות
    הערה: זה יגרום מערכים המכילים ארבע המושבות TF-םימעפ.
    1. הרובוט, בחר פלטות אגר 384 בתור מקור הלוחות אגר 1,536 כמטרה, רפידות פין קצר 384.
    2. בחר את התוכנית מקור יחיד וזמינותו של 1:4. המטרה היא להעתיק את כל המושבה אל ארבע המושבות כדי להשיג quadruplicates. השתמש המיחזור ואת revisit אפשרויות כפי שהוא כרוך בהעתקת ארבע פעמים כל המושבה.
    3. תיק הלוחות, דגירה אגר-לצד מערך 1536-המושבה הבחין למעלה ב 30 מעלות צלזיוס למשך 3 ימים.
  5. הגברה המערך המושבה 1,536 ב- Sc −Trp צלחות מלבניות
    1. הרובוט, בחר פלטות אגר 1,536 כמו המקור, פלטות אגר 1,536 כמטרה 1,536 רפידות פין קצר.
    2. בחר את התוכנית רבים לשכפל לשכפל עותקים 3-4. השתמש המיחזור, ולבקר את האפשרות, אבל לזרוק את משטח כאשר מחליפים צלחת שונה של המערך כדי למנוע זיהום לחצות.
    3. תיק הלוחות, דגירה אגר-לצד מערך 1536-המושבה הבחין למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים להשתמש להזדווגות שלבים (ראו להלן). לאחר מכן, שמור את הצלחות בטמפרטורת החדר, העתק שוב לאחר 7 ימים לסיבוב חדש של ההקרנה.

