Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Published: February 11, 2019 doi: 10.3791/59192
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1,2
1Department of Biology, Boston University, 2Bioinformatics Program, Boston University
* These authors contributed equally

Summary

Burada, bir Gelişmiş Maya bir melez Protokolü faiz bir insan DNA bölgesine bağlayabilirsiniz transkripsiyon faktörleri (TFs) tanımlamak için eleme mevcut. Bu yöntem bağlama sorguya çekebiliriz yüksek üretilen iş tarama ardışık düzen kullanan > 1000 TFs tek denemede.

Abstract

Her insan gen düzenleyen transkripsiyon faktörleri (TFs) kümesi tanımlayan çok sayıda deneysel ve hesaplamalı yaklaşımlar entegre gerektiren bir iştir. Böyle bir yöntem hangi Hofstede TFs ve DNA bölgeleri reporter genler kullanarak Maya çekirdeği ortamda sınanır Maya bir hibrid (Y1H) tahlil olduğunu. Y1H deneyleri iki bileşeni içerir: bir 'DNA-yem' (e.g., organizatör, arttırıcılar, susturucu, vb) ve bir 'TF-hangi muhabir gen harekete geçirmek için ekranlı av,'. Y1H ekranlar yerine getirmek için kullanılan en yayımlanmış protokolleri TF-av kitaplıkları veya dizileri DNA-yem maya suşları dönüşüm üzerinde temel alır. Burada, biz bir ardışık düzen tanımlamak, gelişmiş Y1H denilen (eY1H) deneyleri, nerede TF-DNA etkileşimleri DNA-yem suşları dizilmiş bir koleksiyonundan bir yüksek yoğunluklu kullanarak TF-av suşlarının çiftleşme tarafından sorguya bir 1,536 tarama sağlar (HDA) robot platformu Koloni biçimi. Bu işlem hacmi dramatik bir artış sağlar (karşı 60 DNA-yem dizileri > 1000 TFs araştırmacı başına iki hafta alır) ve tekrarlanabilirlik. Biz insan organizatörü dizileri 1,086 insan TFs yanı sıra ekranlar ve onları giderme sırasında ortaya çıkabilecek sorunları örnekleri bir dizi karşı test ederek beklenen sonuçları farklı türleri gösterilmektedir.

Introduction

Biyomedikal alanında merkezi bir sorun hangi tarafından her insan gen düzenlenmiştir mekanizmaları belirliyor. Transkripsiyon gen ifade düzeyleri kontrol ilk adım, ve bu her gen özgüdür transkripsiyon faktörleri (TFs) kümesi tarafından düzenlenir. Verilen bu insan için kodlamak > her gen ifadesi kontrol TFs eksiksiz kümesi tanımlayan 1.500 TFs1,2, kalır açık bir meydan okuma.

İki tür yöntemi TF-DNA etkileşimleri eşlemek için kullanılan: TF merkezli ve DNA merkezli yöntemleri3 (resim 1A). TF merkezli yöntemlerinde, bağlama genomik DNA bölgeleri veya onun DNA bağlama özgüllük belirlemek için bir TF ilgi probed. Bu yöntemler yüksek üretilen iş sıralama, protein bağlayıcı microarrays ve SELEX4,5,6takip kromatin immunoprecipitation (ChIP) içerir. DNA merkezli yöntemlerinde, DNA dizisi bağlamak TFs kümesini belirlemek için bir DNA dizisi ilgi probed. Bu yöntemlerden en yaygın olarak uygulanan Maya bir hibrid (Y1H) deneyleri, TFs ve DNA arasında hangi etkileşimleri bölgeleri reporter genler7,8,9kullanarak Maya çekirdeği ortamda test edilir var.

Y1H deneyleri iki bileşeni içerir: bir 'DNA-yem' (örneğin, organizatör, arttırıcılar, susturucu, vb) ve bir 'TF-hangi muhabir gen harekete geçirmek9,10 için (Şekil 1B) ekranlı av,'. DNA-yem akıntıya karşı klonlanmış iki muhabir gen (LacZ ve HIS3) ve her iki DNA-bait::reporter yapıları chromatinized 'DNA-yem suşları.' oluşturmak için Maya genom entegre edilmiştir TF-av, harekete geçirmek etki alanına Gal4 TF, Maya (AD) erimiş bir TF ifade eder bir plazmid kodlanmış TF-DNA etkileşimleri için balık için DNA-yem gerilim girmiştir. TF-av DNA-yem sırasına bağlanır, TF-av içinde mevcut reklam her iki gazeteci genleri harekete geçirmek yol açacaktır. Sonuç olarak, olumlu etkileşim içeren hücreler büyüme histidin eksik yanı sıra bir rekabetçi inhibitörü, 3-Amino-1,2,4-triazole (3-AT), üstesinden plakaları için seçilen ve X-gal huzurunda mavi koloniler olarak görüntülenir. Çünkü güçlü Maya Gal4 AD kullanıldığında, Y1H deneyleri ilgili transkripsiyon aktivatörleri yanı sıra repressors etkileşimleri algılayabilir. Ayrıca, verilen bu TF-dualarının güçlü Maya organizatörü (ADH1) ifade edilir, etkileşimleri için bile çip11,12' algılamak için zorlu düşük endojen ifade seviyesine sahip TFs algılanabilir.

Y1H deneyleri gerçekleştirmek için en yayımlanmış protokolleri seçimi, koloni tespit ve etkileşen TF tanımlamak için sıralama veya havuza alınmış TF-av kitaplıkları dönüştürerek Maya DNA-yem suşları TF-dualarının tanıtımı üzerinde temel alan bireysel dönüşüm8,9klonlar. Bunlar araştırmacı test edilebilir DNA dizileri sayısını sınırlama zaman alıcı kurallarıdır. Y1H deneyleri, adı verilen bir son gelişme Y1H Gelişmiş (eY1H), önemli ölçüde artmıştır tarama işlem hacmi Maya DNA-yem suşları maya suşları topluluğu ile her bir farklı ifade dostum için bir yüksek yoğunluklu dizi (HDA) robot platformu kullanarak TF-av10,13 (Şekil 1 c). Bu ekranlar bir 1.536 koloni biçimine izin en insan TFs sadece üç tabak kullanarak quadruplicate test etmek için istihdam. TF-DNA etkileşimleri ikili bir şekilde test edilir göz önüne alındığında, daha fazla, bu yaklaşım etkileşimler DNA-yemler (örneğin iki kodlamayan tek nükleotid çeşitleri) arasında farklı TFs arasında karşılaştırmak için olanak tanır veya TF türevleri11,12 ,14.

EY1H deneyleri kullanarak, biz en büyük insan ve Caenorhabditis elegans DNA merkezli TF-DNA etkileşimleri ağlar-Tarih belirlendi. Özellikle, 246 insan gelişimsel arttırıcılar ve 283 TFs122,230 Hofstede belirledik. Ayrıca, biz eY1H deneyleri 109 tek nükleotid kodlamayan değişik gelişimsel malformasyonu, kanser ve nörolojik bozukluklar gibi genetik hastalıklar ile ilişkili değişmiş TF bağlama ortaya çıkarmak için istihdam. Daha yakın zamanlarda, eY1H 21,714 etkileşimleri 2,576 C. elegans gen rehberleri ile 366 TFs11arasında oluşan bir ağ betimlemek için kullanılır. Bu ağ, C. elegans TFs onlarca işlevsel rolü ortaya çıkarmak için bir vesile oldu.

Protokol DNA-yem lekeleri oluşturmak ve arka plan muhabir etkinliği düzeylerini değerlendirmek için başka bir yerde15,16,17bildirdi. Burada, herhangi bir insan genomik DNA bölge 1,086 insan TFs bir dizi karşı ekran için kullanılan bir eY1H boru hattı açıklayın. Bir kez bir Maya DNA-yem zorlanma oluşturulur ve bir TF-av dizi karşılık gelen tabak fark edilir, tüm protokol iki haftada (Tablo 1) gerçekleştirilebilir. Daha da önemlisi, böylece tek bir araştırmacı 60 DNA-yem dizileri aynı anda ekran protokol parallelized. Protokol göstermek için iki sitokin gen CCL15 ve IL17F ve ekranlı. Buna ek olarak, eY1H deneyleri ve onları giderme işlemi sırasında ortaya çıkabilecek sorunları türlerini göstermek için başarısız ekranlar sonuç göster.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlıkları

  1. SC −U −H levha (150 mm Petri yemekler)
    Not: Bu tabakları DNA-yem maya suşları büyüyen için kullanılacaktır.
    1. Bırakma mix, Maya azot Bankası (YNB), adenin hemisulfate ve amonyum sülfat 920 ml su ve pH ile 5,9 5 M NaOH (yaklaşık medya litre başına 1 mL; kompozisyon için bkz: Tablo 2 ) ile geçiyoruz. Bir 2 L şişe dökün ve bir heyecan çubuğu ekleyin.
    2. Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 950 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).
    3. Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.
    4. Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün. Glikoz ekleyin karıştırın de heyecan tabağa ve serin bir su banyosu içinde 55 ° c.
    5. Lösin ve triptofan ortamına Ekle. De heyecan tabağa mix ve 150 mm Steril Petri yemekler (çanak başına ~ 80 mL) içine dökün. 3-5 gün oda sıcaklığında, Kuru şal plastik torbalarda ve 6 aya kadar oda sıcaklığında saklayın.
  2. YAPD dikdörtgen tabak
    Not: Bu tabakları DNA-yem zorlanma ve TF dizi koleksiyonu ile çiftleşme için çim büyüyen için kullanılacaktır.
    1. (Bkz Tablo 3 . kompozisyon için) tozlar, agar dışında 950 mL su 2 lt şişeye içinde dağıtılması ve heyecan çubuğu ekleme.
    2. Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 950 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).
    3. Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.
    4. Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün.
    5. Glikoz ekle mix de bir heyecan plaka ve serin ile 55 ° c Medya dikdörtgen kalıplara dökmek ( Tablo malzemelerigörmek; ~ 70 mL plaka başına) peristaltik pompa (5 mL/sn) ve 6 mm boru kullanma. 1 günde, oda sıcaklığında, Kuru sarın plastik torbalarda ve depolamak için 6 aya kadar soğuk odasında.
      Not: Önerilen ortam birimi plaka başına 70 mL olsa da, 50-80 mL plaka başına kullanılabilir. Otelde 1 dökme tabaklara dikkate alınacak üç kritik konular) agar medya plaka boyunca aynı kalınlıkta olması onlar seviyelendirilir (plaka dökme için düzeltilmiş tablo veya yüzey kullanma ve yediden fazla tabak yığınlarda dökmek değil) 2) agar kabarcıkları yokluğu sağlamak için medya (balonlar attı bir steril iğne kullanarak) ve 3) tabakları sadece bir gün için kurutma ambalajlama ve tabakları Maya sabitleme içinde hatalarını önlemek için plastik torbalarda.
  3. SC −Trp ve Sc −U −Trp dikdörtgen tabak
    Not: Bu tabakları TF dizi koleksiyon (Sc −Trp) büyüyen ve diploit Maya (Sc −U −Trp) çiftleşmeden sonra erkeğini seçmek için kullanılır.
    1. Bırakma mix, YNB, adenin hemisulfate ve amonyum sülfat 920 ml su ve pH ile 5,9 NaOH 5 M (yaklaşık medya litre başına 1 mL) ile dağıtılması (bkz. kompozisyon için Tablo 4 ). Bir 2 L şişe dökün ve bir heyecan çubuğu ekleyin.
    2. Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 950 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).
    3. Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.
    4. Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün. Glikoz ekleyin karıştırın de bir heyecan plaka üzerinde ve serin 55 ° C'ye
    5. (Sc −U −Trp plakalar urasil'ı atın) lösin, histidin ve urasil ekleyin.
    6. Mix de bir heyecan plaka üzerinde ve dikdörtgen tabaklar (plaka başına ~ 70 mL) içine dökün peristaltik pompa (5 mL/sn) ve 6 mm boru kullanma. Oda sıcaklığında 1 günde kuru, tabakları plastik torbalarda kaydırmak ve Soğuk Oda 3 aya kadar saklayın.
  4. SC −U −H −Trp + 3AT + X-gal dikdörtgen levha
    Not:     bu plaka okuma plakaları eY1H deneyleri için kullanılacaktır.
    1. Bırakma mix, YNB, adenin hemisulfate ve amonyum sülfat 850 mL su içinde erimesi (bkz. kompozisyon için Tablo 5 ). Değil pH yapmak. Bir 2 L şişe dökün ve bir heyecan çubuğu ekleyin.
    2. Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 850 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).
    3. Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.
    4. 10 BU tuzları (1 L) x 900 mL su, Na2HPO4∙7H2O 70 g ve 34,5 g NaH2PO4∙H2O. tozlar dağıtılması ve 7.0 kullanarak 5 M NaOH pH ayarlamak için bir heyecan çubuğunu kullanarak Mix birleştirerek hazırlayın. 1 L ve basınçlı kap getirmek için su ekleyin.
    5. X-gal çözüm bir 50 mL plastik tüp dimetil formamide 42,5 mL içeren 3.5 g X-gal tozu ekleyerek hazırlayın. X-gal toz daha kolay çözülmeye dimetil formamide ekleyin (Bu 30 dakika sürer). Hisse senedi çözüm (kullanım opak 50 ml tüp veya kapak folyo) anlatmamanı. -20 ° C'de mağaza
    6. Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün. Glikoz ekleyin ve 10 x (bkz. Tablo 5 kompozisyon için) BU tuzları, mix de bir heyecan plaka üzerinde ve serin 55 ° C'ye
    7. (Bkz. Tablo 5 kompozisyon için) lösin, 3AT ve X-gal ekleyin.
    8. Mix de bir heyecan plaka üzerinde ve dikdörtgen tabaklar (plaka başına ~ 70 mL) içine dökün peristaltik pompa (5 mL/sn) ve 6 mm boru kullanma. 1 günde, oda sıcaklığında, Kuru sarın plastik torbalarda ve alüminyum folyo kaplı soğuk odada depolamak (3AT ve X-gal ışığa duyarlı olan) en fazla 1 ay.

2. bir TF dizi lekelenme

  1. TF-av dizi çözdürme
    1. TF-av dizi buz ile Maya gliserol hisse senedi plakalar çözülme.
      Not: Daha önce yayımlanmış10,12,13,18TF-av diziler oluşturulabilir.
    2. Bir sonraki adım önce 1-3 dakika içinde 12 kanallı pipet kullanarak Maya resuspend.
  2. Maya Sc −Trp dikdörtgen tabaklar lekelenme.
    1. HDA robot (bakınız Tablo malzemeler), select çok iyi 96 plakaları kaynak, hedef ve 96 uzun PIN altlığı olarak 96 ağar kaplamalar olarak.
      Not: PIN pad yeniden kullanılabilir değildir ve atılmalıdır.
    2. 96-şey plaka başına iki kopya yapmak için Çoğaltmak birçok programı seçin. Geri dönüşüm kullanmayın veya dondurulmuş stoklarının arka kirlenmesini önlemek için seçenekleri tekrar.
    3. Yukarı ve aşağı Maya karışımı kaynağında girdap seçeneğini belirleyin.
    4. Benekli dizi çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C'de 2 – 3 gün kuluçkaya.
  3. 384 koloni diziler Sc −Trp dikdörtgen levha üretme
    1. Robotun içine 96 ağar kaplamalar kaynak, hedef olarak 384 agar plaka ve 96 kısa PIN altlığı seçin.
    2. 1:4 dizi programı seçin. Bu şekilde, dört 96 koloni tabak (her bir farklı TF içeren) bir 384 koloni plaka konsolide edilecek. Geri dönüşüm kullanmayın veya seçenekleri farklı plakalar arasında kirlenmesini önlemek için tekrar.
    3. Tabakları çanta ve benekli 384-koloni dizi agar tarafı yukarı 30 ° C de 2 gün kuluçkaya.
  4. Sc −Trp dikdörtgen levha 1.536 koloni diziler oluşturma
    Not: Bu dört kolonileri her TF avlarına içeren diziler sonuçlanır.
    1. Robotun içine 384 ağar kaplamalar kaynak, hedef olarak 1.536 ağar kaplamalar ve 384 kısa PIN altlığı seçin.
    2. 1:4 tahlil tek kaynak programı seçin. Her koloni quadruplicates elde etmek için dört kolonileri kopyalamak için hedeftir. Geri dönüşüm kullanın ve işin içinde dört kez her koloni kopyalama seçenekleri tekrar.
    3. Tabakları çanta ve benekli 1536-koloni dizi agar tarafı yukarı 30 ° C'de 3 gün kuluçkaya.
  5. Sc −Trp dikdörtgen tabaklar 1.536 koloni dizide yükseltecek
    1. Robotun içine 1.536 ağar kaplamalar kaynak, hedef olarak 1.536 ağar kaplamalar ve 1.536 kısa PIN altlığı seçin.
    2. 3-4 kopya çoğaltmak için Çoğaltma birçok programı seçin. Geri dönüşüm kullanın ve seçeneği tekrar ama çapraz bulaşma kaçınmak için dizi farklı bir tabak için geçiş yaparken panelindeki atmak.
    3. Tabakları çanta ve benekli 1536-koloni dizi agar tarafı yukarı adımları (aşağıya bakın) çiftleşme için kullanmak 3 gün 30 ° C'de kuluçkaya. Bundan sonra tabakları oda sıcaklığında ve kopya tarama yeni bir turu için 7 gün sonra tekrar tutmak.

3. eY1H ekran

  1. DNA-yem zorlanma çimenler çiftleşme için hazırlanıyor
    1. Maya DNA-yem suşları Sc −U −H plaka üzerinde spot ve 30 ° C'de 3 gündür büyümek
    2. Böylece her plaka 12-16 farklı suşları uygun Maya 15 cm steril bir kürdan kullanarak Sc −U −H plaka çizgi. 30 ° C'de bir gün kuluçkaya
    3. Böylece her plaka 4 farklı suşları uygun Maya 15 cm steril bir kürdan kullanarak Sc −U −H plaka çizgi. 30 ° C'de bir gün için kuluçkaya
    4. Değil herhangi bir agar raspa ve 500 µL steril su ile 1,5 bir tüp içine eklemek emin steril bir kürdan kullanarak Maya kazı.
    5. 10-15 steril cam boncuk YAPD dikdörtgen plaka üzerine ekleyin. Maya süspansiyon plaka üzerine ekleyin ve Maya kalenin yayılır emin olmak 1 dk her yöne iyice çalkalanır.
    6. Kalenin hemen ters çevir ve böylece boncuk kapak için dokunun. Kaldırmak ve boncuk geri dönüşüm.
    7. Tabakları çanta ve agar tarafı aşağı 30 ° C'de 1-2 gün kuluçkaya Daha sonra çiftleşme adıma geçin.
  2. Maya DNA-yem ve TF dizi suşları çiftleşme
    1. TF dizi YAPD dikdörtgen plaka robot ile aktarın. Kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad 1.536 agar kalıbı seçin. Çoğaltmak birçok programı seçin. Her TF dizi plaka 3-4 YAPD tabak (bağlı olarak dizi levha sayısı) aktarmak için kullanılabilir. Çiftleşme için kullanılan TF dizi tabak 2 – 3 gün eski olması gerekir ama çiftleşme olarak daha verimsiz olabilir.
    2. Bahçede büyük bir DNA-yem yük zaten içeren TF dizi robot YAPD plakaları aktarın. Kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad 1.536 agar kalıbı seçin. Çoğaltmak birçok programı seçin. Maya aynı noktadan almaktan kaçının için kaynak ~0.6 mm yarıçaplı rasgele sapmalarla kullanın ve maya suşları arasında temas kolaylaştırmak hedefte karıştırın. Kaynak ve hedef olarak 3.2.1. adımda benekli TF dizi içeren YAPD plakaları olarak DNA-yem suşları (Bölüm 3.1) içeren çim kullanın.
    3. Tabakları çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C'de 1 gün için kuluçkaya.
  3. Diploit Maya yelpazesi
    1. Şeklindeki Maya YAPD plakaları ile robot Sc −U −Trp tabakaları bana aktarın. Kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad 1.536 agar kalıbı seçin. Çoğaltmak istediğiniz programı seçin. Kaynak ve hedef karıştırın.
    2. Tabakları çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C'de 2-3 gün (uzun kuluçka yüksek arka plan muhabir etkinliği için olur) için kuluçkaya.
  4. Okuma plakaları için transfer
    1. Diploit Maya Sc −U −Trp plakalar aktarım okuma dikdörtgen tabaklar Sc −U −H −Trp + 5 mM 3AT + 0.4 mM X-gal robot kullanarak. 1.536 ağar kaplamalar kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad seçin. Çoğaltmak istediğiniz programı seçin.
    2. Tabakları çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C de 7 gün için kuluçkaya.
  5. Okuma plakaların görüntüleme
    1. Yüksek arka plan muhabir etkinliği ile DNA-yem suşları için gün 2, 3 ve 4 fotoğraf çekmek. Aksi takdirde, 4 ve 7 gün fotoğraf çekmek. Olumlu etkileşimler mantar kolonileri büyüme ve mavi renk tarafından tanımlanır ve el ile belirlenebilir veya görüntü analiz yazılımı kullanarak belirlenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Üç ana faktör ne zaman analiz eY1H deneyleri sonuçları düşünülmelidir: arka plan muhabir etkinliği DNA-yem baskı, TF-DNA etkileşimleri ve olumlu kolonileri sayısına karşılık gelen muhabir etkinlik gücünü. DNA-yem zorlanma arka plan muhabir etkinliği (örneğin, autoactivity) genel büyüme ve okuma plaka bir TF-av yokluğunda bile Maya kolonilerde rengini gösterir. İdeal olarak, bir arka plan beyaz veya açık kahverengi renk, Sigara autoactive suşları göstermek colonies olumlu etkileşimler için daha büyük ve mavi olmak. Autoactive DNA-yem suşları histidin ve bütün kolonilerde büyük olasılıkla Maya transkripsiyon aktivatörleri DNA-yem8bağlama ile ilgili plaka için X-gal huzurunda renk mavi eksik medya Maya büyüme gösterir. Benzeşme, Maya TF ifade düzeyinde, bağlayıcı siteleri ve uzaklık sayısı gibi pek çok parametre algıladı TF-DNA etkileşimleri karşılık gelen muhabir etkinlik (yani, koloni boyutu) ve mavi yoğunluğunu gücünü bağlıdır bulunan Maya en az Rehberleri reporter genler ve arka plan muhabir etkinliği büyük DNA-yem yük ters yönde. Örneğin, zayıf etkileşim bir düşük arka plan yem kolayca algılanabilir ama bir autoactive veya düzensiz arka plan yem tespit etmek zor olabilir. Önemli bu muhabir etkinliği unutmayın Maya seviyelerinde mutlaka kromatin yapısı olarak insan hücrelerinde etkinlik düzenleyici ile konumlandırma, nucleosome ilişkilendirmek değil ve Maya mesafe etkileri farklıdır ve insan da. Ayrıca, insan etkileşimleri diğer TFs ve Kofaktörler bağlama tarafından etkilendiği muhtemeldir veya işlevsel olarak gereksiz TFs8tarafından maskeli. Son olarak, en az iki dört kolonileri arka plan seviyelerin üzerinde muhabir ifade gösterdiğinizde etkileşimleri eY1H deneyleri pozitif kabul edilir. Ancak, ~ %90 etkileşimlerin sonucu olumlu10,12,19olmak bir TF karşılık gelen tüm dört kolonilerden tespit gözlemledim.

EY1H deneyleri kullanılarak elde edilebilir sonuçlar türünü göstermek için (2 kb akıntıya karşı transkripsiyon başlangıç siteleri) Organizatörü bölgelerinde 1,086 insan TFs (Şekil 2) bir dizi karşı CCL15 ile IL17F gen Ekranlı. CCL15 organizatörü örneğidir bir sigara autoactive DNA-nerede etkileşimleri, hatta yem zayıf olanlar,-ebilmek var olmak kolayca tespit (Şekil 2A). IL17F organizatörü, düzensiz arka plan muhabir aktivitesiyle bir autoactive DNA-yem için birkaç TFs o muhabir etkinliği arka plan (Şekil 2B) daha yüksek olup olmadığı belirsiz olmakla birlikte nerede bazı etkileşimler tespit edilebilir örneğidir.

EY1H deneyleri yapılırken karşılaşılan sorunlar

Her ne kadar tarama eY1H protokoldür düz ileri ve sağlam, çeşitli sorunlar ekran sırasında karşılaştı:

1) koloniler çok küçük ve aktarımı (Şekil 3A) başarısız: eksojen TFs ifade bazı Maya Maya gen ekspresyonu dysregulated olabileceğini göz önüne alındığında yavaş büyüme görüntüleyebilir bekleniyor olsa da, genellikle ~ %95 TF-av kolonileri normal görüntüler büyüme. Koloniler % 10'dan daha büyümek için başarısız olursa, en sık nedenleri sorunları ile kitle iletişim araçları ya da Maya transferi ile vardır. Suboptimal büyüme sık taze stok çözümleri ile taze medya hazırlayarak çözüldü etkinliği (örneğin, urasil, histidin veya lösin) kaybetme media bileşenlerinden biri ile ilgili. Alternatif olarak, bu da koloni transfer etkiler bir sabitleme uzaklığı ilgili olabilir. Bu durumda, 1.536 yastıkları kaynak tabak maya kolonilerde merkezi pin doğrulayın.

2) plaka (Şekil 3B) bir kısmını hiçbir Maya büyüme: 1.536 PIN pad yapmak başarısız olursa bu sorun genellikle bir hata çiftleşme adımda ile ilgilidir Maya DNA-yem zorlanma çim, TF dizi veya çiftleşme plaka ile iletişim. Hemen hemen her durumda, bu düzensiz agar medya level plaka boşaltma sırasında nedeni veya aşırı tabak neredeyse.

3) hiçbir etkileşimleri tespit edildi (Şekil 3 c ve D): Bu sorun sık sık reporter genler belirli LacZ (Şekil 3 c), ya da istenmeyen inactivating mutasyonların veya etkileşimler (Şekil maske yüksek autoactivity ilgili 3D). Bu sorunu gidermek için bu aynı DNA yem için karşılık gelen başka bir bağımsız olarak elde edilen soy ekran önerilir.

4) plaka rasgele mavi lekeler (Şekil 3E) sunar: Bu sorun genellikle bakteriyel kirlenme ile ilişkili. Bu sorunu çözmek için bireysel kolonileri elde etmek için Maya çizgi ve ekranın tekrarlayın.

Yukarıdaki eY1H deneyleri yapılırken karşılaşılan en sık görülen sorunlar vardır. Diğer sorunlar, ortaya gereken yeni medya hazırlanıyor, teyit HDA robot için uygun ayarları kullanıldı ve DNA-yem başına birden fazla suşları test büyük olasılıkla en sorunları çözmek.

Figure 1
Resim 1 : Anahat eY1H tahlil ekranlarının. Protein-DNA etkileşimleri tanımlamak için TF merkezli ve DNA merkezli yöntemleri arasında(a)karşılaştırma. (B) şemaları eY1H deneyleri. Bir DNA dizisi (organizatörü, artırıcı, susturucu, vb) ilgi klonlanmış akıntıya karşı HIS3 ve LacZ muhabir gen Maya genom entegre. Elde edilen DNA-yem zorlanma Gal4 harekete geçirmek etki alanı (reklam) erimiş TFs yataklık maya suşları koleksiyonuna şeklindeki. Olumlu etkileşimler histidin ve rekabetçi inhibitörü üstesinden 3-AT büyümeye Maya'nın yeteneği tarafından belirlenir ve X-gal huzurunda mosmor. (C) boru hattı eY1H ekranlar için. Bir çim bir Maya bir YAPD tabak içinde yetiştirilen DNA-yem zorlanma Sc −Trp tabağa yetiştirilen reklam için erimiş TFs ifade 1.536 koloni dizisine YAPD plaka şeklindeki. Bir gün sonra Maya diploit Maya için seçmek için Sc −U −Trp transfer edilir. 2-3 gün kuluçka sonra Maya bir Sc −U −H −Trp + 3AT + protein-DNA etkileşimleri tanımlamak için X-gal plaka (okuma plaka) aktarılır. Her etkileşim içinde quadruplicate mercek altına alındı.  Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : EY1H okuma tabak örnekleri. CCL15, bir sigara autoactive yem organizatörü ilgili ilişkin(a)etkileşimleri. Arka plan muhabir için bu yem faaliyettir düşük (düşük büyüme yokluğunda histidin ve mavi renk yokluğunda için sigara etkileşim TFs). IL17F, bir autoactive yem organizatörü ilgili ilişkin (B) etkileşimleri. Arka plan muhabir için bu yem faaliyettir yüksek (yokluğunda büyüme histidin ve arka plan mavi renk plaka boyunca) ve düzensiz, yapım o protein-DNA etkileşimleri tanımlamak için zor. Güçlü, orta ve zayıf etkileşimler kırmızı, turuncu ve sarı, sırasıyla kare. Etkileşen TFs HGNC adları gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : EY1H ekran sorunları. (A)TF-av dizi burada birden çok kolonileri büyümeye başarısız oldu. (B) okuma plaka nerede sol alt köşede kolonilerde aktarmak başarısız oldu. (C) Sigara-autoactive DNA-yem gerginlik, olumlu etkileşimler görüntülemez. (D) son derece olumlu etkileşimler görüntülemez autoactive DNA-yem zorlanma. (E) okuma plaka kontaminasyon nedeniyle birden fazla mavi koloniler görüntüleme. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

TF dizi lekelenme
Gün 1 Sc-Trp plaka 96 koloni biçiminde (2,1 ve 2,2) içine Maya spot
4. gün 384 koloni TF dizi (2,3) oluşturmak
Gün 6 1.536 koloni TF dizi (2.4) oluşturmak
Gün 9 1.536 koloni TF dizi (2.5) yükseltmek
DNA-yem zorlanma çimenler çiftleşme için hazırlanıyor
Gün 6 Maya DNA-yem suşları (3.1.1) spot
Gün 9 Çizgi Maya, 12-16 suşları plaka (3.1.2) başına
Gün 10 Çizgi Maya, plaka (3.1.3) başına 4 suşları
Gün 11 DNA-yem çimenler (3.1.4 ve 3.1.5) hazırlamak
Maya DNA-yem ve TF dizi suşları çiftleşme
Gün 12 Çiftleşme YAPD levha (3,2)
Diploit Maya yelpazesi
Gün 13 Sc-U-Trp tabak (3,3) diploit Maya yelpazesi
Okuma plakaları için transfer
Gün 15 Diploit Maya okuma tabak (3,4) aktarma
Okuma plakaların görüntüleme
Gün 17-22 Arka plan (3.5) bağlı olarak okuma plakaların resim alma

Tablo 1: Bank Asya dizi.

REAKTİF MİKTAR (2 L için)
Bırakma mix histidin, lösin, triptofan ve urasil, adenin, zengin sentetik (2 g) Maya azot temel w/o 2.6 g
Maya azot temel amino asitler ve amonyum sülfat (YNB) olmadan 3.4 g
Adenin hemisulfate dihydrate 160 mg
Amonyum sülfat 10 g
Agar 35 g
Glikoz (%40, w/v) su, steril 100 mL
Lösin (100 mM), steril filtre 16 mL
Triptofan (40 mM), steril filtre 16 mL

Tablo 2: Reaktif ben listelenmektedir.

REAKTİF MİKTAR (2 L için)
Pepton 40 g
Maya ekstresi 20 g
Adenin hemisulfate dihydrate 0,32 g
Glikoz (%40, w/v) su, steril 100 mL
Agar 35 g

Tablo 3: Reaktif liste II.

REAKTİF MİKTAR (2 L için)
Bırakma mix sentetik eksi histidin, lösin, triptofan ve urasil, w/o Maya azot baz adenin zengin (2 g) 2.6 g
Maya azot temel amino asitler ve amonyum sülfat (YNB) olmadan 3.4 g
Adenin hemisulfate dihydrate 160 mg
Amonyum sülfat 10 g
Agar 35 g
Glikoz (%40, w/v) su, steril 100 mL
Lösin (100 mM), steril filtre 16 mL
Histidin (100 mM), steril filtre 16 mL
Urasil (20 mM), steril filtre (Sc-U-Trp plakalar için atın) 16 mL

Tablo 4: Reaktif liste III.

REAKTİF MİKTAR (2 L için)
Bırakma mix sentetik eksi histidin, lösin, triptofan ve urasil, w/o Maya azot baz adenin zengin (2 g) 2.6 g
Maya azot temel amino asitler ve amonyum sülfat (YNB) olmadan 3.4 g
Adenin hemisulfate dihydrate 160 mg
Amonyum sülfat 10 g
Agar 35 g
Glikoz (%40, w/v) su, steril 100 mL
10 x bü tuzları 200 mL
Lösin (100 mM), steril filtre 16 mL
3AT (2 M), steril filtre 5 mL
DMF X-gal (80 mg/mL) 4 mL

Tablo 5: Reaktif liste IV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Robot eY1H çiftleşme tarama yaklaşımı büyük ölçüde burada açıklanan faiz önceki Kütüphane tarama için karşılaştırıldığında, ya da dönüşüm üzerinde göre dizilmiş tarama yaklaşımlar bir DNA bölgesine bağlamak TFs kümesini tanımlamak için daha fazla işlem hacmi artar. Ayrıca, tüm dört kolonileri için olumlu TF test edilmiş ve etkileşimleri yüzde 90'ını aynı Maya DNA-yem zorlanma10 bağımsız bir ekranda tekrar test etkileşimleri % 90'ı tespit deneyleri son derece tekrarlanabilir şunlardır eY1H tarafından algılanan TF-DNA etkileşimleri , 12 , 19. daha da önemlisi, insan muhabir deneyleri12,20, birincil insan hücreleri (yayınlanmamış sonuçları) ve C. elegans nakavt hayvanlar test edilirken bir % 40-% 70 oranında eY1H tarafından algılanan TF-DNA etkileşimleri doğrulamak 11. bu çip seq veri21için gözlenen için benzer bir doğrulama hızıdır.

EY1H tarafından tanımlanan etkileşimler aynı Maya DNA-yem zorlanma test ne zaman son derece tekrarlanabilir olmasına rağmen farklı maya suşları için aynı test DNA-yem bazen farklı, her ne kadar üst üste, TF-DNA etkileşimleri kümesini oluşturur. Bu genellikle arka plan muhabir etkinliği suşları arasında farklılıklar kaynaklanmaktadır. Buna ek olarak, bir DNA dizisi parçaları test daha tam sırası, özellikle test çakışan parçaları test ne zaman daha fazla TF-DNA etkileşimleri tespiti sonuçlanır. Bu muhabir en az Rehberleri yakın olan etkileşimleri belirlenmesinde daha verimli olmak tahlil ile ilgili olabilir ve üst üste test için parçaları bir bağlama site olabilir şansını azaltır tarafından Maya oluşturarlar tıkandı. Böylece, küçük ölçekli projeler için bu çakışan 0.5 – 1 tavsiye edilir bir düzenleyici bölgesi kb parçaları test ve iki bağımsız suşları için her DNA-yem sıra8ekranlı.

Bazı Şekil 3' te sunulan sorunları önlemek için iletişim kuralı tarama eY1H birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, her ne kadar çoğu medya malzemeler (hariç 3AT ve X-gal) birkaç ay boyunca stabildir, büyük olasılıkla doğru koloni büyüme eksikliği en az bir maddeler etkinlik kaybetmiş olabilir ve değiştirilmesi gerektiğini gösterir. İkinci olarak, agar fırlattı ve robot platformu kullanırken sabitleme hata önlemek bir günden fazla için kuru değil dikdörtgen tabak hazırlamak önemlidir. Son olarak, robot platformu programları etkili, verimli ve Maya klonlar arasında çapraz bulaşma önlemek için çiftleşme için transfer edilecek Maya için iletişim kuralı (tekrar, geri dönüşüm, karıştırma, vb) gösterildiği gibi kullanmak için anahtardır.

Biz eY1H ekranlar kullanımını göstermek için seçilmiş örnekler insan gen Organizatör için karşılık gelir. Ancak, düzenleyici diğer bölgelerde de arttırıcılar ve susturucu gibi test edilebilir. Örneğin, TF bağlama insan gelişimsel arttırıcılar ve C. elegans ilk intron12,22değerlendirmek için eY1H deneyleri kullandık. Ayrıca, verilen bu etkileşimleri ikili bir şekilde test edilir, eY1H deneyleri etkileşimleri TF kodlama sırası türevleri ve türevleri kodlamayan arasında karşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, biz tespit eY1H deneyleri kullanarak farklı genetik hastalıklar ve 58 TF missense mutasyonlar12,14farklı etkileşimleri profilleri ile ilgili 109 kodlamayan türevleri TF bağlama değişmiş. Her ne kadar bu iletişim kuralı TF bağlama insan düzenleyici bölgelere değerlendirilmesi üzerinde duruluyor, koşuluyla bir TF-av kullanılabilir veya oluşturulabilir DNA bölgeleri diğer türlerden de sınanabilir. Nitekim, TF-av dizileri üretilen C. elegans10, Drosophila melanogaster23, Mus musculus24, Arabidopsis thaliana25,26, ve Zea mays 27. böylece, giderek kullanılabilir kaynaklar ile eY1H deneyleri ek sistemlere uygulanabilir.

EY1H deneyleri insan ve diğer türlerin farklı yasal bölgelerde bağlamak TFs repertuar tanımlamak için enstrümantal olmasına rağmen onlar uyarılar8,11,12,19 ücretsiz değildir ,20,25. Sınırlamaları biridir etkileşimleri Maya çekirdeği ortamda test edilmiş ve DNA-yemler chromatinized rağmen Maya kromatin yapısında DNA-yem başlatıldığı üzerinden türler kromatin yapısında yansıtmıyor olabilir, ve hücre türü farklılıklar içinde vivo gözlenen yansıtmaz. Böylece, eY1H deneyleri tarafından tanımlanan etkileşimleri muhabir veya diğer fonksiyonel deneyleri doğrulanması gerekir. Not, biz ve diğerleri fonksiyonel deneyleri11,12,20,23yılında % 40-% 70 oranında eY1H tarafından algılanan TF-DNA etkileşimleri doğrulamak bulduk. Başka bir eY1H deneyleri etkileşimler DNA, düzgün reklam için erimiş zaman Maya içinde katlanmış değil TFs ve diziden eksik TFs bağlamak için Maya olarak yok post-translational değişiklikleri gerektiren TFs içeren algılayamaz kısıtlamasıdır 8. her Maya kolonisi TF dizideki tek bir TF-av ifade eder gibi Ayrıca, geçerli biçiminde eY1H deneyleri heterodimeric TFs, ilgili etkileşimleri algılamaz. Böylece, tahlil gelişmeler test edilebilir ve Roman TF-DNA etkileşimleri tanımlamak için eY1H deneyleri yeteneklerini genişleten TFs genişliğini daha da artacak

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Acknowledgments

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri [J.I.F.B. için R35-GM128625] tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC Sigma A8056-100G Competitive inhibitor for products of HIS3 gene
Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate US Biologicals A0865 Required for proper yeast growth
Agar High Gel Strength - Bacteriological grade American International Chemical AGHGUP Nutritive media for yeast growth
Ammonium Sulfate US Biologicals A1450 Nitrogen source in synthetic yeast media
D+ Glucose Anhydrous US Biologicals G3050 Required for yeast growth
Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base US Biologicals D9540-02 Synthetic complete media required for yeast growth
edge Multiparameter pH Meter Hanna Instruments HI2020-01 To measure pH of selective media
Flat Toothpicks 750 ct Diamond To streak yeasts on petridishes
Glass Beads Walter Stern 100C To spreak yeast when making lawns
Glycerol ≥99% Millipore Sigma G9012-1L Required to make frozen yeast stocks
L-Histidine US Biologicals H5100 For yeast growth selection in selective media
L-Leucine US Biologicals L2020-05 For yeast growth selection in selective media
L-Tryptophan Sigma T-0254 For yeast growth selection in selective media
N,N-Dimethylformamide Sigma 319937-1L To make X-gal solution
Omnipense Elite Wheaton W375030-A For dispensing accurate volumes of media into Singer plates
Peptone, Bacteriological American International Chemical PEBAUP Protein source required for yeast growth
Petri Dish, 150 mm x15 mm VWR 10753-950 For growing yeast baits for screening
PlusPlates Singer Instruments PLU-003 To make rectangular agar plates to use with Singer Robot
Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator ThermoFisher Scientific PR205745R To incubate yeast plates at constant temperature
RePads 1,536 short Singer Instruments REP-005 To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates
RePads 384 short Singer Instruments REP-004 To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format
RePads 96 long Singer Instruments REP-001 To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate
RePads 96 short Singer Instruments REP-002 To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format
Singer HDA RoToR robot Singer Instruments For transfering yeast in high-throughput manner
Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) Fisher S318-1 For adjusting pH of selective media
Sodium Phosphate dibasic heptahydrate Santa Cruz Biotechnology sc-203402C Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Sodium Phosphate monobasic monohydrate Santa Cruz Biotechnology sc-202342B Required for LacZ reporter activity on X-gal 
Uracil Sigma U0750-100G For yeast growth selection in selective media
X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) Gold Biotechnology X4281C100 β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction
Yeast Extract US Biologicals Y2010 Nutritious medium for growth and propagation of yeast
Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS  US Biologicals Y2030 Required for vigorous yeast growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
  2. Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  3. Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
  4. Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
  5. Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
  6. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  7. Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
  8. Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
  9. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  10. Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
  11. Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
  12. Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
  13. Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
  14. Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
  15. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  16. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  17. Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
  18. Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
  19. Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
  20. Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
  21. Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
  22. Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
  23. Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
  24. Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
  25. Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
  26. Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
  27. Burdo, B., et al. The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).

Tags

Genetik sayı: 144 Maya bir melez Y1H transkripsiyon faktörü insan gen düzenleme DNA eY1H
İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C.… More

Shrestha, S., Liu, X., Santoso, C. S., Fuxman Bass, J. I. Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences. J. Vis. Exp. (144), e59192, doi:10.3791/59192 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter