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Immunology and Infection

इन विट्रो बाथ फर्टिलाइजेशन सिस्टम का उपयोग करEndoबायोटिक्स और मानव गट माइक्रोबायोटा के बीच इंटरेक्शन का विश्लेषण

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/59725
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 2, 1
1Key Laboratory of Comprehensive Utilization of Advantage Plants Resources in Hunan South, College of Chemistry and Bioengineering, Hunan University of Science and Engineering, 2College of Food and Biological Engineering, Zhejiang Gongshang University

Summary

यहाँ वर्णित इन विट्रो बैच किण्वन प्रणालियों में उपयोग endobiotics और मानव आंत microbiota के बीच बातचीत की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल है.

Abstract

मानव आंतों सूक्ष्मजीवों हाल ही में मानव स्वास्थ्य को बढ़ावा देने और रोगों को रोकने में अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण लक्ष्य बन गए हैं. नतीजतन, एंडोबायोटिक्स (उदा., दवाओं और प्रीबायोटिक्स) और आंत माइक्रोबायोटा के बीच बातचीत की जांच एक महत्वपूर्ण अनुसंधान विषय बन गए हैं। हालांकि, मानव स्वयंसेवकों के साथ vivo प्रयोगों में bioethics और आर्थिक बाधाओं के कारण इस तरह के अध्ययन के लिए आदर्श नहीं हैं. नतीजतन, पशु मॉडल vivo में इन बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. फिर भी, पशु मॉडल अध्ययन अभी भी bioethics विचार द्वारा सीमित हैं, अलग रचनाओं और जानवरों बनाम मनुष्यों में microbiota की विविधताओं के अलावा. एक वैकल्पिक अनुसंधान रणनीति बैच किण्वन प्रयोगों का उपयोग है कि इन विट्रो में endobiotics और आंत microbiota के बीच बातचीत के मूल्यांकन की अनुमति है. इस रणनीति का मूल्यांकन करने के लिए, द्वि-विडोबैक्टीरियल (बिफ) एक्सोपॉलीसैकेराइड (ईपीएस) का उपयोग एक प्रतिनिधि विदेशीजीवी के रूप में किया गया था। फिर, Bif EPS और मानव आंत microbiota के बीच बातचीत पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी), जीवाणु समुदाय compositional विश्लेषण 16S rRNA जीन उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के साथ, और गैस क्रोमैटोग्राफी के रूप में कई तरीकों का उपयोग कर जांच की गई लघु श्रृंखला फैटी एसिड (SCFAs) की. यहाँ प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल endobiotics और मानव आंत microbiota इन विट्रो बैच किण्वन प्रणालियों में उपयोग के बीच बातचीत की जांच करने के लिए है. महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल भी अन्य endobiotics और आंत microbiota के बीच सामान्य बातचीत की जांच करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

Introduction

Gut microbiota मानव आंतों के कामकाज में और मेजबान स्वास्थ्य में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. नतीजतन, आंत microbiota हाल ही में रोग की रोकथाम और चिकित्सा1के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य बन गए हैं. इसके अलावा, आंत बैक्टीरिया मेजबान आंतों की कोशिकाओं के साथ बातचीत और मौलिक मेजबान प्रक्रियाओं को विनियमित, चयापचय गतिविधियों सहित, पोषक तत्व availabilities, प्रतिरक्षा प्रणाली मॉडुलन, और यहां तक कि मस्तिष्क समारोह और निर्णय लेने2,3 . एंडोबायोटिक्स में जीवाणु संरचना और आंत माइक्रोबायोटा की विविधता को प्रभावित करने की काफी क्षमता है। इस प्रकार एंडोबायोटिक्स और मानव आंत माइक्रोबायोटा के बीच बातचीत ने अनुसंधानपरध्यान 4 ,5,6,7,8,9की ओर आकर्षित किया है .

बायोएथिक्स और आर्थिक बाधाओं के कारण विवो में एंडोबायोटिक्स और मानव आंत माइक्रोबायोटा के बीच बातचीत का मूल्यांकन करना मुश्किल है। उदाहरण के लिए, एंडोबायोटिक्स और मानव आंत microbiota के बीच बातचीत की जांच प्रयोगों खाद्य एवं औषधि प्रशासन की अनुमति के बिना नहीं किया जा सकता है, और स्वयंसेवकों की भर्ती महंगा है. नतीजतन, पशु मॉडल अक्सर ऐसी जांच के लिए उपयोग किया जाता है. तथापि, पशु मॉडलों का उपयोग विभिन्न माइक्रोबायोटा रचनाओं और पशु बनाम मानव-संबद्ध समुदायों में विविधता के कारण सीमित है। एंडोबायोटिक्स और मानव आंत microbiota के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए इन विट्रो विधि में एक विकल्प बैच संस्कृति प्रयोगों के उपयोग के माध्यम से है।

Exopolysaccharides (ईपीएस) prebiotics कि मानव स्वास्थ्य के रखरखाव में महत्वपूर्ण योगदान कर रहे हैं10. विभिन्न मोनोसैकराइड रचनाओं और संरचनाओं से मिलकर बनता है कि अलग ईपीएस अलग कार्यों का प्रदर्शन कर सकते हैं। पिछले विश्लेषणों ने बिफ ईपीएस की संरचना निर्धारित की है, जो वर्तमान अध्ययन11में लक्षित प्रतिनिधि xenobiotic हैं। हालांकि, ईपीएस संरचना और विविधता के संबंध में मेजबान संबद्ध चयापचय प्रभाव पर विचार नहीं किया गया है।

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल Bif EPSs खमीर करने के लिए 12 स्वयंसेवकों से मल microbiota का उपयोग करता है. पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी), 16S RNA जीन उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण, और गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) तो ईपीएस और मानव आंत microbiota के बीच बातचीत की जांच करने के लिए संयोजन में उपयोग किया जाता है। विवो प्रयोगों की तुलना में इस प्रोटोकॉल के विशिष्ट लाभ इसकी कम लागत और मेजबान के चयापचय से हस्तक्षेप प्रभाव से परिहार कर रहे हैं. इसके अलावा, वर्णित प्रोटोकॉल अन्य अध्ययनों में इस्तेमाल किया जा सकता है कि endobiotics और मानव आंत microbiota के बीच बातचीत की जांच.

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Protocol

यह प्रोटोकॉल हुनान यूनिवर्सिटी ऑफ साइंस एंड इंजीनियरिंग (हुनान, चीन) और झेजियांग गोंगशांग विश्वविद्यालय (झेजियांग, चीन) की आचार समिति के दिशानिर्देशों का पालन करता है।

1. बैक्टीरिया की तैयारी

  1. बाइफिडोबैक्टीरियम मध्यम शोरबा की तैयारी
    1. आसुत पानी के 950 एमएल में निम्नलिखित घटकों का मिश्रण: मांस निकालने, 5 g/ खमीर निकालने, 5 g/ केसिन पेपटोन, 10 ग्राम/ सोयटोन, 5 ग्राम/ ग्लूकोज, 10 ग्राम/ K2HPO4, 2.04 g/ MgSO4$7H2O, 0.22 g/L; MnSO4| H20, 0.05 g/ NaCl, 5 g/ ट्वेन 80, 1 एमएल; नमक समाधान, 40 एमएल (CaCl2.2H2O, 0.25 g/ KH2PO4, 1 g/ नाHको3, 10 g/ NaCl, 2 g/ और रेसाजुरिन, 0.4 एमएल (2.5 मिलीग्राम/ 2 M NaOH के साथ 6.8 करने के लिए पीएच समायोजित करें।
    2. 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर ऑटोक्लेव और शोरबा अवायवीय परिस्थितियों (10% एच2, 10% सीओ2, 80% एन2) के तहत कमरे के तापमान (आरटी) को ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं। फ़िल्टर-स्टर्लाइज़्ड सिस्टेइन-एचसीएल (0.5 ग्राम/एल) और मपिरोसिन (5 मिलीग्राम/एल) को माध्यम में जोड़ें।
  2. अवायवीय परिस्थितियों में बाइफिडोबैक्टीरियम मध्यम शोरबा के 5 एमएल के साथ एक संस्कृति ट्यूब में जमे हुए बिफिडोबैक्टीरियम लांगम के एक ऐलिकोट (50 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें, फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 एच के लिए एक अवायवीय इनक्यूबेटर में संस्कृति।

2. द्वि-जैविक ईपीएस की तैयारी

  1. PYG agar माध्यम की तैयारी
    1. निम्नलिखित का मिश्रण: पेपटोन, 20 ग्राम/ खमीर निकालने, 10 ग्राम / ग्लूकोज, 5 g/ NaCl, 0.08 g/ CaCl2, 0.008 g/ MgSO4$7H2O, 0.008 g/L; K2HPO4, 0.04 g/ KH2PO4, 0.04 g/ नाHको3, 0.4 g/ agar, 12 g/L. 10 M NaOH का उपयोग करके पीएच को 7.2 तक समायोजित करें।
    2. 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर मीडिया को ऑटोक्लेव और 50 डिग्री सेल्सियस के लिए ठंडा। फिर, प्रति 1 L मध्यम, फिल्टर-स्टरलाइज़्ड विटामिन के1 समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें (1 ग्राम विटामिन के1 99% इथेनॉल के 99 एमएल में भंग), 5 एमएल हैमिन समाधान (0.5 ग्राम हीमिन 1 एमएल में भंग 1 मोल/ , तो आसुत पानी के साथ 100 एमएल तक लाया), और cysteine-HCl के 0.5 ग्राम.
    3. पीवाईजी प्लेट डालने से पहले, फ़िल्टर-स्टरलाइज़्ड 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल जेड-डी-गैलाक्टोपाइरानोसाइड (एक्स-गल, 0.06 ग्राम/एल), लिक्लिन 3एच2ओ (5.7 ग्राम/
      नोट: X-Gal और LiCl.3H2हे रंग परिवर्तन के माध्यम से प्लेटों पर बी longum कालोनियों की पहचान की अनुमति देते हैं.
  2. बी लांगम उपभेदों के 20 डिग्री सेल्सियल (चरण 1.2) PYG प्लेटों के लिए और 72 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक अवायवीय इनक्यूबेटर में जगह है।
  3. एक वजन स्कूप का उपयोग कर PYG प्लेटों से mucoid जीवाणु कालोनियों लीजिए, तो पूरी तरह से एक भंवर थरथरानवाला का उपयोग कर फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के 10 एमएल में resuspend।
    नोट: जीवाणु और ईपीएस मिश्रण पूरी तरह से भंवर या ऊपर और नीचे बार बार पाइपिंग द्वारा resuspended किया जाना चाहिए जब तक फाइबर पूरी तरह से पीबीएस में भंग कर रहे हैं.
  4. 5 मिनट के लिए 6,000 x ग्राम पर निलंबन सेंट्रीफ्यूज।
  5. ध्यान से एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए supernatants हस्तांतरण और दोहराया उलटा और सम्मिश्रण द्वारा ठंड 99% इथेनॉल के तीन संस्करणों के साथ पूरी तरह से मिश्रण।
  6. 5 मिनट के लिए 6,000 x ग्राम पर मिश्रण centrifuge और पूरी तरह से supernatants हटा दें.
  7. स्क्रैपिंग और सुखाने ईपीएस एक गति वैक्यूम का उपयोग कर रात भर अर्क द्वारा अपकेंद्रित्र ट्यूबों से precipitates निकालें।

3. किण्वन माध्यम की तैयारी

  1. बुनियादी संस्कृति मध्यम VI की तैयारी
    1. निम्नलिखित का मिश्रण: पेपटोन, 3 जी / ट्रिप्टन, 3 g/ खमीर निकालने, 4.5 g/ mucin, 0.5 g/ पित्त लवण संख्या 3, 0.4 ग्राम/ NaCl, 4.5 g/L; केसीएल, 2.5 g/ MgCl2[6H2O, 4.5 g/L; 1 एमएल ट्वीन 80; CaCl2.6H2हे, 0.2 g/ KH2PO4, 0.4 g/ MgSO4[7H2O, 3.0 g/L; MnCl2[4H2O, 0.32 g/ FeSO4$7H2O, 0.1 g/L; CoSO4$7H2O, 0.18 g/ CaCl2$2H2हे, 0.1 g/ [nSO4]7H2O, 0.18 g/L; CuSO4$5H2O, 0.01 g/ और NiCl2$6H2O, 0.092 g/L. 1 M HCl के साथ 6.5 करने के लिए पीएच समायोजित करें।
    2. अनुभाग 2.1 में किया के रूप में हीमिन और cysteine तैयार है और autoclaving और ठंडा करने के बाद जोड़ें.
  2. संस्कृति मीडिया है कि एक VI आधार मीडिया के साथ विभिन्न कार्बन स्रोतों में शामिल हैं तैयार करें. autoclaving से पहले, मध्यम VI में Bif EPS फाइबर के 8 g/L जोड़ें, जिसमें समूह VI$Bif शामिल है. इसके अलावा, 8 g/L स्टार्च मध्यम VI में जोड़ने के लिए समूह VI$Starch का प्रतिनिधित्व करते हैं. अंत में, एक कार्बन स्रोत के अलावा बिना मध्यम VI नियंत्रण (समूह VI) के रूप में प्रयोग किया जाता है.
    नोट: Bif EPS और स्टार्च पहले एक चुंबकीय आंदोलनकारी का उपयोग कर गर्म पानी में भंग कर रहे हैं, तो तैयार VI माध्यम के साथ मिश्रित.
  3. 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर सभी मीडिया ऑटोक्लेव और आरटी को ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं।
  4. एक अवायवीय इनक्यूबेटर में संस्कृति ट्यूबों के लिए प्रत्येक माध्यम के एक subsample (5 एमएल) स्थानांतरण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर शेष मीडिया की दुकान.

4. मानव मल नमूना तैयारी

  1. मल कंटेनरों का उपयोग कर स्वस्थ वयस्क मानव स्वयंसेवकों से ताजा शौच के तुरंत बाद ताजा मल के नमूने एकत्र करें, और बाद में घोल तैयार करने के लिए उपयोग करें।
    नोट: नमूना संग्रह से पहले, सभी स्वयंसेवकों को नमूने दान करने से पहले कम से कम 3 महीने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं, प्रोबायोटिक्स, या प्रीबायोटिक उपचार की कोई प्राप्त नहीं सुनिश्चित करने के लिए जांच की जानी चाहिए। इसके अलावा, सभी दाताओं सूचित, लिखित सहमति प्रदान करना चाहिए.
  2. कांच बीकरमें 0.1 एम अवायवीय पीबीएस (पीएच 7.0) के 10 एमएल में एक ताजा मल नमूना (1 ग्राम) स्थानांतरित करें, फिर 10% (w/v) घोल तैयार करने के लिए कांच की छड़ों का उपयोग करें।
  3. मल घोल को फिल्टर करने के लिए 0.4 एम एम छलनी का उपयोग करें। फिर, बैच संस्कृति किण्वन प्रयोगों टीका करने के लिए फ़िल्टर किए गए घोल के एक subsample का उपयोग करें, और आगे के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर शेष स्टोर।
    Note: चरण 4-2-4-3 एक अवायवीय कक्ष में आयोजित किए जाते हैं।

5. इन विट्रो बैच किण्वन

  1. एक अवायवीय कक्ष के भीतर चरण 3.2 में तैयार किण्वन माध्यम में फ़िल्टर्ड मल घोल (500 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें, फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. अवायवीय कक्ष में 24 ज और 48 एच पर किण्वित नमूनों की 2 एमएल लीजिए और फिर 3 मिनट के लिए 6,000 x ग्राम पर कक्ष के बाहर अपकेंद्रण।
  3. ध्यान से एक नया अपकेंद्रित्र ट्यूब है कि polysaccharide गिरावट विश्लेषण और लघु श्रृंखला फैटी एसिड (SCFAs) माप के लिए इस्तेमाल किया जाएगा करने के लिए supernatants हस्तांतरण.
  4. -80 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूगेशन छर्रों को स्टोर करें और बाद में जीवाणु जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए उपयोग करें।

6. मानव मल माइक्रोबायोटा द्वारा ईपीएस निम्नीकरण

  1. पूर्व लेपित सिलिका जेल-60 टीएलसी एल्यूमीनियम प्लेटों पर किण्वित supernatants के 0.2 $L लोड, तो एक बाल सुखाने का उपयोग कर सूखी।
  2. एक formic एसिड/n-butanol/पानी के 20 एमएल में प्लेटों का विकास (6:4:1, v:v:v) समाधान और एक बाल सुखाने का उपयोग कर सूखी.
  3. रंग करने के लिए orcinol अभिकर्मक में प्लेटों को भिगो दें, फिर एक बाल सुखाने का उपयोग कर सूखी.
    1. आसुत पानी के 25 एमएल में 900 मिलीग्राम लिचेनॉल को भंग करके ऑर्सिनोल अभिकर्मकों को तैयार करें और फिर 375 एमएल इथेनॉल जोड़ दें। इसके बाद, केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड धीरे-धीरे जोड़ा जाना चाहिए और समाधान अच्छी तरह से मिलाया जाना चाहिए।
  4. एक बेकिंग ओवन में 3 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर हीट प्लेटें और टीएलसी बैंड को मापने के द्वारा ईपीएस की गिरावट का मूल्यांकन।

7. मानव आंतों microbiota पर ईपीएस के प्रभाव

  1. चरण 4.3 में तैयार मूल मल के नमूने फ्रीज-थॉव और चरण 5.4 में तैयार किण्वित नमूने।
  2. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक मल जीवाणु जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर सभी नमूनों से जीवाणु जीनोमिक डीएनए (जीडीएनए) निकालें।
  3. डीएनए सांद्रता का निर्धारण, integrities, और आकार वितरण एक माइक्रो-स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और आगर जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस का उपयोग कर।
  4. निकाले गए GDNA से जीवाणु 16S rRNA जीन के पीसीआर का संचालन निम्नलिखित पहले से वर्णित आगे और रिवर्स प्राइमर12का उपयोग कर:
    -आगे प्राइमर (बारकोड प्राइमर 338F): ACTCCTACGGGAGCA
    -रिवर्स प्राइमर (806R): GGACTACHVGGGTWTCTAAT
    निम्न थर्मल साइकिलर शर्तों का उपयोग करें:
    1. 5 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस।
    2. 30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस।
    3. 30 s के लिए 55 डिग्री सेल्सियस।
    4. 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
    5. 35 चक्रों के लिए 2-4 दोहराएँ
    6. 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
    7. थर्मल साइकिलर से हटाने तक 4 डिग्री सेल्सियस पकड़।
  5. अल्ट्रा उच्च थ्रूपुट माइक्रोबियल समुदाय विश्लेषण का उपयोग कर एक डीएनए अनुक्रमण कंपनी में पीसीआर उत्पादों के उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण का संचालन।
  6. Microbial पारिस्थितिकी (QIIME) अनुक्रम विश्लेषण पाइप लाइन13में मात्रात्मक अंतर्दृष्टि का उपयोग कर स्वच्छ, उच्च गुणवत्ता वाले दृश्यों प्राप्त करें।
  7. Mothur सॉफ्टवेयर सूट14जैसे bioinformatics उपकरणों का उपयोग कर 97% न्यूक्लिओटाइड समानता से अधिक के साथ 16S rRNA जीन दृश्यों के लिए परिचालन वर्गीकरण इकाइयों (OTUs) को परिभाषित करें।
  8. प्रत्येक OTU से एक प्रतिनिधि अनुक्रम चुनें और प्रतिनिधि अनुक्रम15वर्गीकृत करने के लिए SILVA वर्गीकरण डेटाबेस के साथ आरडीपी वर्गीकारक का उपयोग करें।
  9. अच्छा है कवरेज की गणना, अल्फा विविधता मैट्रिक्स (सिम्पसन और शान्नोन सूचकांक सहित), और समृद्धि (OTUs की संख्या में देखा) bioinformatics उपकरण का उपयोगकर 16.

8. मानव आंतों microbiota द्वारा SCFA उत्पादन पर ईपीएस के प्रभाव

  1. चरण 5.3 से 2 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में तैयार किण्वित सुपरनेट्स (1 एमएल) जोड़ें।
  2. प्रत्येक नमूने में 25% (w/v) मेटाफॉस्फोरिक एसिड का 0.2 एमएल जोड़ें और भ्रमिल करके समाधानों को अच्छी तरह से मिलाएं।
  3. 20 मिनट के लिए 13,000 x ग्राम पर मिश्रण सेंट्रीफ्यूज और ताजा ट्यूबों के लिए supernatants हस्तांतरण.
  4. संयोग से, 120 एमएम एसिटिक, प्रोपिओनिक, ब्यूटिक, आइसोब्यूटिक, वैलेरिक और आइसोवेलेरिक एसिड के समाधान तैयार करें। फिर, प्रत्येक तैयार एसिड के 1.2 एमएल 25% (w/v) मेटाफॉस्फोरिक एसिड में जोड़ें और मानक कॉकटेल के रूप में उपयोग करें।
  5. 0.22 डिग्री एम झिल्ली का उपयोग करके नमूने फ़िल्टर करें।
  6. पहले बताए गए प्रोटोकॉल11,17के अनुसार उच्च निष्पादन गैस क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके SCFA सांद्रता का पता लगाएं .
    नोट: एक InertCap FFAP कॉलम (0.25 mM x 30 मीटर x 0.25 $M) गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) के लिए प्रयोग किया जाता है। SCFA सांद्रता तो जीसी समाधान सॉफ्टवेयर पैकेज में एकल बिंदु आंतरिक मानक विधि का उपयोग कर पीक क्षेत्रों के आधार पर मात्रा निर्धारित कर रहे हैं.

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Representative Results

72 ज के लिए अवायवीय ऊष्मायन के बाद पीवाईजी प्लेटों पर बी लांगम संस्कृतियों में म्यूकॉइड ईपीएस का उत्पादन देखा जा सकता है (चित्र 1क) । संस्कृति scrapes के centrifugation, इथेनॉल वर्षा और सुखाने के बाद, सेलूलोज़ की तरह ईपीएस का संग्रह में हुई (चित्र 1बी) . सूखे ईपीएस और घुलनशील स्टार्च तो किण्वन संस्कृतियों के लिए कार्बन स्रोतों के रूप में इस्तेमाल किया गया. टीएलसी का उपयोग ओलिगोसैकेराइड पृथक्करण और शुद्धता विश्लेषण के लिए किया जाता था क्योंकि इसकी कम लागत और त्वरित परिणाम टर्नअराउंड18. यद्यपि मानव मल माइक्रोबायोटा द्वारा स्टार्च की अवक्रमण दर बिफ ईपीएस (चित्र2) की तुलना में अधिक तीव्र थी , कुछ ईपीएस-इनोकेक नमूनों के लिए बिफ ईपीएस अवक्रमण स्पष्ट रूप से देखा गया था।

16S rRNA जीन उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण और प्रमुख समन्वय विश्लेषण (PCoA) के माध्यम से सामुदायिक संरचना विश्लेषण तो मानव आंत microbiota पर Bif EPS के प्रभाव की जांच करने के लिए किया गया था. पीसीओए विश्लेषण (चित्र 3क)में एक-दूसरे से अलग-अलग विज़बीफ और विज़ स्टार्च समूहों के नमूने अलग-अलग पाए गए हैं, जो यह दर्शाता है कि ईपीएस और स्टार्च उपलब्धता अंतर मानव मल जीवाणु समुदायों को आकार देती है। रैखिक भेदभाव विश्लेषण प्रभाव आकार (LEfSe) आगे विशिष्ट बैक्टीरियल taxa है कि VI$Bif और VI$Starch उपचार के बीच भिन्न भेद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. वंश कोलिनसेला, कोप्रोकोकस, पैराबैक्टोइडोइड्स, और रोडोस्डोडोमोनास विज़ स्टार्च के नमूनों की तुलना में विज़ब्फ नमूनों में काफी अधिक प्रचुर मात्रा में थे (चित्र 3 बी) . इसके अलावा, जीसी माप विभिन्न कार्बन स्रोतों के अलावा के बाद अपने उत्पादन का मूल्यांकन करने के लिए कई SCFAs के लिए किए गए थे। SCFAs कि किण्वन संस्कृतियों से मापा गया एसिटिक, प्रोपिओनिक, isobutyric, butyric, isovaleric, और वैलेरिक एसिड शामिल थे. 24 एच और 48 एच के लिए किण्वन के बाद, छह ऊपर उल्लिखित SCFA सांद्रता के पांच उपचार के बीच समान थे और सांख्यिकीय VI$Bif के बीच अलग नहीं, VI$Starch, और छठी समूहों. तथापि, वि$स्टारच समूह की तुलना में वि$बिफ समूह में प्रोपिओनिक अम्ल सांद्रता काफी अधिक थी (चित्र 4)।

Figure 1
चित्र 1: ईपीएस बी longum द्वारा उत्पादित.
जमे हुए बी लांगम Bifidobacterium मध्यम शोरबा में बहाल किया गया था और फिर PYG प्लेटों पर लकीरें, 72 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अवायवीय ऊष्मायन के बाद (ए) . जीवाणु संस्कृतियों द्वारा उत्पादित ईपीएस प्लेट संस्कृतियों से स्क्रैप किया गया था, इथेनॉल का उपयोग कर वेग, और एक गति निर्वात (बी) का उपयोग कर रात भर सूख गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: इन विट्रो ईपीएस और मानव आंत microbiota द्वारा स्टार्च गिरावट के टीएलसी विश्लेषण.
टीएलसी विश्लेषण अवायवीय परिस्थितियों में उगाई गई प्रत्येक किण्वन संस्कृति से 24 ज और 48 एच पर एकत्र 0.2 $एल नमूनों पर किया गया था। VI, VI, VI$Starch, और VI]Bif VI मीडिया, VI मीडिया + स्टार्च पूरक, और VI मीडिया + EPS पूरक, क्रमशः इंगित करते हैं। संख्या 1-12 किण्वन प्रयोगों टीका करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि 12 स्वयंसेवकों से मल जीवाणु के नमूने से संकेत मिलता है। नियंत्रण समूह अतिरिक्त कार्बन की खुराक के बिना उपचार का प्रतिनिधित्व करता है. यह आंकड़ा यिन एट अल से संशोधित किया गया है। 11इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: मानव आंत microbiota समुदायों पर Bif EPS उपलब्धता के प्रभाव.
(क) अवजनित यूनिफ्राक मीट्रिक पर आधारित आंत माइक्रोबायोटा समुदाय संघटनात्मक असमानताओं का पी.सी.ओ.ए. (बी) जीवाणु कर का एलईएफई विश्लेषण जो उपचार समूहों में अंतर से प्रचुर मात्रा में थे। पी एंड एलटी की एक कटऑफ; 0.05 समूहों के बीच जीवाणु वर्गीकरण अंतर के सांख्यिकीय महत्व का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। ओरी स्वयंसेवक मल नमूने के आंत microbiota इंगित करता है. VI]Bif और VI]Starch क्रमशः ईपीएस और स्टार्च के साथ छठी मीडिया का उपयोग कर किण्वन नमूनों से आंत microbiota संकेत मिलता है, क्रमशः कार्बन substrates के रूप में. VI अन्य कार्बोहाइड्रेट की पूरकता के बिना छठी मीडिया में आंत microbiota inoculated किण्वन के साथ नियंत्रण समूह का प्रतिनिधित्व करता है. यह आंकड़ा यिन एट अल से संशोधित किया गया है। 11 कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: 24 ज और 48 एच किण्वन के बाद SCFA उत्पादन पर ईपीएस उपलब्धता के प्रभाव।
एसिटिक, प्रोपिओनिक, आइसोब्यूटिक, ब्यूटिक, आइसोवेलेरिक, और वैलेरिक एसिड गैस क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके पाए गए। VI]Bif, VI]Starch, और VI उन नमूनों को इंगित करता है जो क्रमशः VI मीडिया + EPS, VI मीडिया + स्टार्च, और VI मीडिया का उपयोग करके खेती के बाद एकत्र किए गए थे। सभी नमूनों को त्रिफला में मापा गया। आंकड़े GraphPad Prism संस्करण 5.01 का उपयोग कर उत्पन्न किए गए थे. पैनलों एक के लिए प्रत्येक किण्वित नमूना के भीतर कार्बनिक एसिड सांद्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं, एसिटिक एसिड; बी, प्रोपोनिक एसिड; सी, आइसोब्यूइरिक एसिड; डी, ब्यूयरिक एसिड; ई, isovaleric एसिड; और एफ, वैलेकिलिक एसिड. यह आंकड़ा यिन एट अल से संशोधित किया गया है11कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

पिछले दशक में मानव आंत माइक्रोबायोटा संरचना और गतिविधियों को समझने की दिशा में महत्वपूर्ण प्रगति की गई है। इन अध्ययनों के परिणामस्वरूप, होलोबायोंट अवधारणा उभरा है, जो मेजबानों और संबद्ध माइक्रोबियल समुदायों के बीच बातचीत का प्रतिनिधित्व करता है, जैसे कि मनुष्यों और उनके आंत माइक्रोबायोटा19,20के बीच में । इसके अलावा , मनुष्य को अब भी सुपरोज21माना जाता है , जिसमें आंत माइक्रोबायोटा को मनुष्यों में कार्यात्मक अंगों में से एक के रूप में मान्यता दी गई है22,23. मानव शरीर एक जटिल माइक्रोबियल पारिस्थितिकी तंत्र होस्ट करता है, जिसमें लगभग 1013 माइक्रोबियल कोशिकाएं24हैं। इसके अलावा, आंत microbiota के जीनोम मानव से सहायक जीनोम माना जाता है कि कई चयापचय से संबंधित जीन सांकेतिक और अधिक सांकेतिक संबंध है कि मेजबान चयापचय क्षमताओं का विस्तार4. हालांकि, चिकित्सा दवाओं और आहार व्युत्पन्न bioactive यौगिकों सहित विदेशी जीवविज्ञान, संभावित आंत microbiome समुदाय संरचना और जुड़े कार्यों5बदल सकते हैं. अध्ययनों की बढ़ती संख्या से पता चला है कि आंत माइक्रोबायोटा और एक्सोबायोटिक्स के बीच बातचीत रासायनिक विषाक्तता को मध्यस्थता करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है और अन्यथा, मानवरोगों6 ,7. इस प्रकार, xenobiotics और मानव आंत microbiota के बीच बातचीत की जांच हाल ही में महत्वपूर्ण अनुसंधान ध्यान जुटाने की है.

माउस मॉडल microbiota और मेजबानों के बीच बातचीत की जांच करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों किया गया है. हालांकि, संरचना और मनुष्यों और चूहों के आंत microbiota के बीच गतिविधियों में मतभेद25 चूहों के अध्ययन के माध्यम से मानव बातचीत के अपर्याप्त मॉडलिंग में परिणाम हो सकता है. फिर भी, bioethics विचार चूहों के कम से कम उपयोग की आवश्यकता है. विवो मॉडल में ऊपर के लिए एक विकल्प बैच किण्वन है, जो इन विट्रो26में मानव आंत microbiota अनुकरण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. नतीजतन, किण्वन प्रयोगों का उपयोग विदेशीबायोटिक्स और मानव आंत माइक्रोबायोटा के बीच बातचीत की जांच करने के लिए किया गया है। उदाहरण के लिए, यिन एट अल. 17 polysaccharides और मानव आंत microbiota के बीच बातचीत की जांच करने के लिए बैच किण्वन प्रयोगों का इस्तेमाल किया है. इस अध्ययन से परिणाम से संकेत मिलता है कि कुछ polysaccharides मानव आंत microbiota द्वारा metabolized किया जा सकता है, और है कि polysaccharides मानव जीवाणु समुदाय और चयापचयों कि वे इन विट्रो में उत्पादन, SCFAs सहित modulate. हालांकि, कुछ methodological विचार इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। उदाहरण के लिए, मल के नमूने जितनी जल्दी हो सके एकत्र किए जाने चाहिए, और एक अवायवीय कक्ष का उपयोग अविकल्पी एनारोबियों के विकास को सुनिश्चित करने के लिए किया जाना चाहिए। बाद विचार विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि ऑक्सीजन जोखिम कुछ आंत जीवाणु आबादी की मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और इस प्रकार, जीवाणु समुदाय के परिवर्तन. इसके अलावा, ऊपरी पाचन तंत्र में विदेशी जीवाण्विक चयापचय होते हैं। नतीजतन, xenobiotics और कम पाचन तंत्र microbiota के बीच बातचीत मॉडलिंग विवो मॉडलिंग में के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है.

बैच किण्वन प्रयोगों vivo मानव और पशु अध्ययन में स्पष्ट लाभ है क्योंकि वे और अधिक आर्थिक रूप से संभव है और सुविधाजनक हैं. इसके अलावा, वे विदेशी जीवीय जोखिम के लिए मानव आंत microbiota प्रतिक्रियाओं के अंतर-व्यक्तिगत भिन्नता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, बैच किण्वन आसानी से microbiota समुदायों में हेरफेर और उनके जुड़े चयापचय कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है. हालांकि, बैच किण्वन सिस्टम स्थिर स्थिति गतिशीलता की सीमा से पीड़ित हैं। भविष्य की जांच bioreacter chemostats कि पीएच, तापमान, और peristalsis के गतिशील मॉडुलन की अनुमति लागू कर सकता है, जबकि पोषक तत्वों की एक सतत आपूर्ति और कचरे को लगातार हटाने को बनाए रखने. इस तरह की गतिविधियों प्रयोगों बेहतर vivo आंत्र पथ में नकल और बैच किण्वन प्रयोगों से उन लोगों के पूरक के लिए नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने की अनुमति होगी. बैच किण्वन प्रयोगों की एक अतिरिक्त सीमा है कि वे सभी microbiome मेजबान ऊतक बातचीत को हटा दें. यह एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण विचार हो सकता है, के रूप में कुछ विदेशी बायोटिक्स (जैसे, methaphetamine) मानव कोशिकाओं और आंत microbiota27द्वारा सह metabolized किया जा सकता है. इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि आंत मेटाजेनोम (जीएम) अप्रत्यक्ष रूप से मेजबान जीन अभिव्यक्ति विनियमन8को विनियमित करने के माध्यम से विदेशी जीवीय चयापचय को विनियमित कर सकते हैं।

हालांकि बैच किण्वन प्रणालियों के विकास अभी भी जरूरत है, इन प्रणालियों को व्यापक रूप से उच्च throughput और विदेशी जीवाणु और मानव आंत microbiota के बीच बातचीत की तेजी से स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सक्रिय मानव आंत माइक्रोबायोम में विदेशी जीवीय प्रतिरोध और चयापचय के अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने से दवा प्रभावकारिता और विषाक्तता8,9में अस्पष्ट रोगी-से-रोगी भिन्नता में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्राप्त होगी। इसके अलावा, कैसे आहार और विशिष्ट खाद्य घटकों माइक्रोबियल चयापचयों को बदलने और फलस्वरूप प्रभाव मेजबान स्वास्थ्य microbiota मॉडुलन के माध्यम से व्यक्तिगत चिकित्सा के लक्ष्य को साकार करने की दिशा में पहला कदम है की एक अधिक विस्तृत समझ.

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है। ये आंकड़े यिन एट अल में उद्धृत किए गए थे. 11|

Acknowledgments

इस अध्ययन चीन के राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन (नहीं 31741109), Hunan प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नहीं 2018JJ3200), और विज्ञान और इंजीनियरिंग के Hunan विश्वविद्यालय में लागू विशेषता अनुशासन के निर्माण कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित किया गया. हम इस पांडुलिपि की तैयारी के दौरान अपनी भाषाई सहायता के लिए LetPub (www.letpub.com) धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm membrane filters Millipore SLGP033RB Use to filter samples
0.4-mm Sieve Thermo Fischer 308080-99-1 Use to prepare human fecal samples
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-Gal) Solarbio X1010 Use to prepare color plate
Acetic Sigma-Aldrich 71251 Standard sample for SCFA
Agar Solarbio YZ-1012214 The component of medium
Anaerobic chamber Electrotek  AW 400SG Bacteria culture and fermentation
Autoclave SANYO MLS-3750 Use to autoclave
Bacto soytone Sigma-Aldrich 70178 The component of medium
Baking oven Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd DHG-9240A Use to heat and bake
Beef Extract Solarbio G8270 The component of medium
Bifidobacterium longum Reuter ATCC ATCC® 51870™ Bacteria
Bile Salts Solarbio YZ-1071304 The component of medium
Butyric Sigma-Aldrich 19215 Standard sample for SCFA
CaCl2 Solarbio C7250 Salt solution of medium
Capillary column SHIMADZU-GL InertCap FFAP (0.25 mm × 30 m × 0.25 μm) Used to SCFA detection
Casein Peptone Sigma-Aldrich 39396 The component of medium
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall ST 8 Use for centrifugation
CoSO4.7H2O Solarbio C7490 The component of medium
CuSO4.5H2O Solarbio 203165 The component of medium
Cysteine-HCl Solarbio L1550 The component of medium
Ethanol Sigma-Aldrich E7023 Use to prepare vitamin K1
FeSO4.7H2O Solarbio YZ-111614 The component of medium
Formic Acid Sigma-Aldrich 399388 Used to TLC
Gas chromatography Shimadzu Corporation GC-2010 Plus Used to SCFA detection
Glass beaker Fisher Scientific FB10050 Used for slurry preparation
Glucose Solarbio G8760 The component of medium
Haemin Solarbio H8130 The component of medium
HCl Sigma-Aldrich 30721 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
Isobutyric Sigma-Aldrich 46935-U Standard sample for SCFA
Isovaleric Acids Sigma-Aldrich 129542 Standard sample for SCFA
K2HPO4 Solarbio D9880 Salt solution of medium
KCl Solarbio P9921 The component of medium
KH2PO4 Solarbio P7392 Salt solution of medium
LiCl.3H2O Solarbio C8380 Use to prepare color plate
Meat Extract Sigma-Aldrich-Aldrich 70164 The component of medium
Metaphosphoric Acid Sigma-Aldrich B7350 Standard sample for SCFA
MgCl2.6H2O Solarbio M8160 The component of medium
MgSO4.7H2O Solarbio M8300 Salt solution of medium
MISEQ Illumina MiSeq 300PE system DNA sequencing
MnSO4.H20 Sigma-Aldrich M8179 Salt solution of medium
Mupirocin Solarbio YZ-1448901 Antibiotic
NaCl Solarbio YZ-100376 Salt solution of medium
NaHCO3 Sigma-Aldrich 792519 Salt solution of medium
NanoDrop ND-2000 NanoDrop Technologies ND-2000 Determine DNA concentrations
NaOH Sigma-Aldrich 30620 Basic solution used to adjust the pH of the buffers
n-butanol ChemSpider 71-36-3 Used to TLC
NiCl2 Solarbio 746460 The component of medium
Orcinol Sigma-Aldrich 447420 Used to prepare orcinol reagents
Propionic Sigma-Aldrich 94425 Standard sample for SCFA
QIAamp DNA Stool Mini Kit QIAGEN 51504 Extract bacterial genomic DNA
Ready-to-use PBS powder Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. A610100-0001 Used to prepare the lipid suspension
Resazurin Solarbio R8150 Anaerobic Equipment
Speed Vacuum Concentrator LABCONCO CentriVap Use to prepare EPSs
Starch Solarbio YZ-140602 Use to the carbon source
Sulfuric Acid Sigma-Aldrich 150692 Used to prepare orcinol reagents
T100 PCR BIO-RAD 1861096 PCR amplification
TLC aluminium sheets MerckMillipore 116835 Used to TLC
Trypticase Peptone Sigma-Aldrich Z699209 The component of medium
Tryptone Sigma-Aldrich T7293 The component of medium
Tween 80 Solarbio T8360 Salt solution of medium
Valeric Sigma-Aldrich 75054 Standard sample for SCFA
Vitamin K1 Sigma-Aldrich V3501 The component of medium
Vortex oscillator Scientific Industries Vortex.Genie2 Use to vortexing
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625 The component of medium
ZnSO4.7H2O Sigma-Aldrich Z0251 The component of medium

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References

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इन विट्रो बाथ फर्टिलाइजेशन सिस्टम का उपयोग करEndoबायोटिक्स और मानव गट माइक्रोबायोटा के बीच इंटरेक्शन का विश्लेषण
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Hu, Y., Chen, H., Li, P., Li, B., Cao, L., Zhao, C., Gu, Q., Yin, Y. Analysis of Interactions between Endobiotics and Human Gut Microbiota Using In Vitro Bath Fermentation Systems. J. Vis. Exp. (150), e59725, doi:10.3791/59725 (2019).

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