3. eY1H מסך

  1. הכנת ה-DNA-פיתיון זן דשא להזדווגות
    1. במקום השמרים DNA-פיתיון זנים על צלחת −H −U Sc ולגדול במשך 3 ימים ב- 30 ° C.
    2. צובעות את השמרים לתוך 15 ס מ Sc-−U-−H-צלחת בעזרת קיסם סטרילי, כך שהלוח יתאים זנים שונים של 12-16. דגירה אחת ביום 30 ° C.
    3. צובעות את השמרים לתוך 15 ס מ Sc-−U-−H-צלחת בעזרת קיסם סטרילי, כך שהלוח יתאים 4 זנים שונים. תקופת דגירה של יום אחד ב- 30 ° C.
    4. לגרד את השמרים באמצעות קיסם סטרילי, מקפיד לא לגרד כל אגר ולהוסיף לתוך צינור 1.5 עם 500 µL של מים סטריליים.
    5. להוסיף 10 – 15 חרוזי זכוכית סטריליים על צלחת מלבנית YAPD. הוסף את המתלים שמרים לצלחת ומנערים ביסודיות בכל הכיוונים עבור 1 דקות להבטיח שהשמרים היא התפשטה דרך כל הלוח.
    6. הפוך את הצלחת מיד והקש על כך החרוזים לעבור המכסה. הסר ולאחר למחזר את החרוזים.
    7. לוחיות הרישוי ועם תקופת דגירה אגר בצד למטה של 1 – 2 ימים ב- 30 ° C. לאחר מכן המשך לשלב ההזדווגות.
  2. ההזדווגות של שמרים DNA-פיתיון וללחצים מערך TF
    1. להעביר את המערך TF צלחת מלבנית YAPD עם הרובוט. בחר את הצלחת אגר 1,536 מקור היעד, ואת משטח 1,536 פין קצר. בחר את התוכנית לשכפל רבים . כל צלחת מערך TF ניתן להעביר ל 3-4 צלחות YAPD (בהתאם למספר הצלחות במערך). מערך TF הגלופות המשמשות להזדווגות חייב להיות בן 2-3 ימים אבל לא יותר כמו ההזדווגות עשוי להיות לא יעיל.
    2. להעביר את הדשא של זן ה-DNA-פיתיון הלוחות YAPD כבר המכיל את המערך TF עם הרובוט. בחר את הצלחת אגר 1,536 מקור היעד, ואת משטח 1,536 פין קצר. בחר את התוכנית לשכפל רבים . השימוש של ההיסט המקרי במקור עם רדיוס של ~0.6 מ מ כדי למנוע לוקח שמרים מאותה נקודה ומערבבים על המטרה כדי להקל על הקשר בין זני שמרים. השתמש את הדשא שמכילות את הדנ א-פיתיון (סעיף 3.1) כמקור ולאחר הלוחות YAPD המכיל את המערך TF הבחין בשלב 3.2.1 כמטרה.
    3. תיק הלוחות, דגירה אגר בצד למעלה ב 30 ° C עבור יום אחד.
  3. הבחירה של שמרים דיפלואידי
    1. העבר את השמרים ובסיומה מן הלוחות YAPD Sc −U −Trp צלחות עם הרובוט. בחר את הצלחת אגר 1,536 מקור היעד, ואת משטח 1,536 פין קצר. בחר את התוכנית לשכפל . מערבבים על מקור ועל המטרה.
    2. תיק הלוחות, דגירה אגר בצד למעלה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2 – 3 ימים (זמן דגירה מוביל לפעילות כתב רקע).
  4. להעביר readout צלחות
    1. העבר את השמרים דיפלואידי מן הלוחות −Trp −U Sc readout צלחות מלבניות Sc −U −H −Trp + 3AT 5 מ מ + 0.4 מ מ X-גל השימוש ברובוט. בחר את הצלחות אגר 1,536 מקור היעד, ואת משטח 1,536 פין קצר. בחר את התוכנית לשכפל .
    2. תיק הלוחות, דגירה אגר בצד למעלה ב 30 ° C עד 7 ימים.
  5. הדמיה של הבדיקה צלחות
    1. עבור זנים DNA-הפיתיון עם רקע עיתונאי פעילות, לצלם תמונות בימים 2, 3 ו- 4. אחרת, לצלם תמונות ימים 4 ו-7. אינטראקציה חיובית מזוהים על ידי צמיחה וצבע כחול של המושבות שמרים, יכול להיקבע באופן ידני, או ניתן לקבוע באמצעות תוכנת ניתוח התמונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שלושה גורמים עיקריים יש לשקול בעת ניתוח תוצאות מבחני eY1H: הפעילות העיתונאית רקע של המתח DNA-פיתיון, עוצמת הפעילות העיתונאית המתאים TF-DNA אינטראקציות, ואת מספר מושבות חיובי. הפעילות העיתונאית רקע (קרי: autoactivity) של המתח DNA-פיתיון מתייחס הצמיחה הכללי ואת הצבע של המושבות שמרים בצלוחית readout, אפילו בהיעדר TF-טרף. באופן אידיאלי, זנים שאינם autoactive להראות על רקע לבן או בהיר צבע חום, עם מושבות עבור אינטראקציות חיוביות להיות גדול וכחול. Autoactive DNA-פיתיון זנים הצג צמיחת שמרים מדיה חסר היסטידין, צבע כחול בנוכחות X-גל עבור כל המושבות בצלחת, אשר היא ככל הנראה קשורות הכריכה של שמרים תעתיק מפעילים ה-DNA-פיתיון8. הכוח של הכתב פעילות התואם האינטראקציות TF-DNA מזוהה (קרי, הגודל של המושבה) והעוצמה של כחול תלוי פרמטרים רבים כגון בזיקה, רמת הביטוי TF שמרים, המספר של איגוד אתרים, מרחק היזמים שמרים מינימלי הממוקם במעלה הזרם של הגנים כתב, ואת הפעילות העיתונאית רקע של המתח DNA-פיתיון. לדוגמה, הכוח הגרעיני החלש עשוי להתגלות בקלות ב פיתיון רקע נמוך אבל עשוי להיות קשה לזהות autoactive או רקע לא אחיד פיתיון. זה גם חשוב לציין הפעילות העיתונאית רמות שמרים לא בהכרח לתאם עם פעילות תקינה בתאי אדם, כמו המבנה כרומטין, נוקלאוזום מיצוב, ואת המרחק אפקטים שונים בין שמרים ואנושי. עוד, קשרי הגומלין של האדם נוטים להיות מושפעים הכריכה של TFs ו cofactors אחרים או עשויים להיות רעולי פנים על-ידי שר מיותר מבחינה פונקציונלית8. לבסוף, אינטראקציות נחשבים חיובי eY1H מבחני כאשר לפחות שניים של המושבות ארבע הצג ביטוי כתב מעל רקע רמות. עם זאת, הבחנו כי ~ 90% של אינטראקציות זיהוי כתוצאה מן כל המושבות ארבע המקביל TF להיות חיובית10,12,19.

