Summary
Descrito aqui é um protocolo para investigar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana usando sistemas in vitro de fermentação em lote.
Abstract
Os microrganismos intestinais humanos tornaram-se recentemente um importante alvo de pesquisa na promoção da saúde humana e prevenção de doenças. Conseqüentemente, investigações de interações entre endobióticos (por exemplo, drogas e prebióticos) e microbiota intestinal tornaram-se um importante tópico de pesquisa. No entanto, experimentos in vivo com voluntários humanos não são ideais para tais estudos devido à bioética e restrições econômicas. Como resultado, modelos animais têm sido utilizados para avaliar essas interações in vivo. No entanto, estudos de modelos animais ainda são limitados por considerações de Bioética, além de diferentes composições e diversidades de microbiota em animais versus humanos. Uma estratégia de pesquisa alternativa é o uso de experimentos de fermentação em lote que permitam a avaliação das interações entre endobióticos e microbiota intestinal in vitro. Para avaliar esta estratégia, os exopolissacarídeos bifidobacterianos (bif) (EPS) foram usados como um xenobiótico representativo. Em seguida, as interações entre bif EPS e microbiota intestinal humana foram investigadas usando vários métodos, tais como cromatografia em camada delgada (TLC), análise composicional da comunidade bacteriana com sequenciamento de alto rendimento do gene 16S rRNA e cromatografia gasosa de ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs). Aqui apresentamos um protocolo para investigar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana utilizando sistemas de fermentação em lote in vitro. É importante ressaltar que este protocolo também pode ser modificado para investigar interações gerais entre outros endobióticos e microbiota intestinal.
Introduction
A microbiota intestinal desempenha um papel importante no funcionamento dos intestinos humanos e na saúde do hospedeiro. Consequentemente, a microbiota intestinal tornou-se recentemente um importante alvo para a prevenção e terapia da doença1. Além disso, as bactérias do intestino interagem com as células intestinais do hospedeiro e regulam os processos de acolhimento fundamentais, incluindo atividades metabólicas, disponibilidades de nutrientes, modulação do sistema imunológico e até mesmo função cerebral e tomada de decisão2,3 . Os endobióticos têm um potencial considerável para influenciar a composição bacteriana e a diversidade da microbiota intestinal. Assim, as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana têm atraído a atenção crescente da pesquisa4,5,6,7,8,9.
É difícil avaliar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana in vivo devido à bioética e restrições econômicas. Por exemplo, experimentos que investigam as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana não podem ser realizados sem a permissão da administração de alimentos e drogas, e o recrutamento de voluntários é caro. Conseqüentemente, os modelos animais são usados frequentemente para tais investigações. No entanto, o uso de modelos animais é limitado devido a diferentes composições de microbiota e diversidade em comunidades animais vs. humanas associadas. Um método alternativo in vitro para explorar as interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana é através do uso de experimentos de cultura de lotes.
Os exopolissacarídeos (EPSs) são prebióticos que contribuem significativamente para a manutenção da saúde humana10. Os EPSS distintos que consistem em composições e em estruturas diferentes do monossacarídeos podem expor funções distintas. As análises prévias determinaram a composição de BIF EPSs, que são o xenobiótico representativo apontado no estudo atual11. No entanto, os efeitos metabólicos associados ao hospedeiro não foram considerados em relação à composição e diversidade do EPS.
O protocolo descrito aqui usa a microbiota fecal de 12 voluntários para fermentar bif EPSs. A cromatografia de camada fina (TLC), o sequenciamento do gene 16S rRNA de alta taxa de transferência e a cromatografia gasosa (GC) são então usadas em combinação para investigar as interações entre EPSs e microbiota intestinal humana. As vantagens distintas deste protocolo em comparação com experimentos in vivo são seu baixo custo e evitação de efeitos interferentes do metabolismo do hospedeiro. Além disso, o protocolo descrito pode ser utilizado em outros estudos que investiguem interações entre endobióticos e microbiota intestinal humana.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este protocolo segue as directrizes do Comitê de éticas da Universidade de Hunan da ciência e da engenharia (Hunan, China), e da Universidade de Zhejiang GongShang (Zhejiang, China).
1. preparação de bactérias
- Preparação do caldo médio Bifidobacterium
- Combine os seguintes componentes em 950 mL de água destilada: extrato de carne, 5 g/L; extrato de levedura, 5 g/L; peptona de caseína, 10 g/L; soytone, 5 g/L; glicose, 10 g/L; K2HPO4, 2, 4 g/L; MgSO4· 7h2O, 0,22 g/L; MnSO4. H20, 0, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; Tween 80, 1 mL; solução salina, 40 mL (CaCl2. 2h2O, 0,25 g/L; KH2po4, 1 g/L; NaHCO3, 10 g/L; NaCl, 2 g/L); e resazurina, 0,4 mL (2,5 mg/L). Ajuste o pH a 6,8 com NaOH de 2 M.
- Autoclave a 121 ° c por 15 min e permitir que o caldo esfrie até a temperatura ambiente (RT) em condições anaeróbias (10% H2, 10% co2, 80% N2). Adicionar filtro-esterilizado cysteine-HCl (0,5 g/L) e mupirocina (5 mg/L) para o meio.
- Adicionar uma alíquota (50 μL) de Bifidobacterium longum congelado a um tubo de cultura com 5 ml de caldo médio Bifidobacterium em condições anaeróbias, em seguida, cultura em uma incubadora anaeróbia para 24 h a 37 ° c.
2. preparação de EPSs bifidobacterianos
- Preparação do meio de agar PYG
- Combine o seguinte: peptona, 20 g/L; extrato de levedura, 10 g/L; glicose, 5 g/L; NaCl, 0, 8 g/L; CaCl2, 0, 8 g/L; MgSO4· 7h2O, 0, 8 g/L; K2HPO4, 0, 4 g/L; KH2po4, 0, 4 g/L; NaHCO3, 0,4 g/L; Agar, 12 g/L. Ajuste o pH para 7,2 usando NaOH de 10 M.
- Autoclave a mídia em 121 ° c por 15 min e arrefecer a ~ 50 ° c. Em seguida, por 1 L de meio, adicione 0,5 mL de solução de vitamina K1 com filtro esterilizado (1 g de vitamina k1 dissolvida em 99 mL de etanol a 99%), 5 ml de solução de hemina (0,5 g de hemina dissolvida em 1 ml de NaOH 1 mol/L , em seguida, trouxe até 100 mL com água destilada), e 0,5 g de cisteína-HCl.
- Antes de derramar as placas PYG, Adicionar filtro-esterilizado 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-GAL, 0, 6 g/L), LiCl · 3H2o (5,7 g/l) e mupirocina (5 mg/l) para o meio.
Nota: X-GAL e LiCl. 3H2o permitem a identificação de colônias de B. longum em placas através de alterações de coloração.
- Inocular 20 μL de estirpes de B. longum (passo 1,2) para placas de PYG e colocar numa incubadora anaeróbia a 37 ° c por 72 h.
- Colete colônias bacterianas mucoides das placas PYG usando uma colher de pesagem e, em seguida, Ressuspender completamente em 10 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) usando um oscilador vortex.
Nota: as misturas bacterianas e EPS devem ser rerespirados completamente por vortexing ou pipetagem para cima e para baixo repetidamente até que as fibras sejam completamente dissolvidas em PBS. - Centrifugar a suspensão a 6.000 x g durante 5 min.
- Transfira cuidadosamente os sobrenadantes para um novo tubo de centrifugação e misture completamente com três volumes de etanol 99% frio por inversão repetida e mistura.
- Centrifugue a mistura a 6.000 x g durante 5 min e retire completamente os sobrenadantes.
- Remova os precipitados dos tubos de centrifugação raspando e secando os extratos do EPS durante a noite usando um vácuo da velocidade.
3. preparação do meio de fermentação
- Preparação do meio de cultura básico VI
- Combine o seguinte: peptona, 3 g/L; triptona, 3 g/L; extrato de levedura, 4,5 g/L; mucin, 0,5 g/L; sais biliares n º 3, 0,4 g/L; NaCl, 4,5 g/L; KCl, 2,5 g/L; MgCl2· 6h2O, 4,5 g/L; 1 mL de Tween 80; CaCl2. 6h2O, 0,2 g/L; KH2po4, 0,4 g/L; MgSO4· 7h2O, 3,0 g/L; MnCl2· 4h2O, 0,32 g/L; FeSO4· 7H2O, 0,1 g/L; CoSO4· 7h2O, 0,18 g/L; CaCl2· 2h2O, 0,1 g/L; ZnSO4· 7h2O, 0,18 g/L; CuSO4· 5h2O, 0, 1 g/L; e NiCl2· 6h2o, 0, 92 g/L. ajustar o pH para 6,5 com 1 M HCL.
- Prepare o haemin e o cisteína como feito na seção 2,1 e adicione após o autoclavagem e refrigerar.
- Prepare mídia de cultura que contenha diferentes fontes de carbono com uma mídia base VI. Antes da autoclavagem, adicione 8 g/L de fibras de BIF EPS ao VI médio, compreendendo o grupo VI_Bif. Além disso, adicione 8 g/L de amido ao meio VI para representar o grupo VI_Starch. Finalmente, o VI médio sem adição de uma fonte de carbono é usado como o controle (grupo VI).
Nota: o bif EPS e o amido são dissolvidos primeiramente na água quente usando um agitador magnético, misturado então com o meio preparado de VI. - Autoclave todos os meios a 121 ° c por 15 min e permitem esfriar a RT.
- Transfira uma subamostra (5 mL) de cada meio para tubos de cultura em uma incubadora anaeróbia e armazene os suportes restantes a 4 ° c.
4. preparação fecal humana da amostra
- Colete amostras fecais frescas imediatamente após a defecação fresca de voluntários humanos adultos saudáveis usando recipientes de fezes e, subsequentemente, use para preparação de chorume.
Nota: antes da coleta da amostra, todos os voluntários devem ser rastreados para garantir a não recepção de antibióticos, probióticos ou tratamentos prebióticos por pelo menos 3 meses antes de doar amostras. Além disso, todos os doadores devem fornecer consentimento informado e por escrito. - Transfira uma amostra fecal fresca (1 g) a 10 mL do PBS anaeróbio de 0,1 M (pH 7,0) em copos de vidro, a seguir use as hastes de vidro para preparar uma pasta de 10% (w/v).
- Use uma peneira de 0,4 mM para filtrar a pasta fecal. Em seguida, use uma subamostra da pasta filtrada para inocular experimentos de fermentação de cultura em lote e armazene o restante em-80 ° c para análises adicionais.
Nota: as etapas 4.2 – 4.3 são conduzidas em uma câmara anaeróbia.
5. fermentação em lote in vitro
- Adicionar pasta fecal filtrada (500 μL) ao meio de fermentação preparado na etapa 3,2 dentro de uma câmara anaeróbia, em seguida, incubar a 37 ° c.
- Colete 2 mL de amostras fermentadas a 24 h e 48 h na câmara anaeróbia e depois Centrifugue fora da câmara a 6.000 x g durante 3 min.
- Transfira com cuidado os sobrenadantes a um tubo de centrifugação novo que seja usado para a análise da degradação do polissacarídeo e as medidas dos ácidos gordos da curto-corrente (scfas).
- Armazene as pelotas da centrifugação em-80 ° c e use subseqüentemente para a extração genomic bacteriana do ADN.
6. degradação do EPS pela microbiota fecal humana
- Carregue 0,2 μL de sobrenadantes fermentados em placas de alumínio pré-revestidas de sílica gel-60 TLC e seque com um secador de cabelo.
- Desenvolver as placas em 20 mL de um ácido fórmico/n-butanol/água (6:4:1, v:v: v) solução e secar usando um secador de cabelo.
- Mergulhe as placas no reagente de orcinol para tingir, em seguida, seque usando um secador de cabelo.
- Prepare reagentes de orcinol dissolvendo 900 mg de Lichenol em 25 mL de água destilada, acrescentando 375 mL de etanol. Subsequentemente, o ácido sulfúrico concentrado deve ser lentamente adicionado e a solução completamente misturada.
- Placas de calor a 120 ° c por 3 min em um forno de cozimento e avaliar a degradação do EPS através da medição de bandas TLC.
7. efeitos do EPS na microbiota intestinal humana
- Congelar-degelo as amostras fecais originais preparadas na etapa 4,3 e amostras fermentadas preparadas na etapa 5,4.
- Extraia o ADN genomic bacteriano (gDNA) de todas as amostras usando um jogo genomic bacteriano da extração do ADN do tamborete que segue as instruções do fabricante.
- Determine as concentrações de DNA, integridades e distribuições de tamanho usando um microespectrofotômetro e eletroforese em gel de agar.
- Conduza o PCR de genes bacterianos do rRNA 16S do gDNA extraído usando os seguintes primers para diante e reversos previamente descritos12:
-primer Forward (código de barras primer 338F): ACTCCTACGGGAGGCAGCA
-primer reverso (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
Use as seguintes condições de ciclador térmico:- 94 ° c por 5 min.
- 94 ° c por 30 s.
- 55 ° c por 30 s.
- 72 ° c por 1 min.
- Repita 2 – 4 para 35 ciclos
- 72 ° c por 5 min.
- 4 ° c segure até a remoção do termociclador.
- Conduza o sequenciamento de alta produtividade de produtos de PCR em uma empresa de sequenciamento de DNA usando análise de comunidade microbiana de alto débito.
- Obtenha sequências limpas e de alta qualidade usando o pipeline de análise quantitativa de insights quantitativos em ecologia microbiana (QIIME)13.
- Definir unidades taxonômicas operacionais (OTUs) para sequências de genes rRNA 16S com maior que 97% de similaridade de nucleotídeo utilizando ferramentas de Bioinformática como o Mothur Software Suite14.
- Escolha uma sequência representativa de cada OTU e use o classificador RDP junto com o banco de dados taxonômico SILVA para classificar as sequências representativas15.
- Calcule a cobertura de Good, as métricas de diversidade alfa (incluindo o índice de Simpson e Shannon) e a riqueza (número observado de OTUs) usando as ferramentas de Bioinformática16.
8. efeitos do EPS na produção de SCFA por microbiota intestinal humana
- Adicionar sobrenadantes fermentados (1 mL) preparados na etapa 5,3 a 2 mL de tubos de centrifugação.
- Adicione 0,2 mL de ácido metaposfórico a 25% (p/v) a cada uma das amostras e misture cuidadosamente as soluções por vortexing.
- Centrifugue as misturas a 13.000 x g durante 20 min e transfira os sobrenadantes para tubos frescos.
- Concomitantemente, prepare soluções de 120 mM de ácido acético, propiônico, butírico, isobutírico, valérico e isovalérico. Em seguida, adicione 1 mL de cada ácido preparado a 1,2 mL de ácido metaposfórico a 25% (p/v) e utilize como cocktails padrão.
- Filtre as amostras usando uma membrana de 0,22 μM.
- Detecte concentrações de scfa utilizando cromatografia gasosa de alta performance de acordo com os protocolos descritos anteriormente11,17.
Nota: uma coluna de InertCap FFAP (0,25 mM x 30 m x 0,25 μM) é utilizada para cromatografia gasosa (GC). As concentrações de SCFA são então quantificadas com base em áreas de pico usando o método padrão interno de ponto único no pacote de software GC Solution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A produção de EPS mucoide pode ser observada em culturas de B. longum em placas de PYG após incubação anaeróbia por 72 h (Figura 1a). A centrifugação de raspagens de cultura, seguida pela precipitação e secagem do etanol, resultou na coleta de EPS celulose-like (Figura 1b). EPS secos e amido solúvel foram então utilizados como fontes de carbono para culturas de fermentação. O TLC foi utilizado para análise de separação e pureza de oligosacáridos devido ao seu baixo custo e rápida recuperação dos resultados18. Embora a taxa de degradação do amido por microbiota fecal humana tenha sido mais rápida do que a de BIF EPS (Figura 2), a degradação de BIF EPS foi claramente observada para algumas amostras inoculadas com EPS.
A análise composicional da Comunidade através do sequenciamento de alto débito do gene 16S rRNA e da análise de coordenadas principais (PCoA) foi então realizada para investigar os efeitos do bif EPS na microbiota intestinal humana. As amostras dos grupos VI_Bif e VI_Starch agrupam-se separadamente entre si na análise de PCoA (Figura 3a), indicando que a disponibilidade de EPS e amido forma diferencialmente as comunidades bacterianas fecais humanas. O tamanho do efeito de análise discriminante linear (LEfSe) foi mais utilizado para distinguir os táxons bacterianos específicos que diferiram entre os tratamentos VI_Bif e VI_Starch. Os gêneros Collinsella, coprococcus, Parabacteroidese rhodopseudomonas foram significativamente mais abundantes nas amostras de VI_Bif do que nas amostras VI_Starch (Figura 3B). Além disso, foram feitas medições de GC para várias SCFAs para avaliar sua produção após a adição de diferentes fontes de carbono. Os SCFAs que foram medidos a partir de culturas de fermentação incluíram ácidos acético, propiônico, isobutírico, butírico, isovalérico e valérico. Após a fermentação por 24 h e 48 h, cinco das seis concentrações de SCFA acima mencionadas foram semelhantes entre os tratamentos e não estatisticamente diferentes entre os grupos VI_Bif, VI_Starch e VI. No entanto, as concentrações de ácido propiônico foram significativamente maiores no grupo VI_Bif do que no grupo VI_Starch (Figura 4).
Figura 1: EPS produzido por B. longum.
B. longum congelado foi restaurado em caldo médio Bifidobacterium e, em seguida, com listras em placas de PYG, seguido de incubação anaeróbia a 37 ° c por 72 h (A). Os EPS produzidos por culturas bacterianas foram raspados de culturas de placas, precipitados usando etanol, e secos durante a noite usando um vácuo de velocidade (B). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: análise de TLC de EPS in vitro e degradação de amido por microbiota intestinal humana.
A análise de TLC foi realizada em 0,2 μL de amostras coletadas a 24 h e 48 h de cada cultura de fermentação cultivada em condições anaeróbias. VI, VI_Starch, e VI_Bif indicam mídia VI, VI Media + suplemento de amido, e VI Media + suplemento EPS, respectivamente. Os números 1 – 12 indicam amostras bacterianas fecais dos 12 voluntários que foram utilizados para inocular os experimentos de fermentação. O grupo controle representa o tratamento sem suplementos de carbono adicionais. Este valor é modificado de Yin et al. 11. please estalam aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: efeitos da disponibilidade de BIF EPS em comunidades de microbiota intestinal humana.
(A) parcela de pcoa de dissimilaridades composicional da Comunidade do microbiota do intestino baseada na métrica não ponderada de unifrac. (B) análise de lefse de táxons bacterianos que foram diferencialmente abundantes entre os grupos de tratamento. Um ponto de corte de p < 0, 5 foi utilizado para avaliar a significância estatística das diferenças taxonômicas bacterianas entre os grupos. Ori indica a microbiota intestinal das amostras fecais voluntárias. VI_Bif e VI_Starch indicam a microbiota intestinal a partir de amostras de fermentação por meio de VI com EPS e amido como substratos de carbono, respectivamente. O VI representa o grupo controle com fermentações inoculadas com microbiota intestinal em meio de VI sem suplementação de outros carboidratos. Este valor é modificado de Yin et al. 11 anos de Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: efeitos da disponibilidade de EPS na produção de SCFA após 24 h e 48 h de fermentação.
Ácidos acético, propiônico, isobutírico, butírico, isovalérico e valérico foram detectados utilizando cromatografia gasosa. VI_Bif, VI_Starch e VI indicam as amostras coletadas após o cultivo utilizando VI Media + EPS, VI Media + amido e VI Media, respectivamente. Todas as amostras foram mensuradas em triplicado. Os números foram gerados usando o GraphPad Prism Version 5, 1. Os painéis representam concentrações de ácidos orgânicos dentro de cada amostra fermentada para A, ácido acético; B, ácido propiônico; C, ácido isobutírico; D, ácido butírico; E, Ácido isovalérico; e F, Ácido valérico. Este valor é modificado de Yin et al.11por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Registaram-se progressos significativos no sentido da compreensão da composição e das actividades da microbiota intestinal humana na última década. Como consequência desses estudos, surgiu o conceito de holobiont, que representa as interações entre hospedeiros e comunidades microbianas associadas, como entre humanos e sua microbiota intestinal19,20. Além disso, os seres humanos são considerados mesmo agora como superorganismos21, onde o microbiota do intestino foi reconhecido como um dos órgãos funcionais nos seres humanos22,23. O corpo humano abriga um ecossistema microbiano complexo, constituído por aproximadamente 1013 células microbianas24. Além disso, os genomas da microbiota intestinal são considerados genomas auxiliares de seres humanos que codificam numerosos genes metabólicos relacionados que expandem as capacidades metabólicas do hospedeiro4. No entanto, os xenobióticos, incluindo drogas terapêuticas e compostos bioativos derivados da dieta, podem potencialmente alterar a estrutura da comunidade de microbioma intestinal e funções associadas5. Números crescentes de estudos indicaram que as interações entre microbiota intestinal e xenobióticos desempenham papéis importantes na mediação da toxicidade química e causando, ou de outra forma exacerbe, as doenças humanas6,7. Assim, as investigações das interações entre xenobióticos e a microbiota intestinal humana têm recentemente ganhou a atenção significativa da pesquisa.
Os modelos de mouse têm sido os métodos mais utilizados para investigar interações entre microbiota e hospedeiros. No entanto, as diferenças na composição e nas atividades entre a microbiota intestinal de humanos e camundongos25 podem resultar em modelagem inadequada de interações humanas através de estudos de camundongos. No entanto, as considerações de Bioética exigem o uso mínimo de camundongos. Uma alternativa para os modelos acima in vivo é a fermentação em lote, que pode ser usada para simular a microbiota intestinal humana in vitro26. Conseqüentemente, experimentos de fermentação têm sido utilizados para investigar as interações entre xenobióticos e microbiota intestinal humana. Por exemplo, Yin et al. 17 utilizaram experimentos de fermentação em lote para investigar as interações entre polissacarídeos e microbiota intestinal humana. Os resultados deste estudo indicam que alguns polissacarídeos podem ser metabolizados pela microbiota intestinal humana, e que os polissacarídeos modulam a comunidade bacteriana humana e os metabólitos que produzem in vitro, incluindo os SCFAs. No entanto, algumas considerações metodológicas são críticas para o uso deste protocolo. Por exemplo, amostras fecais devem ser coletadas o mais rápido possível, e uma câmara anaeróbia deve ser usada para garantir o crescimento de anaeróbios obrigatórios. A última consideração é particularmente crítica, porque a exposição ao oxigênio pode levar à morte de algumas populações bacterianas do intestino e, portanto, alteração da comunidade bacteriana. Além disso, os xenobióticos são metabolizados no sistema digestivo superior. Consequentemente, a modelagem das interações entre xenobióticos e a microbiota do sistema digestivo inferior é uma consideração importante para a modelagem in vivo.
Experimentos de fermentação em lote têm vantagens claras sobre estudos in vivo humanos e animais, porque eles são mais viáveis economicamente e convenientes. Além disso, podem ser usados para investigar a variação interindividual de respostas humanas da microbiota do intestino à exposição xenobióticos. Além disso, a fermentação em lote pode ser facilmente aplicada para manipular comunidades microbiota e avaliar suas funções metabólicas associadas. No entanto, os sistemas de fermentação em lote sofrem com a limitação da dinâmica do estado estático. Investigações futuras poderiam implementar quimiostats biorreator que permitem a modulação dinâmica de pH, temperatura e peristaltismo, mantendo um suprimento constante de nutrientes e a remoção contínua de resíduos. Tais atividades permitiriam experimentos para imitar melhor os tratos intestinais in vivo e fornecer novos insights para complementar os de experimentos de fermentação em lote. Uma limitação adicional de experimentos de fermentação em lote é que eles removem todas as interações do tecido do microbioma-hospedeiro. Esta poderia ser uma consideração particularmente importante, como alguns xenobióticos (por exemplo, metanfetamina) pode ser cometabolizado por células humanas e microbiota intestinal27. Além disso, estudos recentes indicaram que o metagenoma do intestino (GM) pode indiretamente regular o metabolismo xenobiótico através da regulação da expressão gênica do hospedeiro8.
Embora os desenvolvimentos de sistemas da fermentação do grupo sejam ainda necessários, estes sistemas podem ser amplamente utilizados para o elevado-throughput e a seleção rápida das interações entre o xenobióticos e o microbiota humano do intestino. Elucidar os mecanismos subjacentes à resistência xenobiótica e ao metabolismo em microbiomas ativos do intestino humano fornecerá insights importantes sobre a variação do paciente para paciente inexplicável na eficácia e toxicidade da droga8,9. Além disso, uma compreensão mais detalhada de como dietas e componentes alimentares específicos alteram os metabolismos microbianos e, consequentemente, a saúde do hospedeiro é o primeiro passo para a realização do objetivo da medicina personalizada através da modulação da microbiota.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse. Os números foram citados em Yin et al. o 11.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado pela Fundação Nacional de ciência da natureza da China (no. 31741109), a Fundação de ciência natural de Hunan (no. 2018JJ3200), e o programa de construção da disciplina característica aplicada na Universidade de ciência e engenharia de Hunan. Agradecemos a LetPub (www.letpub.com) pela sua assistência linguística durante a preparação deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filters | Millipore | SLGP033RB | Use to filter samples |
| 0.4-mm Sieve | Thermo Fischer | 308080-99-1 | Use to prepare human fecal samples |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) | Solarbio | X1010 | Use to prepare color plate |
| Acetic | Sigma-Aldrich | 71251 | Standard sample for SCFA |
| Agar | Solarbio | YZ-1012214 | The component of medium |
| Anaerobic chamber | Electrotek | AW 400SG | Bacteria culture and fermentation |
| Autoclave | SANYO | MLS-3750 | Use to autoclave |
| Bacto soytone | Sigma-Aldrich | 70178 | The component of medium |
| Baking oven | Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd | DHG-9240A | Use to heat and bake |
| Beef Extract | Solarbio | G8270 | The component of medium |
| Bifidobacterium longum Reuter | ATCC | ATCC® 51870™ | Bacteria |
| Bile Salts | Solarbio | YZ-1071304 | The component of medium |
| Butyric | Sigma-Aldrich | 19215 | Standard sample for SCFA |
| CaCl2 | Solarbio | C7250 | Salt solution of medium |
| Capillary column | SHIMADZU-GL | InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) | Used to SCFA detection |
| Casein Peptone | Sigma-Aldrich | 39396 | The component of medium |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 8 | Use for centrifugation |
| CoSO4.7H2O | Solarbio | C7490 | The component of medium |
| CuSO4.5H2O | Solarbio | 203165 | The component of medium |
| Cysteine-HCl | Solarbio | L1550 | The component of medium |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | Use to prepare vitamin K1 |
| FeSO4.7H2O | Solarbio | YZ-111614 | The component of medium |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 399388 | Used to TLC |
| Gas chromatography | Shimadzu Corporation | GC-2010 Plus | Used to SCFA detection |
| Glass beaker | Fisher Scientific | FB10050 | Used for slurry preparation |
| Glucose | Solarbio | G8760 | The component of medium |
| Haemin | Solarbio | H8130 | The component of medium |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| Isobutyric | Sigma-Aldrich | 46935-U | Standard sample for SCFA |
| Isovaleric Acids | Sigma-Aldrich | 129542 | Standard sample for SCFA |
| K2HPO4 | Solarbio | D9880 | Salt solution of medium |
| KCl | Solarbio | P9921 | The component of medium |
| KH2PO4 | Solarbio | P7392 | Salt solution of medium |
| LiCl.3H2O | Solarbio | C8380 | Use to prepare color plate |
| Meat Extract | Sigma-Aldrich-Aldrich | 70164 | The component of medium |
| Metaphosphoric Acid | Sigma-Aldrich | B7350 | Standard sample for SCFA |
| MgCl2.6H2O | Solarbio | M8160 | The component of medium |
| MgSO4.7H2O | Solarbio | M8300 | Salt solution of medium |
| MISEQ | Illumina | MiSeq 300PE system | DNA sequencing |
| MnSO4.H20 | Sigma-Aldrich | M8179 | Salt solution of medium |
| Mupirocin | Solarbio | YZ-1448901 | Antibiotic |
| NaCl | Solarbio | YZ-100376 | Salt solution of medium |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | 792519 | Salt solution of medium |
| NanoDrop ND-2000 | NanoDrop Technologies | ND-2000 | Determine DNA concentrations |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
| n-butanol | ChemSpider | 71-36-3 | Used to TLC |
| NiCl2 | Solarbio | 746460 | The component of medium |
| Orcinol | Sigma-Aldrich | 447420 | Used to prepare orcinol reagents |
| Propionic | Sigma-Aldrich | 94425 | Standard sample for SCFA |
| QIAamp DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extract bacterial genomic DNA |
| Ready-to-use PBS powder | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610100-0001 | Used to prepare the lipid suspension |
| Resazurin | Solarbio | R8150 | Anaerobic Equipment |
| Speed Vacuum Concentrator | LABCONCO | CentriVap | Use to prepare EPSs |
| Starch | Solarbio | YZ-140602 | Use to the carbon source |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 150692 | Used to prepare orcinol reagents |
| T100 PCR | BIO-RAD | 1861096 | PCR amplification |
| TLC aluminium sheets | MerckMillipore | 116835 | Used to TLC |
| Trypticase Peptone | Sigma-Aldrich | Z699209 | The component of medium |
| Tryptone | Sigma-Aldrich | T7293 | The component of medium |
| Tween 80 | Solarbio | T8360 | Salt solution of medium |
| Valeric | Sigma-Aldrich | 75054 | Standard sample for SCFA |
| Vitamin K1 | Sigma-Aldrich | V3501 | The component of medium |
| Vortex oscillator | Scientific Industries | Vortex.Genie2 | Use to vortexing |
| Yeast Extract | Sigma-Aldrich | Y1625 | The component of medium |
| ZnSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | The component of medium |
References
- Maarten, V. D. G., Blottière Hervé, M., Doré, J. Humans as holobionts: implications for prevention and therapy. Microbiome. 6 (1), 81 (2018).
- Allen, A. P., Dinan, T. G., Clarke, G., Cryan, J. F. A psychology of the human brain-gut-microbiome axis. Social and Personality Psychology Compass. 11 (4), e12309 (2017).
- Arora, T., Bäckhed, F. The gut microbiota and metabolic disease: current understanding and future perspectives. Journal of Internal Medicine. 280, 39-349 (2016).
- Maurice, C., Haiser, H., Turnbaugh, P. Xenobiotics shape the physiology and gene expression of the active human gut microbiome. Cell. 152 (1-2), 39-50 (2013).
- Carmody, R. N., Turnbaugh, P. J. Host-microbial interactions in the metabolism of therapeutic and diet-derived xenobiotics. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4173-4181 (2014).
- Lu, K., Mahbub, R., Fox, J. G. Xenobiotics: interaction with the intestinal microflora. ILAR Journal. 56 (2), 218-227 (2015).
- Taguer, M., Maurice, C. The complex interplay of diet, xenobiotics, and microbial metabolism in the gut: implications for clinical outcomes. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 99 (6), 588-599 (2016).
- Anubhav, D., Meenakshi, S., Shankar, G. T., Mande, S. S., Wilson, B. A. Xenobiotic metabolism and gut microbiomes. PLoS One. 11 (10), e0163099 (2016).
- Koppel, N., Rekdal, V. M., Balskus, E. P. Chemical transformation of xenobiotics by the human gut microbiota. Science. 356 (6344), 1246-1257 (2017).
- Hidalgo-Cantabrana, C., et al. Genomic overview and biological functions of exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium spp. Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 9-18 (2014).
- Liu, G., et al. Effects of bifidobacteria-produced exopolysaccharides on human gut microbiota in vitro. Applied Microbiology and Biotechnology. , 1-10 (2018).
- Tang, R., et al. Gut microbial profile is altered in primary biliary cholangitis and partially restored after UDCA therapy. Gut. 67 (3), 534-541 (2018).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to analyze 16S rRNA gene sequences from microbial communities. Current Protocols in Microbiology. 27 (1), 1-28 (2012).
- Hiltemann, S. D., Boers, S. A., van der Spek, P. J., Jansen, R., Hays, J. P., Stubbs, A. P. Galaxy mothur Toolset (GmT): a user-friendly application for 16S rRNA gene sequencing analysis using mothur. GigaScience. , giy166 (2018).
- Wang, Q., Garrity, G. M., Tiedje, J. M., Cole, J. R. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5261-5267 (2007).
- Schloss, P. D., et al. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7537-7541 (2009).
- Bai, S., et al. Comparative study on the in vitro effects of pseudomonas aeruginosa and seaweed alginates on human gut microbiota. Plos One. 12 (2), e0171576 (2017).
- Zhang, Z., Xie, J., Zhang, F., Linhardt, R. J. Thin-layer chromatography for the analysis of glycosaminoglycan oligosaccharides. Analytical Biochemistry. 371, 118-120 (2007).
- Simon, J. C., Marchesi, J. R., Mougel, C., Selosse, M. A. Host-microbiota interactions: from holobiont theory to analysis. Microbiome. 7 (5), (2019).
- Postler, T. S., Ghosh, S. Understanding the Holobiont: how microbial metabolites affect human health and shape the immune system. Cell Metabolism. 26 (1), 110-130 (2017).
- Kramer, P., Bressan, P. Humans as superorganisms: how microbes, viruses, imprinted genes, and other selfish entities shape our behavior. Perspectives on Psychological Science. 10 (4), 464-481 (2015).
- Malfertheiner, P., Nardone, G.
- Andoh, A. The gut microbiota is a new organ in our body. The Japanese journal of Gastro-Enterology. 112 (11), 1939-1946 (2015).
- Mika, A., Van, W. T., González, A., Herrera, J. J., Knight, R., Fleshner, M. Exercise is more effective at altering gut microbial composition and producing stable changes in lean mass in juvenile versus adult male f344 rats. PLoS One. 10 (5), e0125889 (2015).
- Hugenholtz, F., de Vos, W. M. Mouse models for human intestinal microbiota research: a critical evaluation. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (1), 149-160 (2018).
- Takagi, R., et al. A single-batch fermentation system to simulate human colonic microbiota for high-throughput evaluation of prebiotics. PLoS One. 11 (8), e0160533 (2016).
- Ning, T., Gong, X., Xie, L., Ma, B. Gut microbiota analysis in rats with methamphetamine-induced conditioned place preference. Frontiers in Microbiology. 8 (1), 1620 (2017).
