Summary
המתואר כאן הוא פרוטוקול לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם המעיים באמצעות מערכות תסיסה מחוץ למערכת.
Abstract
מיקרואורגניזמים מעיים אנושיים הפכו לאחרונה למטרה חשובה של מחקר בקידום בריאות האדם ומניעת מחלות. כתוצאה מכך, חקירות של אינטראקציות בין אנביוקינטיקה (למשל, תרופות וטרום ביודונטיה) ומיקרוביוטה לבטן הפכו לנושא מחקר חשוב. עם זאת, בניסויים vivo עם מתנדבים אנושיים אינם אידיאליים למחקרים כאלה בשל ביואתיקה ואילוצים כלכליים. כתוצאה מכך, מודלים בעלי חיים שימשו להערכת האינטראקציות הללו בvivo. למרות זאת, לימודי מודל בעלי חיים עדיין מוגבלים בשיקולים ביולוגיים, בנוסף לקומפוזיציות והבדלים שונים של מיקרוביוטה בבעלי חיים לעומת בני אדם. אסטרטגיית מחקר אלטרנטיבית היא השימוש בניסויים תסיסה אצווה המאפשרים הערכה של האינטראקציות בין אנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה בטן במבחנה. כדי להעריך את האסטרטגיה הזאת, נעשה שימוש ב-EP (ביף) האקפוליסכאנטיות (בדומה) כנציג מסוג xenobiotic יוטי. לאחר מכן, האינטראקציות בין ביף EPS לבין מיקרוביוטה בבטן האדם נחקרו באמצעות מספר שיטות כגון כרומטוגרפיה של שכבה דקה, ניתוח מקומי קהילתי חיידקי עם רצף התפוקה הגבוה של 16 rRNA, וכרומטוגרפיה של גז של חומצות שומן קצרות (SCFAs). המוצג כאן הוא פרוטוקול לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם המעיים באמצעות מערכות תסיסה מחוץ למערכת. וחשוב מכך, פרוטוקול זה יכול להיות גם שונה כדי לחקור אינטראקציות כלליות בין האנדוביוטיקה אחרים המעיים microbiota.
Introduction
מיקרוביוטה במעיים ממלאים תפקיד חשוב בתפקוד המעי האנושי ובבריאות המארחת. כתוצאה מכך, המעיים microbiota לאחרונה להיות יעד חשוב למניעת מחלות וטיפול1. יתר על כן, בקטריה המעיים אינטראקציה עם תאי מעיים מארחים ומווסת תהליכים מארחים יסודיים, כולל פעילויות מטבוליות, זמינות מזינים, אפנון מערכת חיסונית, ואפילו תפקוד המוח וקבלת ההחלטות2,3 . אנדוביוטיקה יש פוטנציאל רב להשפיע על הרכב חיידקי וגיוון של מיקרוביוטה בטן. כך, אינטראקציות בין האנדוביוטיקה ומיקרוביוטה האדם משכו את תשומת הלב מחקר הגוברת4,5,6,7,8,9.
קשה להעריך את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האנושית בvivo בשל האילוצים הביואתיים וההגבלות הכלכליות. לדוגמה, ניסויים החוקרים את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה האדם לא ניתן לבצע ללא אישור של מינהל המזון והתרופות, וגיוס מתנדבים הוא יקר. לכן, מודלים בעלי חיים משמשים לעתים קרובות לחקירות כאלה. עם זאת, השימוש במודלים בעלי חיים מוגבל בשל קומפוזיציות microbiota שונים וגיוון בבעלי חיים לעומת הקהילות הקשורות לאדם. חלופה בשיטת חוץ גופית כדי לחקור את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה ומיקרוביוטה האדם הבטן היא באמצעות השימוש בניסויים בתרבות האצווה.
הפרפוליסכדים (EPSs) הם prebiotics שתורמים באופן משמעותי לשמירה על בריאות האדם10. ברור epss כי מורכב של קומפוזיציות חד-סוכר שונים ומבנים יכולים להפגין פונקציות נפרדות. ניתוחים קודמים קבעו את ההרכב של ביף EPSs, אשר הם הנציג הבכיר ממוקד במחקר הנוכחי11. עם זאת, אפקטים מטבוליים המשויכים למארח לא נחשבו ביחס לקומפוזיציה ולגיוון של EPS.
הפרוטוקול המתואר כאן משתמש במיקרוביוטה צואה מ -12 מתנדבים להחמיץ את ביף EPSs. כרומטוגרפיה של שכבה דקה (למעלה), 16 s rRNA התפוקה הגבוהה ברצף של הגז, כרומטוגרפיה גז (GC) משמשים בשילוב כדי לחקור את האינטראקציות בין EPSs לבין מיקרוביוטה בטן האדם. יתרונות שונים של פרוטוקול זה בהשוואה לניסויים vivo הם בעלות נמוכה והימנעות של אפקטים מפריעים מחילוף החומרים של המארח. יתרה מזאת, ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר במחקרים אחרים החוקרים את האינטראקציות בין האנדוביוטיקה לבין מיקרוביוטה בבטן האדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של ועדת האתיקה של הונאן אוניברסיטת המדע והנדסה (הונאן, סין), ואת אוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג גונגאנג (ג'ג'יאנג, סין).
1. הכנת חיידקים
- הכנת מרק בינוני ביפידוחיידק
- שלב את הרכיבים הבאים ב 950 מ ל של מים מזוקקים: תמצית בשר, 5 g/L; תמצית שמרים, 5 גר'/L; פנימה של קזאין, 10 גרם/ליטר; soytone, 5 g/L; גלוקוז, 10 g/L; K2hpo4, 2.04 g/L; MgSO4· 7h2O, 0.22 g/L; . בסדר. H20, 0.05 g/L; המשך, 5 גר'/L; . רצף 80, 1 מ ל תמיסת מלח, 40 mL (CaCl2.2 h2O, 0.25 g/L; KH2פו4, 1 g/L; נחקו3, 10 גר'/L; הרוג, 2 גרם/ליטר); ו resazurin, 0.4 mL (2.5 mg/L). להתאים את ה-pH כדי 6.8 עם 2 M NaOH.
- אוטוקלב ב 121 ° c עבור 15 דקות ולאפשר ציר להתקרר לטמפרטורת החדר (RT) תחת תנאים אנאירובית (10% H2, 10% CO2, 80% N 2). הוסף סינון-מעוקר cysteine-HCl (0.5 g/L) ו-mupirocin (5 מ"ג/L) למדיום.
- להוסיף סדרת מחלקים (50 μl) של הקפואים bifidobacterium לונגום לצינור תרבות עם 5 מ ל של ציר בינוני של bifidobacterium תחת תנאים אנאירובית, אז תרבות בחממה אנאירובית עבור 24 h ב 37 ° c.
2. הכנת משקפיים
- הכנת בינונית-PYG אגר
- שלב את הפעולות הבאות: peptone, 20 g/L; תמצית שמרים, 10 גרם/ליטר; גלוקוז, 5 g/L; המשך, 0.08 ג'/ל; CaCl2, 0.008 g/L; MgSO4· 7h2O, 0.008 g/L; K2hpo4, 0.04 g/L; KH2PO4, 0.04 g/L; נחקו3, 0.4 ג'/ל; אגר, 12 g/L. להתאים את ה-pH כדי 7.2 באמצעות 10 M NaOH.
- אוטוקלב את התקשורת ב 121 ° c עבור 15 דקות וקריר עד ~ 50 ° c. אז, עבור 1 L של בינוני, להוסיף 0.5 mL של מסנן ויטמין K1 פתרון (1 גרם של ויטמין k1 מומס 99 mL של 99% אתנול), 5 מ ל של פתרון האמין (0.5 g של האמין הומס 1 מ ל 1 מול/L ' naoh , ואז הביא עד 100 mL עם מים מזוקקים), ו 0.5 g של cysteine-HCl.
- לפני שיוצקים את לוחיות PYG, להוסיף מסנן-מעוקר 5-bromo-4-כלורט-3-indolyl β-D-גלטופאוסייד (X-גל, 0.06 g/L), LiCl · 3H2O (5.7 g/l) ו-mupirocin (5 מ"ג/l) למדיום.
הערה: X-Gal ו-LiCl. 3H2O לאפשר זיהוי של B. longum מושבות על לוחות באמצעות שינויי צבע.
- מחסן 20 μL של B. longum זנים (שלב 1.2) כדי pyg צלחות ומקום בחממה אנאירובית ב 37 ° c עבור 72 h.
- לאסוף מושבות חיידקי mucoid מן הצלחות PYG באמצעות סקופ שקילה, ואז לחלוטין להשעות בתוך 10 מ ל של פוספט מאגור מלוחים (PBS) באמצעות מתנד מערבולת.
הערה: תערובות בקטריאלי ו-EPS צריך להיות מושהה לחלוטין על ידי vortexing או ללטף למעלה ולמטה שוב ושוב עד הסיבים מומס לחלוטין ב-PBS. - צנטריפוגה את ההשעיה ב 6,000 x g עבור 5 דקות.
- העבירו בזהירות את הסופרנטנים לצינור הצנטריפוגה החדש וערבבו לגמרי עם שלושה כרכים של קור 99% אתנול על ידי היפוך ומיזוג חוזרות ונשנות.
- צנטריפוגה את התערובת ב 6,000 x g עבור 5 דקות לחלוטין להסיר את supernatants.
- הסר את הזרזים מצינורות הצנטריפוגה על ידי גירוד וייבוש של מחלץ EPS לילה באמצעות ואקום מהירות.
3. הכנת מדיום תסיסה
- הכנת מדיום תרבות בסיסית VI
- שלב את הפעולות הבאות: peptone, 3 g/L; טריטונים, 3 גר'/L; תמצית שמרים, 4.5 g/L; mucin, 0.5 g/L; מלחי מרה מס ' 3, 0.4 g/L; המשך, 4.5 ג'/ל; KCl, 2.5 g/L; MgCl2· 6h2O, 4.5 g/L; 1 מ ל רצף 80; CaCl2. 6h2O, 0.2 g/L; KH2PO4, 0.4 g/L; MgSO4· 7h2O, 3.0 g/L; MnCl2· 4h2O, 0.32 g/L; FeSO4· 7h2o, 0.1 g/L; CoSO4· 7h2O, 0.18 g/L; CaCl2· 2h2O, 0.1 g/L; לאשר את היום4· 7h2O, 0.18 g/L; CuSO4· 5h2O, 0.01 g/L; ו-NiCl2· 6h2O, 0.092 g/L. להתאים את ה-PH כדי 6.5 עם HCl 1 M.
- הכן את האמין והציסטנין כפי שנעשה בסעיף 2.1 והוסף לאחר התיקון והצינון.
- הכן מדיה תרבותית המכילה מקורות פחמן שונים עם מדיית בסיס VI. לפני הפעלה אוטומטית, יש להוסיף 8 גרם/ליטר של סיבי EPS ל-VI הבינוני, הכולל קבוצה VI_Bif. בנוסף, הוסף 8 עמילן g/L ל-VI הבינוני כדי לייצג קבוצה VI_Starch. לבסוף, VI בינונית ללא תוספת של מקור פחמן משמש כפקד (קבוצה VI).
הערה: אם EPS ו עמילן הם הומס הראשון במים חמים באמצעות מגנטים מגנטיים, ולאחר מכן מעורבב עם הכין מדיום VI. - האוטוקלב כל המדיה ב 121 ° c עבור 15 דקות ולאפשר קריר כדי RT.
- העבר מדגם משנה (5 מ"ל) של כל בינוני לצינורות תרבות בחממה אנאירובית, ואחסן את המדיה הנותרת ב-4 ° c.
4. הכנה לדגימת צואה של אדם
- לאסוף דגימות בצואה טרי מיד לאחר הצרכים הטריים מתנדבים בריאים מבוגרים אנושיים באמצעות מכולות צואה, ולאחר מכן להשתמש לקראת הכנה להשתהות.
הערה: לפני איסוף המדגם, יש להקפיד על כל המתנדבים כדי להבטיח שאין צורך בטיפול באנטיביוטיקה, בפרוביוטיקה או בטיפולים מוקדמים למשך שלושה חודשים לפחות לפני תרומת דגימות. בנוסף, כל התורמים חייבים לספק הסכמה מושכלת, בכתב. - העבר מדגם צואה טרי (1 גרם) עד 10 מ"ל של 0.1 M אנאירובית PBS (pH 7.0) לתוך כוסות זכוכית, ואז להשתמש מוטות זכוכית כדי להכין 10% (w/v) ללגום.
- השתמש במכתש 0.4 מ"מ כדי לסנן את השימוש בצואה. לאחר מכן, השתמש במדגם משנה של המבחנות המסוננות כדי להשתמש בניסויי התסיסה של תרבות האצווה, ואחסן את השארית ב-80 ° צ' לניתוח נוסף.
הערה: צעדים 4.2 – 4.3 מתנהלים בחדר אנאירובי.
5. תסיסה מחוץ למבחנה
- הוסף שאיפה מסוננים בצואה (500 μL) למדיום התסיסה שהוכן בשלב 3.2 בתוך חדר אנאירובי, ולאחר מכן דגירה ב 37 ° c.
- לאסוף 2 מ ל של דגימות מותסס ב 24 h ו 48 h בחדר אנאירובי ולאחר מכן צנטריפוגה מחוץ לחדר ב 6,000 x g עבור 3 דקות.
- העבירו בקפידה את הסופרנטנים לצינור הצנטריפוגה החדש שישמש לניתוח השפלה רב-סוכר וחומצות שומן קצרות (SCFAs) מדידות.
- לאחסן את צנטריפוגה כדורי ב-80 ° c ולאחר מכן להשתמש להפקת DNA חיידקים גנומית.
6. השפלה EPS על-ידי מיקרוביוטה של צואה אנושית
- טען 0.2 μL של סופרנטנים מותטים על גבי סיליקה ג'ל מצופה מראש-60 לוחות אלומיניום ולאחר מכן יבש באמצעות מייבש שיער.
- לפתח את הצלחות 20 מ ל של חומצה פורמית/n-butanol/מים (6:4:1, v:v: v) פתרון יבש באמצעות מייבש שיער.
- משרים את הצלחות בתוך מגיב orcinol כדי לצבוע, ואז יבש באמצעות מייבש שיער.
- להכין orcinol ריאגנטים על ידי המסת 900 מ"ג של Lichenol ב 25 מ ל של מים מזוקקים ולאחר מכן הוספת 375 mL של אתנול. לאחר מכן, חומצה גופרתית מרוכזת צריך להתווסף לאט והפתרון מעורבב ביסודיות.
- לוחות חום ב120 ° c במשך 3 דקות בתנור אפייה והערכת השפלה של EPS על ידי מדידת להקות האהבה.
7. השפעות EPS על מיקרוביוטה של המעי האנושי
- הקפא הפשרה דגימות צואה המקורי הכין בשלב 4.3 ודגימות מותסס הכין בשלב 5.4.
- לחלץ דנ א חיידקי גנומית (gDNA) מכל הדגימות באמצעות שרפרף בקטריאלי גנטי גנומית ערכת החילוץ בעקבות הוראות היצרן.
- קביעת ריכוזי DNA, integrities, וגודל הפצות באמצעות מיקרו ספקטרוסקופיה ואלקטרופורזה ג'ל אגר.
- התנהלות ה-PCR של גנים rRNA של בקטריאלי 16 מ-gDNA שחולצו באמצעות הבאים תיאר בעבר והפוך התחל12:
-קדימה פריימר (ברקוד פריימר 338F): הוראות
-הפוך פריימר (806R): מהפך
השתמש בתנאי הציקלer התרמיים הבאים:- 94 ° c עבור 5 דקות.
- 94 ° c עבור 30 ס מ.
- 55 ° c עבור 30 ס מ.
- 72 ° c במשך 1 דקות.
- חזור על 2 – 4 עבור 35 מחזורים
- 72 ° c עבור 5 דקות.
- 4 ° c להחזיק עד ההסרה של הציקלאה תרמית.
- ניהול רצף התפוקה הגבוהה של מוצרי ה-PCR בחברה ברצפי DNA באמצעות התפוקה ברמה גבוהה ביותר מיקרוביאלית הקהילה בדיקות.
- השיגו רצפים איכותיים ונקיים בעזרת התובנות הכמותיות לניתוח רצף של מיקרוביאלית (QIIME).
- הגדרת יחידות מיסוי מבצעיות (OTUs) עבור רצפי הגנים של 16S rRNA עם יותר מ-97% נוקלאוטיד דמיון באמצעות כלים ביואינפורמטיקה כגון חבילת התוכנה של מוארתור14.
- בחר רצף מייצג מכל OTU והשתמש במסווג ה-RDP יחד עם מסד הנתונים הטקמי של סילבה כדי לסווג רצפים מייצגים15.
- לחשב כיסוי של טוב, מדדים מגוון אלפא (כולל המדד סימפסון ושאנון), ועושר (מספר נצפה של OTUs) באמצעות כלים בביואינפורמטיקה16.
8. השפעות EPS על הפקת SCFA על ידי מיקרוביוטה המעי האנושי
- הוסיפו סופרנטנים מותטים (1 מ ל) המוכנים בשלב 5.3 עד 2 מנורות צנטריפוגה.
- הוסף 0.2 mL של 25% (w/v) חומצה מטאמזרחנית לכל הדגימות ולערבב ביסודיות את הפתרונות על ידי vortexing.
- צנטריפוגה את התערובות ב 13,000 x g עבור 20 דקות ולהעביר את supernatants כדי צינורות טריים.
- במקביל, להכין פתרונות 120 של propionic mM אצטית, בוטירית, איזווטיריק, חומצות ואלאריק ו isobutyric. אז, להוסיף 1 מ ל של כל חומצה מוכנה ל 1.2 mL של 25% (w/v) חומצה מטורית ולהשתמש כמו קוקטיילים סטנדרטיים.
- מסננים את הדגימות באמצעות קרום μM 0.22.
- זיהוי ריכוזי scfa באמצעות כרומטוגרפיה גז ביצועים גבוהים לפי פרוטוקולים שתוארו בעבר11,17.
הערה: העמודה InertCap FFAP (0.25 mM x 30 m x 0.25 μM) משמש כרומטוגרפיה גז (GC). ריכוזי SCFA מבוססים לאחר מכן על בסיס אזורי שיא באמצעות שיטת התקן הפנימי של נקודה אחת בחבילת התוכנה של הפתרון GC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הייצור של EPS mucoid ניתן לצפות ב -B. longum התרבויות על לוחיות pyg לאחר דגירה אנאירובית עבור 72 h (איור 1a). צנטריפוגה של שריטות התרבות, ואחריו משקעים אתנול וייבוש, הביא את האוסף של תאית כמו EPS (איור 1B). EPS מיובש ועמילן מסיסים שימשו לאחר מכן כמקורות פחמן לתרבויות תסיסה. השימוש ב-oligosaccharide לצורך הפרדה וניתוח טוהר בשל העלות הנמוכה והתוצאות המהירות18. למרות שקצב ההתדרדרות של העמילן על ידי מיקרוביוטה של הצואה האנושית היה מהיר יותר מזה של ביף EPS (איור 2), השפלה ברורה של בדיקות eps מסוג זה נצפתה באופן ברור לגבי דגימות של מספר משוב.
ניתוח של הקהילה באמצעות שנות ה-16 של התפוקה וניתוח הקואורדינטות העיקריות (PCoA) התבצע לאחר מכן כדי לחקור את ההשפעות של ביף EPS על מיקרוביוטה האדם המעיים. דגימות מקבוצות VI_Bif ו-VI_Starch מקובצים בנפרד זה מזה בניתוח PCoA (איור 3A), המציינת כי זמינות EPS ועמילן מבחינה בין קהילות בקטריות בצואה אנושית. גודל אפקט של ניתוח מבדיל ליניארי (LEfSe) היה בשימוש נוסף כדי להבדיל בין הטקציה החיידקית הספציפית שהייתה שונה בין הטיפולים VI_Bif ו-VI_Starch. בדגימות הVI_Bif, שהיו באופן משמעותי יותר בדוגמאות הVI_Starch (איור 3 ב'), הייתה הרבה יותרבשפע מאשר בדגימות הרנטגן. יתר על כן, מדידות GC נעשו עבור מספר SCFAs כדי להעריך את הייצור שלהם בעקבות תוספת של מקורות פחמן שונים. SCFAs אשר נמדדו מתרבויות תסיסה כללה אצטית, propionic, איזווטיריק, בוטירית, isovaleric, חומצות valeric. בעקבות התסיסה 24 h ו 48 h, חמישה מתוך ששת ריכוזי SCFA הנ ל היו דומים בקרב טיפולים ולא מבחינה סטטיסטית שונה בין קבוצות VI_Bif, VI_Starch ו VI. עם זאת, ריכוזי חומצה propionic היו גבוהים באופן משמעותי בקבוצת VI_Bif מאשר בקבוצת VI_Starch (איור 4).
איור 1: EPS המיוצר על ידי B. longum.
B. longum קפואים שוחזר ב Bifidobacterium מרק בינוני ולאחר מכן מתחו על צלחות pyg, ואחריו דגירה אנאירובית ב 37 ° c עבור 72 h (א). ה-EPS שהופק על ידי תרבויות חיידקית הופק מתרביות צלחות, זירז באמצעות אתנול, ומיובש בן לילה באמצעות ואקום מהירות (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ניתוח והשפלה באמצעות מיקרוביוטה של הבטן האנושית.
ניתוח משנת החום נערך על 0.2 μL דגימות שנאספו 24 שעות ו 48 h מכל תרבות תסיסה גדל תחת תנאים אנאירובית. VI, VI_Starch ו VI_Bif מציינים מדיה VI, מדיית VI + עמילן, ו-VI מדיה + EPS, בהתאמה. המספרים 1-12 מצביעים על דגימות חיידקי בצואה מתוך 12 המתנדבים ששימשו לאחסון ניסויי התסיסה. קבוצת הביקורת מייצגת טיפול ללא תוספי פחמן נוספים. דמות זו שונתה מיין ואח '. 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השפעות הזמינות של ביף EPS על קהילות מיקרוביוטה בבטן האדם.
(א) מגרש pcoa של הקהילה מיקרוביוטה הוני מבוסס על ממדד UniFrac משוקלל. (ב) לאחר ניתוח של מטקא בקטריאלי שהיו שופע בקרב קבוצות הטיפול. ניתוק של p < 0.05 שימש להערכת המשמעות הסטטיסטית של הבדלים מטקמיים חיידקיים בין קבוצות. אורי מציין את המעיים של מיקרוביוטה של דגימות צואה המתנדבים. VI_Bif ו VI_Starch מצביעים על המעיים microbiota מתוך דגימות תסיסה באמצעות מדיה VI עם EPS ועמילן כמו מצעים פחמן, בהתאמה. VI מייצגת את קבוצת הבקרה עם מיקרוביוטה מחוסן fermentations בתקשורת VI ללא תוספת של פחמימות אחרות. דמות זו שונתה מיין ואח '. מיכל בן 11 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השפעות זמינות EPS בייצור SCFA לאחר 24 שעות ו48 h של תסיסה.
חומץ, propionic, איזווטיריק, בוטירית, isobutyric, חומצות valeric זוהו באמצעות כרומטוגרפיה גז. VI_Bif, VI_Starch ו-VI מציינים את הדגימות שנאספו לאחר הטיפוח באמצעות VI media + EPS, VI מדיה + עמילן, ו-VI מדיה, בהתאמה. . כל הדגימות נמדדה בטרילקאט הדמויות הופקו באמצעות הגרסה ה5.01 של ה-גרפיפד פריזמה. פאנלים אורגניים מייצגים ריכוזי חומצה אורגנית בתוך כל מדגם מותסס עבור A, חומצה אצטית; B, חומצה propionic; C, חומצה איזובוטירית; D, חומצה בוטירית; E, חומצה isovaleric; ו-F, חומצה valeric. דמות זו משתנה מיין ואח '11אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התקדמות משמעותית נעשתה לקראת הבנה מיקרוביוטה הבטן האנושית הרכב ופעילויות בעשור האחרון. כתוצאה ממחקרים אלה, הושג הולובימונט, המייצג את האינטראקציות בין מחשבים מארחים לבין קהילות מיקרוביאלית הקשורות, כגון בין בני אדם לבין המעיים שלהם מיקרוביוטה19,20. יתר על כן, בני האדם נחשבים כעת גם כיום בתור סופר אורגניזמים21, שבו מיקרוביוטה בטן הוכרה כאחד האיברים הפונקציונליים בבני אדם22,23. הגוף האנושי מארח מערכת אקולוגית מורכבת המורכבת מ-1013 תאים מיקרוביאלית24. יתר על כן, גנום של המעיים microbiota נחשבים הגנום העזר מבני אדם לקודד רבים הקשורים מטבולית גנים הרחיבו את יכולות חילוף החומרים של המארח4. עם זאת, xenobiotics, כולל תרופות טיפוליות תרכובות אקטיביים הנגזרות, יכול לשנות את מבנה הקהילה microbiome בטן ופונקציות משויכות5. מספר גדל והולך של מחקרים הראו כי אינטראקציות בין מיקרוביוטה לבין xenobiotics לשחק תפקידים חשובים ב-תיווך רעילות כימית וגרימת, או אחרת החרפה, מחלות אדם6,7. לפיכך, חקירות של האינטראקציות בין המיקרוביוטיקה לבין מיקרוביוטה בבטן האדם צברה לאחרונה תשומת לב משמעותית במחקר.
מודלים של עכבר היו השיטות הנפוצות ביותר לחקור אינטראקציות בין microbiota ומארחים. עם זאת, הבדלים בקומפוזיציה ובפעילויות בין מיקרוביוטה של בני אדם ועכברים25 עשוי לגרום למידול מספיק של אינטראקציות אנושיות באמצעות מחקרים של עכברים. עם זאת, השיקולים הביואתיים דורשים שימוש מינימלי בעכברים. חלופה לעיל במודלים vivo היא תסיסה האצווה, אשר ניתן להשתמש בו כדי לדמות מיקרוביוטה האדם המעיים בתוך מבחנה26. כתוצאה מכך, נעשה שימוש בניסויי תסיסה כדי לחקור את האינטראקציות בין מיקרוביוטיקה לבין המעי האנושי. לדוגמה, יין ואח '. 17 השתמשו בניסויי החימוץ באצווה כדי לחקור את האינטראקציות בין פוליסכדים לבין מיקרוביוטה בבטן האדם. התוצאות ממחקר זה עולה כי כמה פוליסכרידים יכולים להיות מטבוליזם על ידי מיקרוביוטה הבטן האנושית, ושרב הסוכר לווסת את הקהילה חיידקי האדם מטבוליטים שהם מייצרים בתוך מבחנה, כולל SCFAs. עם זאת, שיקולים מתודולוגיים מסוימים הם קריטיים לשימוש בפרוטוקול זה. לדוגמה, יש לאסוף דגימות צואה בהקדם האפשרי, ולהשתמש בחדר אנאירובי כדי להבטיח את צמיחת הanaerobes. השיקול האחרון הוא קריטי במיוחד, כי חשיפה לחמצן יכול להוביל למותם של כמה אוכלוסיות בקטריאלי בבטן וכך, שינוי של הקהילה החיידקית. בנוסף, מטבוליזם של מערכת העיכול העליונה הוא ביולוגי. כתוצאה מכך, דוגמנות האינטראקציות בין xenobiotics ומערכת העיכול התחתונה microbiota היא שיקול חשוב עבור vivo דוגמנות.
לניסויי התסיסה באצווה יש יתרונות ברורים יותר מאשר במחקרים vivo אנושיים ובעלי חיים, כי הם יותר מבחינה כלכלית ונוחה. יתר על כן, הם יכולים לשמש כדי לחקור וריאציה בין אישית של תגובות מיקרוביוטה האדם הבטן לחשיפה xenobiotic יוטי. יתר על כן, תסיסה אצווה ניתן להחיל בקלות כדי לטפל בקהילות microbiota ולהעריך פונקציות מטבולית הקשורים שלהם. עם זאת, מערכות תסיסה באצווה סובלות ממגבלה של דינמיקת מצב סטטי. החקירות העתידיות יכולות ליישם כימוטסטטיסטיקה ביוריאקטור המאפשרים אפנון דינמי של pH, טמפרטורה, ו הפריסטלזיס, תוך שמירה על אספקה קבועה של חומרים מזינים והסרה רציפה של פסולת. פעילויות כאלה יאפשרו לניסויים לחקות טוב יותר בvivo מעיים ולספק תובנות חדשות להשלמת הניסויים בניסויי החימוץ באצווה. מגבלה נוספת של ניסויים תסיסה אצווה היא כי הם מסירים את כל האינטראקציות מיקרו-מארח הרקמה. זה יכול להיות שיקול חשוב במיוחד, כמו כמה xenobiotics (למשל, מטאמפטמין) יכול להיות שיתוף חילוף החומרים על ידי תאים אנושיים, מיקרוביוטה הבטן27. יתר על כן, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי מטקופת המעיים (GM) יכול בעקיפין לווסת את חילוף החומרים של xenobiotic יוטי באמצעות ויסות גנים מארחים ביטוי תקנה8.
למרות ההתפתחויות של מערכות תסיסה האצווה עדיין נדרשים, מערכות אלה ניתן להשתמש באופן נרחב עבור תפוקה גבוהה והקרנה מהירה של אינטראקציות בין xenobiotics לבין המעיים מיקרוביוטה האדם. הסבר על המנגנונים המשמשים כבסיס להתנגדות האנושית ולחילוף החומרים של מיקרו-התנגדות של האדם הפעיל, יספק תובנות חשובות לווריאציה של המטופל-לחולה הבלתי מוסבר ביעילות התרופות וברעילות8,9. יתר על כן, הבנה מפורטת יותר של האופן שבו דיאטות ורכיבי מזון ספציפיים לשנות מיקרו מטבוליזם וכתוצאה מכך בריאות מארח הוא הצעד הראשון לקראת המטרה של הרפואה אישית באמצעות אפנון microbiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי אינטרסים. הנתונים הצוטטים ביין ואח '. . בסדר, 11
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (No. 31741109), קרן הונאן למדעי הטבע (No. 2018JJ3200), ואת התוכנית לבנות של משמעת אופיינית מיושם באוניברסיטת הונאן של המדע וההנדסה. אנו מודים LetPub (www.letpub.com) על הסיוע הלשוני שלה במהלך הכנת כתב היד הזה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
- Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
- Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
- Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
- Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
- Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
- Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
- Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
- Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
- Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
- Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
- Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
- Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
- Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , giy166 (2018).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
- Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
- Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
- Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
- Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
- Malfertheiner, P., Nardone, G.
- Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
- Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
- Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).