כדי להמחיש את הסוג של תוצאות ניתן להשיג באמצעות מבחני eY1H הוקרנו האזורים יזם (2 kb במעלה הזרם של האתרים התחלה שעתוק) של הגנים CCL15 ו- IL17F, נגד מערך של TFs 1,086 אנושי (איור 2). האמרגן CCL15 הוא דוגמה הלא-autoactive DNA-לפתיון איפה אינטראקציות, אפילו חלשים, יכול להיות בקלות זוהה (איור 2 א). האמרגן IL17F הוא דוגמה autoactive DNA-הפיתיון עם רקע לא אחיד לכתב פעילות, שבו ניתן להבחין כמה אינטראקציות בזמן עבור שר מספר זה לא בטוח הפעילות העיתונאית הוא גבוה יותר רקע (איור 2B).

בעיות שניתן נתקל בעת ביצוע מבחני eY1H

למרות ההקרנה פרוטוקול eY1H הוא ישר קדימה וחזק, מספר בעיות שניתן נתקל במהלך המסך:

1) מושבות קטנות מדי ונכשלים העברה (איור 3 א): למרות זה צפוי כי כמה שמרים לבטא TFs אקסוגני עשוי להציג צמיחה איטית בהתחשב בכך שמרים גנים עשויים להיות dysregulated, בדרך כלל ~ 95% של TF-טרף מושבות להציג נורמלי הצמיחה. אם יותר מ-10% של המושבות לא לגדול, הסיבות בתדירות הגבוהה ביותר הן בעיות בתקשורת או עם העברת שמרים. צמיחה שיוצרת לעתים קרובות קשורה אחד המרכיבים מדיה מאבד את הפעילות (למשל אורציל, היסטידין או לאוצין), שניתן לפתור על-ידי הכנת המדיה טריים עם פתרונות מניות טריים. לחלופין, זה עשוי גם להיות קשור היסט הצמדה המשפיעה על העברת המושבה. במקרה זה, ודא כי הידיות 1,536 להצמיד במרכז המושבה שמרים הצלחות מקור.

2) לא הגידול שמרים בחלק של הלוח (איור 3B): בעיה זו קשורה בדרך כלל עם כישלון בשלב החיזור אם משטח 1,536 pin נכשל ביצירת קשר עם השמרים את הדנ א-פיתיון זן הדשא, המערך TF, או את הצלחת ההזדווגות. כמעט בכל המקרים, זאת עקב אגר לא אחיד רמת התקשורת במהלך צלחת השוטף או עקב שימוש מופרז מתייבש של הצלחת.

3) אינטראקציות לא מזוהה (איור 3C ו- D): בעיה זו קשורה לעתים קרובות גם מוטציות inactivating לא מכוונות כתב בגנים, LacZ מסוים (איור 3C), או autoactivity גבוה זה מסכה אינטראקציות (איור 3D)-כדי לפתור את הבעיה, מומלץ למסך עוד מאמץ שהושג באופן עצמאי התואם הפיתיון-DNA זהה.

4 צלחת) מציג כתמים כחולים אקראיים (איור 3E): בעיה זו קשורה לעתים קרובות זיהום חיידקי. כדי לפתור בעיה זו, צובעות את השמרים להשיג מושבות בודדות, וחזור על המסך.

הנ ל הם הבעיות הנפוצות נתקל בעת ביצוע מבחני eY1H. צריך להתעורר בעיות אחרות, הכנת מדיה חדשה, המאשר כי ההגדרות המתאימות עבור רובוט HDA שימשו, בדיקות זנים מרובים לכל ה-DNA-פיתיון כנראה יפתור את רוב הבעיות.

