Summary
Описано здесь протокол для изучения взаимодействия между эндобиотики и кишечника человека микробиоты с использованием in vitro пакетных систем брожения.
Abstract
Микроорганизмы кишечника человека в последнее время стали важной целью исследований в области укрепления здоровья человека и профилактики заболеваний. Следовательно, исследования взаимодействия между эндобиотиками (например, препаратами и пребиотиками) и микрофлорой кишечника стали важной темой исследования. Тем не менее, эксперименты in vivo с человеческими добровольцами не являются идеальными для таких исследований из-за биоэтики и экономических ограничений. В результате, животные модели были использованы для оценки этих взаимодействий in vivo. Тем не менее, исследования моделей на животных по-прежнему ограничены соображениями биоэтики, в дополнение к различным композициям и разнообразию микробиоты у животных по сравнению с людьми. Альтернативной стратегией исследования является использование пакетных экспериментов брожения, которые позволяют оценить взаимодействия между эндобиотиками и кишечной микробиотой in vitro. Для оценки этой стратегии, бифидобактерии (Bif) экзополисахариды (EPS) были использованы в качестве представителя ксенобиотик. Затем взаимодействия между Bif EPS и микрофлорой кишечника человека были исследованы с помощью нескольких методов, таких как тонкослойная хроматография (TLC), бактериальный композиционный анализ сообщества с 16S rRNA гена высокой пропускной способности секвенирования, и газовой хроматографии короткоцепочечных жирных кислот (СКФО). Представлен протокол для изучения взаимодействия между эндобиотики и кишечной микрофлоры кишечника человека с использованием in vitro пакетных ферментации систем. Важно отметить, что этот протокол также может быть изменен для изучения общих взаимодействий между другими эндобиотиками и кишечной микробиотой.
Introduction
Микробиота кишки играет важную роль в функционировании кишечника человека и в здоровье хозяина. Следовательно, кишечная микробиота в последнее время стали важной мишенью для профилактики заболеваний и терапии1. Кроме того, кишечные бактерии взаимодействуют с клетками кишечника и регулируют фундаментальные процессы пребывания, включая метаболическую деятельность, наличие питательных веществ, модуляцию иммунной системы и даже функцию мозга и принятие решений2,3 . Эндобиотики обладают значительным потенциалом для влияния на бактериальный состав и разнообразие кишечной микробиоты. Таким образом, взаимодействие между эндобиотиками и микрофлорой кишечника человека привлекло все большее внимание к исследованиям4,5,6,7,8,9.
Трудно оценить взаимодействие между эндобиотиками и микрофлорой кишечника человека in vivo из-за биоэтики и экономических ограничений. Например, эксперименты, исследующие взаимодействие между эндобиотиками и микрофлорой кишечника человека, не могут быть проведены без разрешения Управления по контролю за продуктами и лекарствами, а набор добровольцев обходится дорого. Следовательно, животные модели часто используются для таких исследований. Тем не менее, использование моделей животных ограничено из-за различных композиций микробиоты и разнообразия в животных против человека связанных общин. Альтернативный метод in vitro для изучения взаимодействий между эндобиотиками и микрофлорой кишечника человека — это использование экспериментов по пакетной культуре.
Экзополисахариды (EPS) являются пребиотиками, которые вносят значительный вклад в поддержание здоровья человека10. Различные EPS, которые состоят из различных моносахаридных композиций и структур могут проявлять различные функции. Предыдущие анализы определили состав Bif EPSs, которые являются репрезентативными ксенобиотами, предназначенными в текущем исследовании11. Однако связанные с хост метаболическими эффектами не были учтены в отношении состава и разнообразия EPS.
В описанном здесь протоколе используется фекальная микробиота от 12 добровольцев для брожения Bif EPS. Тонкослойная хроматография (TLC), ген 16S rRNA высокой пропускной способности секвенирования, и газовая хроматография (ГК) затем используются в комбинации для исследования взаимодействий между ЭПС и микрофлоры кишечника человека. Отличительными преимуществами этого протокола по сравнению с экспериментами in vivo являются его низкая стоимость и избегание вмешательства в обмен веществ хозяина. Кроме того, описанный протокол может быть использован в других исследованиях, которые исследуют взаимодействия между эндобиотиками и микрофлорой кишечника человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол следует руководящим принципам комитета по этике Хунаньского университета науки и инженерии (Хунань, Китай) и Университета Чжэцзян Гуншань (Чжэцзян, Китай).
1. Подготовка бактерий
- Приготовление бифидобактерий среднего бульона
- Смешайте следующие компоненты в 950 мл дистиллированной воды: экстракт мяса, 5 г/л; дрожжевой экстракт, 5 г/л; казеин пептон, 10 г/л; соевого, 5 г/л; глюкоза, 10 г/л; K2HPO4, 2.04 г/l; MgSO47H2O, 0,22 г/л; MnSO4. Н20, 0,05 г/л; NaCl, 5 г/л; Твина 80, 1 мл; соляной раствор, 40 мл (CaCl2.2H2O, 0.25 г/л; KH2PO4, 1 г/л; NaHCO3, 10 г/л; NaCl, 2 г/л); и резазурин, 0,4 мл (2,5 мг/л). Отрегулируйте рН до 6,8 с 2 M NaOH.
- Автоклав при температуре 121 градусов по Цельсию в течение 15 мин и дайте бульону остыть до комнатной температуры (RT) при анаэробных условиях (10% Н2,10% CO2,80% N2). Добавьте к среде фильтрованные цистеин-HCl (0,5 г/л) и мупироцин (5 мг/л).
- Добавьте аликот (50 л) замороженного Бифидобактерии в культурную трубку с 5 мл бифидобактерий среднего бульона в анаэробных условиях, затем культуру в анаэробном инкубаторе на 24 ч при 37 градусах Цельсия.
2. Подготовка бифидобактериальных EPS
- Подготовка PYG агар-среды
- Смешайте следующее: пептон, 20 г/л; дрожжевой экстракт, 10 г/л; глюкоза, 5 г/л; NaCl, 0.08 г/л; CaCl2, 0.008 г/л; MgSO47H2O, 0,008 г/л; K2HPO4, 0.04 г/l; KH2PO4, 0.04 г/l; NaHCO3, 0,4 г/л; агар, 12 г/л. Отрегулируйте рН до 7,2 с помощью 10 М НаОХ.
- Автоклав средств массовой информации при 121 градусах по Цельсию в течение 15 мин и охладить до 50 градусов по Цельсию. Затем, на 1 л среднего, добавить 0,5 мл фильтр-стерилизованного витамина K1 раствор (1 г витамина К1 растворенный в 99 мл 99% этанола), 5 мл раствора гемина (0,5 г гемина, растворенного в 1 мл 1 мл/л NaOH , затем доведено до 100 мл с дистиллированной водой, и 0,5 г цистеина-HCl.
- Перед заливкой пластин PYG добавьте в среду фильтр-стерилизованный 5-бромо-4-хлоро-3-индорил к-Д-галактопиранозид (X-Gal, 0,06 г/л), LiCl'3H2O (5,7 г/л) и мопироцин (5 мг/л).
ПРИМЕЧАНИЕ: X-Gal и LiCl.3H2O позволяют идентифицировать колонии B. longum на плитах через изменения окраски.
- Прививать 20 зл b. longum штаммов (шаг 1.2) к PYG пластин и поместить в анаэробный инкубатор при 37 градусах по Цельсию для 72 ч.
- Соберите слизистые бактериальные колонии из пластин PYG с помощью взвешивания совок, а затем полностью resuspend в 10 мл фосфат-буфера солей (PBS) с помощью вихря осциллятор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальные и EPS смеси должны быть полностью приостановлены вихрем или пипетки вверх и вниз неоднократно, пока волокна полностью растворяются в PBS. - Centrifuge подвески на 6000 х г в течение 5 мин.
- Тщательно перенесите супернационты в новую центрифугу и полностью перемешайте с тремя томами холодного 99% этанола путем повторной инверсии и смешивания.
- Centrifuge смесь на 6000 х г в течение 5 мин и полностью удалить супернациантов.
- Удалите осадки из центрифуговых трубок путем соскабливания и сушки экстрактов EPS на ночь с помощью вакуума скорости.
3. Подготовка ферментации среды
- Подготовка базовой культуры среднего VI
- Смешайте следующее: пептон, 3 г/л; триптон, 3 г/л; дрожжевой экстракт, 4,5 г/л; муцин, 0,5 г/л; желчные соли No 3, 0,4 г/л; Накл, 4,5 г/л; КЛ, 2,5 г/л; MgCl2No6H2O, 4,5 г/л; 1 мл Tween 80; CaCl2.6H2O, 0.2 g/l; KH2PO4, 0,4 г/л; MgSO4No7H2O, 3.0 г/л; MnCl2No4H2O, 0,32 г/л; FeSO47H2O, 0,1 г/л; CoSO47H2O, 0,18 г/л; CaCl22H2O, 0,1 г/л; NSO4No7H2O, 0,18 г/л; CuSO4No5H2O, 0,01 г/л; и NiCl2No6H2O, 0,092 г/л. Отрегулируйте рН до 6,5 с 1 М HCl.
- Приготовьте гемин и цистеин, как это делается в разделе 2.1 и добавить после автоматического и охлаждения.
- Подготовьте культурные носители, содержащие различные источники углерода, с помощью носителя VI базы. Перед автоклавированием добавьте 8 г/л волокон Bif EPS в средний VI, состоящий из группы ВИЗБиф. Кроме того, добавьте 8 г/л крахмала к среднему VI, чтобы представлять группу ВИЗ крахмал. Наконец, средний VI без добавления источника углерода используется в качестве элемента управления (группа VI).
ПРИМЕЧАНИЕ: Bif EPS и крахмал сначала растворяются в горячей воде с помощью магнитного агитатора, а затем смешиваются с подготовленным VI средой. - Автоклав все носители при 121 градусов по Цельсию в течение 15 минут и дайте охладиться на RT.
- Передача подобразца (5 мл) каждой среды в культуры труб в анаэробных инкубатор, и хранить оставшиеся носители на 4 кв. c.
4. Подготовка образца фекального образца человека
- Соберите свежие образцы фекалий сразу же после свежей дефекации от здоровых взрослых добровольцев человека с помощью кала контейнеры, а затем использовать для подготовки шлама.
ПРИМЕЧАНИЕ: До сбора образцов, все добровольцы должны быть проверены, чтобы обеспечить не прием антибиотиков, пробиотиков или пребиотических методов лечения, по крайней мере 3 месяца до пожертвование образцов. Кроме того, все доноры должны предоставить информированное письменное согласие. - Перенесите свежий фекальный образец (1 г) до 10 мл от 0,1 м анаэробных PBS (pH 7.0) в стеклянные стаканы, а затем используйте стеклянные стержни для приготовления 10% (w/v) шлама.
- Используйте сито 0,4 мМ для фильтрации фекальной суспензии. Затем используйте подобразие фильтрованной суспензии для проведения экспериментов по брожению парочной культуры, а оставшуюся часть хранится при -80 градусов по Цельсию для дальнейшего анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.2-4.3 проводятся в анаэробной камере.
5. Брожение партии in vitro
- Добавьте отфильтрованную фекальную суспензию (500 кв.м), к среде брожения, приготовленной в шаге 3.2 в анаэробной камере, затем инкубацию при 37 градусах Цельсия.
- Соберите 2 мл ферментированных образцов при 24 ч и 48 ч в анаэробной камере, а затем центрифуге за пределами камеры при 6000 х г в течение 3 мин.
- Тщательно перенесите супернационты в новую центрифугу, которая будет использоваться для анализа полисахаридной деградации и короткоцепочечных жирных кислот (СКФА).
- Храните центрифугивальные гранулы при -80 градусах Цельсия и впоследствии используйте для экстракции геномной ДНК бактериальной.
6. Деградация EPS человеческой фекальной микробиотой
- Загрузите 0,2 л ферментированных супернатантов на предварительно покрытые кремнезема гель-60 TLC алюминиевые пластины, а затем высушить с помощью сушилки для волос.
- Разработка пластин в 20 мл раствора для формичной кислоты/н-бутанола/воды (6:4:1, v:v:v) и высушите с помощью сушилки для волос.
- Замочите пластины в реагент орцинола красить, а затем высушить с помощью сушилки для волос.
- Подготовка реагентов орцинола путем растворения 900 мг лихенола в 25 мл дистиллированной воды, а затем добавить 375 мл этанола. Впоследствии концентрированную серную кислоту следует медленно добавлять и тщательно смешивать раствор.
- Нагрейте пластины при температуре 120 градусов по Цельсию в течение 3 мин в печи для выпечки и оценить деградацию EPS путем измерения полос TLC.
7. Влияние EPS на кишечную микробиоту кишечника человека
- Заморозка-оттепель оригинальные фекальные образцы, подготовленные в шаге 4.3 и ферментированных образцов, подготовленных в шаге 5.4.
- Извлеките бактериальную геномную ДНК (gDNA) из всех образцов с помощью комплекта для удаления геномной геномной ДНК стула в соответствии с инструкциями производителя.
- Определить концентрации ДНК, его цельности и распределение размеров с помощью микроспектрофотометра и электрофорасиса агар-геля.
- Проведение ПЦР бактериальных генов 16S rRNA из извлеченных гДНК с использованием следующих ранее описанных вперед и обратных грунтовок12:
-форвард праймер (штрих-код грунт 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
-Обратная грунтовка (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Используйте следующие условия теплового цикла:- 94 кК в течение 5 мин.
- 94 градуса по Цельсию на 30 с.
- 55 градусов по Цельсию на 30 с.
- 72 кК в течение 1 мин.
- Повторите 2-4 для 35 циклов
- 72 кК в течение 5 мин.
- 4 градуса по Цельсию удерживайте до снятия с теплового велосипедиста.
- Проведение высокой пропускной способности продуктов ПЦР в компании по секвенированию ДНК с использованием ультра-высокой пропускной способности микробного анализа сообщества.
- Получить чистые, высококачественные последовательности с помощью количественных исследования в микробной экологии (ЦИИМЕ) последовательности анализа трубопровода13.
- Определите операционные таксономические единицы (OTUs) для 16S rRNA генных последовательностей с более чем 97% нуклеотидного сходства с помощью биоинформатики инструментов, таких как Mothur программного обеспечения Suite14.
- Выберите репрезентативную последовательность из каждого OTU и используйте классификатор RDP вместе с таксономической базой данных SILVA для классификации репрезентативных последовательностей15.
- Рассчитайте охват Гуда, альфа-метрики разнообразия (включая индекс Симпсона и Шеннона) и богатство (наблюдаемое количество OTUs) с помощью инструментов биоинформатики16.
8. Влияние EPS на производство SCFA кишечной микробиотой человека
- Добавьте ферментированные супернацианты (1 мл), приготовленные в ступенчатые центрифуги от 5,3 до 2 мл.
- Добавьте 0,2 мл 25% метафосфорной кислоты в каждый из образцов и тщательно перемешайте растворы путем вихря.
- Centrifuge смеси на 13000 х г в течение 20 минут и передать супернационты на свежие трубки.
- Одновременно, подготовить решения 120 мМ уксусных, пропионических, бутидровых, изобутырикных, валериковых и изовалеральных кислот. Затем добавьте 1 мл каждой подготовленной кислоты до 1,2 мл 25% метафосфорной кислоты и используйте в качестве стандартных коктейлей.
- Фильтр улики образцов с помощью мембраны 0,22 мкм.
- Обнаружение концентраций SCFA с использованием высокопроизводительной газовой хроматографии в соответствии с ранее описанными протоколами11,17.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для газовой хроматографии (ГК) используется колонка InertCap FFAP (0,25 мМ х 30 м х 0,25 мкм). Затем концентрации SCFA количественно очисляются на основе пиковых областей с использованием одноточечного внутреннего стандартного метода в пакете программного обеспечения GC Solution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Производство слизистой ОБОЛОЧКи может наблюдаться в B. longum культур на PYG пластин после анаэробной инкубации для 72 ч (рисунок1A). Центрифугация культуры царапин, а затем этанола осадков и высыхания, привело к сбору целлюлозы, как EPS (Рисунок 1B). Сушеные EPS и растворимый крахмал затем использовались в качестве источников углерода для культур брожения. TLC был использован для олигосахарида разделения и анализа чистоты из-за его низкой стоимости и быстрых результатов оборота18. Хотя уровень деградации крахмала в результате микрофлоры фекалий человека был быстрее, чем у Bif EPS(рисунок2), деградация Bif EPS была четко отмечена в некоторых образцах, привитых В ЭПС.
Сообщество композиционного анализа с помощью 16S rRNA гена высокой пропускной способности секвенирования и основной анализ координат (PCoA) затем был выполнен для исследования влияния BIF EPS на микрофлору кишечника человека. Образцы из групп VI'Bif и VI'Starch группируются отдельно друг от друга в анализе PCoA(рисунок 3A), что указывает на то, что EPS и наличие крахмала диффереприметично формируют человеческие фекальные бактериальные сообщества. Для различения специфических бактериальных таксонов, отличаемых между методами лечения ВИЗБифа и ВИЗкраха, был также использован линейный дискриминационный анализ эффекта (LEfSe). Род Коллинселла, Coprococcus, Парабактериоиды, и Rhodopseudomonas были значительно более обильными в VI'Bif образцов, чем в VI'Starch образцов (Рисунок 3B). Кроме того, были проведены измерения ГК для нескольких СКФА для оценки их производства после добавления различных источников углерода. SCFAs, которые были измерены из культур брожения включены уксусные, пропионические, изобутырные, бутырные, изовалерические и валериковые кислоты. После брожения в течение 24 ч и 48 ч, пять из шести вышеупомянутых концентраций SCFA были одинаковыми среди методов лечения и статистически не отличались между группами ВИЗБиф, ВИЗ-Крахх и VI. Тем не менее, концентрации пропионовой кислоты были значительно выше в группе ВИЗБиф, чем в группе ВИзкрах(рисунок 4).
Рисунок 1: EPS производства B. longum.
Замороженные B. longum был восстановлен в Бифидобактерии средний бульон, а затем полосатый на PYG пластин, а затем анаэробной инкубации при 37 кв. м на 72 ч (A). EPS производства бактериальных культур были Царапины из пластины культур, осаждали с помощью этанола, и высушили на ночь с помощью вакуума скорости (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: TLC анализ in vitro EPS и деградации крахмала микробиотой кишечника человека.
Анализ ТЛК был проведен на образцах 0,2 л, собранных при 24 ч и 48 ч с каждой культуры брожения, выращенных в анаэробных условиях. VI, VI'Starch, и VI'Bif указывают VI средства массовой информации, VI СМИ и крахмала дополнения, и VI сми epS дополнения, соответственно. Цифры 1-12 указывают на фекальные бактериальные образцы из 12 добровольцев, которые были использованы для прививок ферментации экспериментов. Контрольная группа представляет лечение без дополнительных углеродных добавок. Эта цифра изменена из Инь и др. 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Влияние доступности Bif EPS на сообщества микробиоты кишечника человека.
(A) PCoA участок кишечника микробиоты сообщества композиционных различий на основе unweighted UniFrac метрики. (B) LEfSE анализ бактериальных таксонов, которые были дифференимно обильные среди групп лечения. Для оценки статистической значимости бактериальных таксономических различий между группами использовалось отсечение p qlt; 0,05. Ори указывает на кишечную микробиоту добровольных фекальных образцов. ВИзбиф и ВИЗ Крахмал указывают на микрофлору кишечника из образцов брожения с использованием VI носителей с EPS и крахмалом в качестве углеродных субстратов, соответственно. VI представляет контрольную группу с кишечной микробиотой, привитойной ферментацией в VI носителях без добавок других углеводов. Эта цифра изменена из Инь и др. 11 Год Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Влияние наличия EPS на производство SCFA после 24 ч и 48 ч брожения.
С помощью газовой хроматографии были обнаружены ацетические, пропионические, изобутырикные, изовалерические и валериальные кислоты. ВИЗБиф, ВИЗ Крахмал и VI указывают на образцы, которые были собраны после культивирования с помощью VI носителей - EPS, VI носителей крахмала и VI носителей, соответственно. Все образцы были измерены в тройном. Цифры были созданы с помощью GraphPad Prism Version 5.01. Панели представляют концентрации органических кислот в каждом ферментированном образце для А, уксусной кислоты; В, пропионовая кислота; C, изобутиновая кислота; D, бутийная кислота; E, изовалеральная кислота; и F, валериановая кислота. Эта цифра изменена из Yin et al.11Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
За последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в понимании состава и деятельности микрофлоры кишечника человека. Как следствие этих исследований, концепция голобиона возникла, которая представляет собой взаимодействие между хостом и связанных с ними микробных сообществ, таких как между людьми и их кишечной микробиоты19,20. Кроме того, люди даже в настоящее время рассматривается как суперорганизмы21, в котором кишечная микробиота были признаны в качестве одного из функциональных органов в организме человека22,23. Человеческое тело содержит сложную микробную экосистему, состоящую примерно из 1013 микробных клеток24. Кроме того, геномы кишечной микробиоты считаются вспомогательными геномами людей, которые кодируют многочисленныеметаболические гены, которые расширяют метаболические возможности хозяина 4. Тем не менее, ксенобиотики, в том числе терапевтические препараты и производные от диеты биологически активных соединений, потенциально может изменить структуру микрофлоры кишечника и связанные с ними функции5. Все большее число исследований показали, что взаимодействия между кишечной микробиоты и ксенобиотики играют важную роль в посредничестве химической токсичности и вызывая, или иным образом усугубляя, болезни человека6,7. Таким образом, исследования взаимодействий между ксенобиотиками и микрофлорой кишечника человека в последнее время привлекли значительное внимание к исследованиям.
Мышимодели были наиболее широко используемыми методами для исследования взаимодействия между микробиотой и хостами. Однако различия в составе и деятельности между кишечной микробиотой человека и мышей25 могут привести к неадекватному моделированию человеческих взаимодействий с помощью исследований мышей. Тем не менее, соображения биоэтики требуют минимального использования мышей. Альтернативой вышеуказанным моделям in vivo является пакетное брожение, которое может быть использовано для имитации микрофлоры кишечника человека in vitro26. Следовательно, эксперименты по брожению были использованы для исследования взаимодействия между ксенобиотики и микрофлоры кишечника человека. Например, Инь и др. 17 использовали пакетные эксперименты по брожению для исследования взаимодействия полисахаридов и микробиоты кишечника человека. Результаты этого исследования показывают, что некоторые полисахариды могут быть метаболизируется микробиоты кишечника человека, и что полисахариды модулировать человеческого бактериального сообщества и метаболитов, которые они производят в пробирке, в том числе SCFAs. Однако некоторые методологические соображения имеют решающее значение для использования этого протокола. Например, фекальные пробы должны быть собраны как можно скорее, и анаэробная камера должна быть использована для обеспечения роста облиратных анаэробов. Последнее соображение особенно важно, потому что воздействие кислорода может привести к смерти некоторых кишечных бактериальных популяций и, таким образом, изменение бактериального сообщества. Кроме того, ксенобиотики метаболизируется в верхней пищеварительной системе. Следовательно, моделирование взаимодействий между ксенобиотиками и микрофлорой нижней пищеварительной системы является важным фактором для моделирования in vivo.
Эксперименты по брожению партии имеют явные преимущества перед исследованиями в vivo для человека и животных, поскольку они более экономически осуществимы и удобны. Кроме того, они могут быть использованы для исследования межиндивидуальных вариаций реакции микрофлоры кишечника человека на воздействие ксенобиотики. Кроме того, пакетное брожение может быть легко применено для манипулирования микробиотами и оценки связанных с ними метаболических функций. Однако системы брожения пакетов страдают от ограничения статической динамики состояния. Будущие исследования могут привести к реализации биореакторных хеммостатов, которые позволяют динамическую модуляцию рН, температуры и перистальтиса, сохраняя при этом стабильный запас питательных веществ и непрерывное удаление отходов. Такая деятельность позволит экспериментам лучше имитировать in vivo кишечные тракты и предоставить новые идеи, чтобы дополнить тех, от пакетных экспериментов брожения. Дополнительным ограничением пакетных экспериментов по брожению является то, что они удаляют все взаимодействия тканей микробиома-хозяина. Это может быть особенно важным соображением, так как некоторые ксенобиотики (например, метамфетамин) могут быть совместно метаболизируется человеческими клетками и кишечной микробиотой27. Кроме того, недавние исследования показали, что метагеном кишечника (ГМ) может косвеннорегулировать кенобиотический метаболизм с помощью регулирования регуляции экспрессии генов хозяина 8.
Хотя по-прежнему необходимы разработки систем брожения партий, эти системы могут широко использоваться для высокой пропускной записи и быстрого скрининга взаимодействий между ксенобиотиками и микробиотой кишечника человека. Выяснение механизмов, лежащих в основе ксенобиотической устойчивости и метаболизма в активных микробиомах кишечника человека обеспечит важную информацию о необъяснимых пациента к пациенту изменения эффективности и токсичности8,9. Кроме того, более подробное понимание того, как диеты и конкретные пищевые компоненты изменяют микробный метаболизм и, следовательно, эффект здоровья хозяина является первым шагом на пути к реализации цели персонализированной медицины с помощью модуляции микробиоты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов. Цифры были приведены в Инь и др. 11.
Acknowledgments
Это исследование было профинансировано Национальным фондом естественных наук Китая (No 31741109), Фондом естественных наук Хунаня (No 2018JJ3200), а также программой строительства прикладной характерной дисциплины в Хунаньском университете науки и техники. Мы благодарим LetPub (www.letpub.com) за лингвистическую помощь в подготовке этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
- Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
- Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
- Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
- Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
- Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
- Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
- Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
- Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
- Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
- Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
- Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
- Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
- Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , giy166 (2018).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
- Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
- Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
- Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
- Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
- Malfertheiner, P., Nardone, G.
- Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
- Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
- Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).