Figure 1
איור 1 : חלוקה לרמות של eY1H assay מסכים. (א) השוואה בין שיטות TF ממורכז, ממורכז דנ א כדי לזהות אינטראקציות חלבון-DNA. . תרשים של מבחני eY1H (B). רצף ה-DNA של הריבית (מקדם מכירות, משפר, משתיק קול, וכו ') שיכפל במעלה הזרם של הכתב HIS3 ו LacZ גנים משולב לתוך הגנום שמרים. המתח שנוצר DNA-פיתיון זה הזדווגו לאוסף של זני שמרים מחסה TFs התמזגו לתחום הפעלה Gal4 (AD). אינטראקציה חיובית נקבעים לפי היכולת של השמרים לצמוח בלי היסטידין והתגברות על מעכב תחרותי 3-AT, יהפך לכחול בנוכחות X-גל. (ג) צינור עבור מסכי eY1H. מדשאה של שמרים זן ה-DNA-פיתיון גדל לתוך צלחת YAPD הוא הזדווגו בצלחת YAPD למערך המושבה 1,536 לבטא TFs דבוקה לספירה גדלו על צלחת −Trp Sc. אחרי יום אחד, השמרים מועבר −Trp −U Sc לבחירה שמרים דיפלואידי. לאחר דגירה 2-3 ביום, השמרים מועבר Sc −U −H −Trp + 3AT + צלחת X-גל (צלחת readout) כדי לזהות אינטראקציות חלבון-DNA. אינטראקציה נבחנה ארבע פעמים.  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : דוגמאות צלחות readout eY1H. (א) אינטראקציות מעורבים האמרגן של CCL15, פיתיון הלא-autoactive. רקע פעילות עיתונאית כפיתיון זה הוא נמוך (מופחתת צמיחה בהיעדרו של היסטידין, היעדר צבע כחול ללא אינטראקציה TFs). (B) אינטראקציות מעורבים האמרגן של IL17F, פיתיון autoactive. רקע פעילות כתב כפיתיון. הזה הוא גבוה (צמיחה בהיעדרו של היסטידין, רקע כחול הצבע בכל הלוח), לא אחיד, שהופך אותו מאתגר כדי לזהות אינטראקציות חלבון-DNA. חזק, בינוני, ואינטראקציות החלשים הם בריבוע באדום, כתום וצהוב, בהתאמה. שמות HGNC של TFs שמעצבת מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : בעיות במסכים eY1H. (א) TF-טרף מערך שבו מושבות מרובות נכשל לגדול. (B) Readout צלחת בהם מושבות בפינה השמאלית התחתונה הצליחו להעביר. (ג) זן Non-autoactive DNA-פיתיון שאינו מציג אינטראקציה חיובית. (ד) מאוד זן autoactive DNA-פיתיון שאינו מציג אינטראקציה חיובית. (E) צלחת Readout הצגת מספר מושבות כחול בשל זיהום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איתור מערך TF
יום 1 במקום שמרים לתוך צלחת Sc-Trp בתבנית המושבה 96 (2.1 ו- 2.2)
יום 4 ליצור מערך TF המושבה 384 (2.3)
יום 6 ליצור מערך TF 1,536 המושבה (2.4)
יום 9 להגביר את המושבה 1,536 TF מערך (2.5)
הכנת ה-DNA-פיתיון זן דשא להזדווגות
יום 6 במקום השמרים DNA-פיתיון זנים (3.1.1)
יום 9 פס שמרים, 12-16 זנים לכל צלחת (3.1.2)
יום 10 פס שמרים, 4 זנים לכל צלחת (3.1.3)
יום 11 להכין מדשאות DNA-פיתיון (3.1.4 ו 3.1.5)
ההזדווגות של שמרים DNA-פיתיון וללחצים מערך TF
יום 12 הזדווגות של צלחות YAPD (3.2)
הבחירה של שמרים דיפלואידי
ביום 13 הבחירה של שמרים דיפלואידי ב- Sc-U-Trp צלחות (3.3)
להעביר readout צלחות
ביום 15 להעביר שמרים דיפלואידי readout צלחות (3.4)
הדמיה של הבדיקה צלחות
ימים 17-22 ייבוא תמונות של צלחות readout בהתאם רקע (3.5)

טבלה 1: מערך TFF.

מגיב הכמות (עבור 2 ל')
הנשירה תערובת סינתטית מינוס היסטידין, לאוצין, טריפטופן, אורציל, אדנין, עשיר (דור 2) ללא שמרים חנקן הבסיס 2.6 גרם
חנקן שמרים בסיסי ללא חומצות אמינו וללא אמוניום סולפט (YNB) 3.4 גרם
אדנין hemisulfate וגופרית והרכבו 160 מ ג
. אמוניום סולפט 10 גרם
אגר 35 גרם
גלוקוז (40%, w/v) במים, סטרילי 100 מ
לאוצין (100 מ מ), סטרילי מסונן מ ל 16
טריפטופן (40 מ מ), סטרילי מסונן מ ל 16

טבלה 2: ריאגנט לפרט אני.

מגיב הכמות (עבור 2 ל')
Peptone 40 g
תמצית שמרים 20 גרם
אדנין hemisulfate וגופרית והרכבו 0.32 גרם
גלוקוז (40%, w/v) במים, סטרילי 100 מ
אגר 35 גרם

טבלה 3: רשימת ריאגנט II.

מגיב הכמות (עבור 2 ל')
הנשירה תערובת סינתטית מינוס היסטידין, לאוצין, טריפטופן, אורציל, עשיר אדנין (דור 2) ללא שמרים חנקן הבסיס 2.6 גרם
חנקן שמרים בסיסי ללא חומצות אמינו וללא אמוניום סולפט (YNB) 3.4 גרם
אדנין hemisulfate וגופרית והרכבו 160 מ ג
. אמוניום סולפט 10 גרם
אגר 35 גרם
גלוקוז (40%, w/v) במים, סטרילי 100 מ
לאוצין (100 מ מ), סטרילי מסונן מ ל 16
היסטידין (100 מ מ), סטרילי מסונן מ ל 16
אורציל (20 מ מ), סטרילי מסוננים (להשמיט עבור לוחות-Trp – U Sc) מ ל 16

בטבלה 4: רשימת ריאגנט III.

מגיב הכמות (עבור 2 ל')
הנשירה תערובת סינתטית מינוס היסטידין, לאוצין, טריפטופן, אורציל, עשיר אדנין (דור 2) ללא שמרים חנקן הבסיס 2.6 גרם
חנקן שמרים בסיסי ללא חומצות אמינו וללא אמוניום סולפט (YNB) 3.4 גרם
אדנין hemisulfate וגופרית והרכבו 160 מ ג
. אמוניום סולפט 10 גרם
אגר 35 גרם
גלוקוז (40%, w/v) במים, סטרילי 100 מ
10 x BU מלחי 200 מ
לאוצין (100 מ מ), סטרילי מסונן מ ל 16
3AT (2 מטר), סינון סטרילי 5 מ
X-גל (80 מ"ג/מ"ל) ב- DMF 4 מ"ל

טבלה 5: ריאגנט ברשימה IV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

EY1H רובוטית ההזדווגות ההקרנה הגישה המתוארת כאן במידה רבה מגדילה את התפוקה כדי לזהות את קבוצת TFs לאגד לאזור ה-DNA של עניין, לעומת ההקרנה ספריה הקודמים או הקרנה ערוכים גישות המבוסס על שינוי. יתר על כן, את האינטראקציות TF-DNA מזוהה על-ידי eY1H מבחני הם מאוד לשחזור, כמו 90% של אינטראקציות שזוהו הן חיובית עבור כל המושבות ארבע בדיקות לכל TF, 90% של אינטראקציות תבדקי במסך עצמאית של אותם שמרים DNA-פיתיון זן10 , 12 , 19. יותר חשוב, אינטראקציות TF-DNA מזוהה על-ידי eY1H לאמת בשיעור 40% – 70% כאשר נבדק הכתב האנושי מבחני12,20בתאי אדם ראשי (שלא פורסמו תוצאות), ב- C. elegans ההסתרה חיות 11. זה שיעור אימות דומה לזה שנצפה שבב-seq נתונים21.

למרות אינטראקציות המזוהה על-ידי eY1H מאוד לשחזור כאשר שגוי שמרים מאותו זן ה-DNA-פיתיון, בדיקות זני שמרים שונים עבור אותו דנ א-פיתיון לפעמים מייצרת שונה, למרות חופפים, סטים של אינטראקציות TF-DNA. זה בדרך כלל בגלל הבדלים בפעילות עיתונאית רקע בין זנים. בנוסף, בדיקות שברי DNA רצף תוצאות זיהוי של אינטראקציות TF-DNA יותר מאשר בדיקות הרצף המלא, בפרט כאשר קטעים חופפים נבדקים. זה עשויות להיות קשורות עם וזמינותו להיות יותר יעיל בזיהוי אינטראקציות שקרובים היזמים מינימלי כתב, כי בדיקות חופפים שברי ומצמצמת את אתר איגוד שעשויים להיות occluded על ידי שמרים נוקליאוזומים. לפיכך, עבור פרויקטים בקנה מידה קטן, מומלץ הזה חופפים של 0.5-1 kb שברי אזור רגולטוריות נבדקים וכי שני זנים עצמאית מוקרנים כל רצף ה-DNA-פיתיון8.

ישנם מספר שלבים קריטיים ב eY1H הקרנת פרוטוקול כדי להימנע בחלק מן הנושאים המוצגים באיור3. ראשית, למרות שרוב החומרים מדיה יציבים במשך מספר חודשים (חוץ 3AT, X-גל), חוסר צמיחה נאות המושבה סביר מציין כי לפחות אחד המרכיבים איבד פעילות, יוחלף. שנית, חשוב להכין את הצלחות מלבני כך לבצע החלקה של אגר ועל כך הם לא מתייבשים יותר יום אחד למנוע כשל להצמדת בעת שימוש פלטפורמה רובוטית. בסופו של דבר, זה מפתח כדי להשתמש בתוכניות פלטפורמה רובוטית כמצוין בפרוטוקול (מחדש, מיחזור, ערבוב, וכו ') עבור השמרים שתועבר באופן יעיל, להזדווגות להיות יעילים, וכדי למנוע זיהום לחצות בין שמרים שיבוטים.

הדוגמאות בחרנו להדגים את השימוש במסכי eY1H מקבילים היזמים גנטי אנושי. עם זאת, אזורים רגולטוריים אחרים יכולים גם להיבדק כולל משפרי משתיקי קול. לדוגמה, השתמשנו eY1H מבחני להערכת איגוד TF משפרי התפתחותית אנושי, C. elegans הראשון אינטרונים12,22. בנוסף, לאור העובדה אינטראקציות נבדקים באופן pairwise, מבחני eY1H יכול לשמש כדי להשוות בין אינטראקציות בין גרסאות ללא קידוד, ובין וריאנטים רצף קידוד TF. לדוגמה, באמצעות מבחני eY1H זיהינו שינו TF איגוד למשתנים noncoding 109, הקשורים עם מחלות גנטיות שונות, כמו גם אינטראקציות דיפרנציאלית פרופילים עבור 58 TF missense מוטציות12,14. למרות פרוטוקול זה מתמקד הערכת TF איגוד לאזורים רגולטוריות האנושית, יכול DNA אזורים ממינים אחרים גם להיבדק ובלבד TF-טרף זמין או יכול להיווצר. אכן, TF-טרף מערכים נוצרו עבור C. elegans10 דרוזופילה melanogaster23, ס. מאסכאלאס24,25, תודרנית לבנה26, ו . זיה מייז 27. לפיכך, עם משאבים זמינים יותר ויותר, eY1H מבחני שיוחלו על מערכות נוספות.

למרות eY1H מבחני סייעו כדי לזהות את הרפרטואר של TFs לאגד לאזורים שונים רגולטוריות במין האנושי ואחרים, הן אינן חינם של אזהרות8,11,12,19 ,20,25. אחת המגבלות היא כי אינטראקציות נבדקים את חצרו של גרעין שמרים, למרות DNA-פיתיונות הם chromatinized, המבנה כרומטין שמרים שלא לשקף את מבנה כרומטין המין מן שבו נוצר DNA-הפיתיון, לא תשקף תא סוג הבדלים נצפתה ויוו. לפיכך, אינטראקציות המזוהה על-ידי eY1H מבחני יש לאמת כתב או מבחני פונקציונליות אחרות. של הערה, אנחנו ואחרים מצאו אינטראקציות TF-DNA מזוהה על-ידי eY1H לאמת בשיעור 40% – 70% מבחני פונקציונלי11,12,20,23. מגבלה נוספת של מבחני eY1H היא כי הוא אינו יכול לזהות אינטראקציות מעורבים TFs הדורשים שינוי post-translational נעדר שמרים לאגד דנ א, שר זה לא מקופלים כראוי שמרים בעת התמזגו לספירה של TFs החסרים מן המערך 8. בנוסף, בפורמט הנוכחי, מבחני eY1H מזהה את האינטראקציות מעורבים שר heterodimeric, כל המושבה שמרים במערך TF מבטא TF-טרף יחיד. לכן, נוסף שיפורים וזמינותו יהיה להגדיל את רוחב היריעה של שר זה ניתן לבדוק ולהרחיב את היכולות של מבחני eY1H לזהות את הרומן אינטראקציות TF-DNA

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים [R35-GM128625 כדי J.I.F.B.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

Tags

גנטיקה גיליון 144 שמרים אחד-היברידי Y1H תמלול פקטור אנושית ג'ין רגולציה הדנ א eY1H
מסכי אחד-היברידית משופרת שמרים לזהות גורם שעתוק מחייב את רצפי דנ א אנושי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C.… More

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter