Summary
Metode til at vurdere virkningen af uddannelse på motoriske færdigheder er et nyttigt redskab. Desværre kan de fleste adfærdsmæssige vurderinger være arbejdskraftintensive og/eller dyre. Vi beskriver her en robot metode til at vurdere, om der er færdigheder (REACH-to-fatte) i mus.
Abstract
Vi beskriver en metode til at introducere naive mus til en ny, omfattende (REACH-to-fatte) opgave. Mus er anbragt enkeltvis i bure med en frontal slot, der gør det muligt for musen at nå ud af sit bur og hente mad pellets. Minimal fødevare restriktion er ansat til at tilskynde musene til at udføre madhentning fra slottet. Da musene begynder at associere kommer til slottet for mad, er pillerne manuelt trukket væk for at stimulere udvidelse og pronation af deres pote til at forstå og hente pellet gennem den forreste slot. Når musene begynder at nå frem til pellets, når de ankommer til slotspillet, kan den adfærdsmæssige analyse udføres ved at måle den hastighed, hvormed de med held forstår og henter den ønskede pellet. De er derefter introduceret til en auto-træner, der automatiserer både processen med at levere mad pellets til musen til at forstå, og optagelsen af vellykkede og mislykkedes at nå og fatte forsøg. Dette giver mulighed for indsamling af at nå data for flere mus med minimal indsats, der skal anvendes i eksperimentel analyse efter behov.
Introduction
Metoder til eksperimentelt teste en motorisk færdighed præ-og post-neurologisk skade samt moduere timing, beløb, og typen af motor uddannelse er vigtige for Translationel forskning. I løbet af de sidste ti år, mus, på grund af den ledsagende lethed af genetisk manipulation, er blevet et populært model system til at belyse mekanismerne i motor læring præ-og post-skade. Men, adfærdsmæssige assays i mus er ikke blevet optimeret på samme måde, som sådanne assays har været for andre pattedyr (især rotter). Desuden er der vigtige forskelle mellem adfærden af en mus og en rotte, der kraftigt tyder på uddannelse af de to arter i forskellige manerer1,2.
Faglærte forkaste bevægelser bruger en hånd/pote til at placere mad i munden, til at manipulere et objekt, eller til at bruge et værktøj. Faktisk er det at nå at forstå forskellige objekter i hverdagen en grundlæggende funktion i øvre lemmer, og Reach-to-Eat-loven er en form for afgørelse, som mange pattedyr bruger. Mange af de genetiske, fysiologiske og anatomiske forandringer, der underbygger en kompetence erhvervelse, er blevet veldefineret i felt3. Ved at omsætte prækliniske fund til kliniske resultater, har man brug for en relevant test, der er effektiv og reproducerbar. Undersøgelser af gnaver og menneskelige rækker viser, at det er ens for mennesker og dyr4. Disse ligheder tyder derfor på, at en omfattende afprøvning kan tjene som en translationel model for undersøgelse af motorisk indlæring samt for funktionsnedsættelser og behandling af sygdomme hos mennesker. Derfor kan en evaluering af det i mus tilbyde et kraftfuldt værktøj i Translationel forskning, der studerer både sundheds-og sygdomstilstande4.
Desværre kan den omfattende opgave i mus, selv for en mindre laboratorie indstilling, være omstændelig og tidskrævende. For at afhjælpe dette problem beskriver vi her en automatiseret version af den omfattende opgave. Den beskrevne opgave kræver mus til at forlænge en enkelt pote gennem musens hjem bur frontal slot, udtale den udvidede pote, forstå mad pellet belønning, og trække pellet tilbage til bur interiør til forbrug. De resulterende data præsenteres som enten en stor succes eller fiasko. Denne automatisering registrerer dataene og reducerer den byrde og tid, hvormed forskerne skal engagere sig i opgaven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af ACUC (Animal Care og use Committee) af Johns Hopkins University.
1. klargøring af muse bure til brug
- Opret en kærne åbning med dimensioner på 0,8 cm bredde og 7 cm højde fra bunden i forreste ende af hvert bur, som illustreret i figur 1. Dette slot tjener som den åbning, hvorigennem dyret vil nå.
Bemærk: Auto-Trainer er designet til brug med standardmusen bur dimensioner (som vist i figur 1) leveres af de fleste animalske forskning levering leverandører. Yderligere, Auto-træner vil nemt støtte andre bur-typer. - Inde i hver enkelt bur, tilføje en platform støder op til åbningen for at gøre det muligt for mus til at stå og nå de præsenterede pellets. Sørg for, at platformen er placeret over bur kuld gulvet, ca. 3 cm i højden. Brug Petri skåle fastgjort med superlim og udjævnet af en metalplade ca. 10 cm x 15 cm, men enhver flad overflade stor nok til en mus til at stå på at nå fra vil være tilstrækkeligt.
- Opret en lodret hak gennem midten af forsiden af buret måler 0,8 cm på tværs og 7 cm høj, der vil tillade en mus til at nå sin pote ud af buret.
- Fra en tynd plade af metal, (ca. 2 mm tyk) skåret en bur port i rektangler, der måler 5 cm x 10 cm til at fungere som en ensartet åbning, hvorigennem dyret er at nå.
Bemærk: mus kan tygge på plastik bure, som ville ændre størrelsen af åbningen. Musen vil nå gennem denne 0,8 cm slot, når metallisk bur porten er placeret over Buens slidser åbning under afprøvning ved hjælp af tape, opretholde den effektive bredde af åbningen mellem bure. - Dæk hvert BURS slot med tape, når dets mus ikke testes for at forhindre, at strøelse bliver udvist fra buret.
2. introduktion af mus til den vidtrækkende bevægelse
- Optag hver mus startvægt og Beregn 85% af denne værdi for at finde deres mål vægt, afrunding op til 20 g, hvis resultatet er mindre. Giv dem en fodring regime til at bringe dem til og derefter opretholde denne mål vægt.
- Giv hver mus 2,5 g pellets den første dag og Bemærk enhver ændring i deres vægt 24 h senere.
Bemærk: vejer musene en gang om dagen og forventer en vægt dråbe på 0,25-1 g pr. dag. - Skift hver mus daglige foder som krævet, baseret på denne indledende ændring og løbende ændringer i hver mus ' s vægt, for at inducere gradvis vægttab (mindre end 0,8 g tabt pr. dag) og derefter opretholde den resulterende mål vægt. Variere mellem tre til 6 500 mg pellets (1,5 til 3,0 g) pr. dag for at være effektiv.
Bemærk: mus forbliver på denne diæt for at opretholde deres mål vægt i hele protokollen.
- Giv hver mus 2,5 g pellets den første dag og Bemærk enhver ændring i deres vægt 24 h senere.
- Når en mus har nået sin mål vægt, introducere hver mus til konceptet om at komme op til gated slot for en supplerende fødevare pellet. Start en træningssession ved at placere en 45 mg pellet på pellet overfladen, direkte foran åbningen, og lad hver mus til at hente den. De fleste mus vil tage til denne fodring arrangement inden for 1-2 dage.
- Når musen forbinder en åben slot med at blive fodret, opmuntre dem til at nå med en pote, snarere end munden.
Bemærk: Dette er det mest komplekse trin, der tager 1-2 dage, og indgyde kontraproduktiv adfærd i mus ved en fejltagelse er meget let; Se venligst diskussionsafsnittet for yderligere information og rådgivning.- Brug et par pincet, hold en pellet i samme position, som musen har hentet pellets tidligere. Som musen begynder at bide for pellet, trække det væk ca. en halv centimeter sådan, at pellet er uden for rækkevidde af munden.
Bemærk: en mus på dens mål vægt vil forsøge at hente out-of-Reach pellet. Når musen udvider en pote gennem slottet, forstærke denne opførsel ved at tillade det at spise pellet. Nogle mus kan udvise en præference for en pote over den anden, når de udvider for mad. - Selv om det ikke er medvirkende til eksperimenter, registrere, om den venstre eller højre pote foretrækkes. Dette kan potentielt give mulighed for højere samlede succesrater i den adfærdsmæssige analyse; Alternativt kan du eliminere en variabel ved at tvinge hver mus til at nå med den samme pote.
Bemærk: der opnås bedre resultater, hvis mus bruger deres foretrukne pote. - Som hver mus forbinder en pote med at spise en pellet, yderligere styrke denne adfærd ved at tilbageholde pellet som reaktion på forsøg på at hente pellet med mund og tunge. Mus vil begynde at overholde dette arrangement over 2 til 3 dage.
- Færdiggøre indførelsen af den ønskede pote nå adfærd ved at placere 45 mg pellet lige under 1 cm fra yder kanten af burporten, således at det yderste eller yderste punkt af pellet (uanset om det er til højre eller venstre for buret slot fra investigator 's perspektiv) er tangent til en linje, der strækker sig lige ud fra kanten af burgatens slot. Lad musen til at forsøge at hente pellet, at være på vagt for at fjerne pellet og forhindre dens forbrug, hvis musen skal forsøge af en anden metode end Paw forlængelse.
Bemærk: når en mus konsekvent udvider en pote til at snuppe og er i stand til at røre den medfølgende pellet, er den klar til at teste ved hjælp af Auto-træner beskrevet nedenfor og tilhørende adfærdsmæssige assay. Tiden fra naive introduktioner til at være forberedt vil variere mellem mus; Hvis der er stragglers, der tager mere end to uger at forstå, bør de udelukkes fra datasættet.
- Brug et par pincet, hold en pellet i samme position, som musen har hentet pellets tidligere. Som musen begynder at bide for pellet, trække det væk ca. en halv centimeter sådan, at pellet er uden for rækkevidde af munden.
3. brug af Auto-Trainer
Bemærk: Se figur 1-3 og diskussionsafsnittet for en komplet beskrivelse af den automatiske under træners hardware, software og fysiske handlinger.
- Forbered dig på træningssessionen.
- Kalibrere agn pellet sensoren. Klik på pilen Kør i LabVIEW-grænsefladen, og Bemærk, at agn pellet sensoren læser både med og uden en pellet på plads. Klik på stop -knappen for at stoppe denne testkørsel og ændre agn pellet sensor mål til en værdi mellem disse to behandlinger (figur 3 og tabel 2). De fleste lysforhold giver en aflæsning mellem 1 og 4.
- Placer det modificerede muse bur på Auto-træneren (figur 2). Fastgør burgaten ( figur 1), og ret pellet til kanten af åbningen som i den manuelle procedure.
- Kør musens træningssession ved hjælp af LabVIEW-grænsefladen.
- Input oplysninger som krævet for at registrere data om træningssessionen (figur 3 og tabel 2).
- Klik på feltet muse-id , og Skriv filnavnet for hver træningssession ved hjælp af computerens tastatur.
- Klik på Total pellets at dispensere underrutine felt til at styre, hvor mange pellets er dispenseret for et enkelt eksperiment (normalt 20-30). Det gør du ved at klikke på pil op og pil ned eller indtaste nummeret ved hjælp af computerens tastatur.
- Klik på feltet pause efter pellet nummer for at indstille en 5 s pause, efter at den angivne pellet er fjernet fra dykker brættet. Det gør du ved at klikke på pil op og pil ned eller indtaste nummeret ved hjælp af computerens tastatur.
- Klik på feltet pause længde for at indstille en pause mellem det tidspunkt, hvor en pellet fjernes fra dykker brættet, og det tidspunkt, hvor en ny pellet dispenseret. Det gør du ved at klikke på pil op og ned eller indtaste nummeret ved hjælp af computerens tastatur
Bemærk: normalt er 1 s en passende pause tid. Hvis musene er nervøse efter hver pille dispenseret, er det tilrådeligt at øge pause længde ved hjælp af pause længde feltet til 5 s. - Manuelt registrere den afstand, som pellet er placeret i feltet Reach distance . Det gør du ved at klikke på pil op og ned eller indtaste nummeret ved hjælp af computerens tastatur
Bemærk: størrelsen af accelerations-og tids matricer er eksponeret for fejlfindingsformål og kan ignoreres. - Klik på den mappe, som skal indeholde logfiler , for at vælge filplaceringen for at gemme de indsamlede data.
- Når oplysningsfelterne er udfyldt, skal du klikke på knappen Kør for at starte træningssessionen. Auto-Trainer vil dispensere individuelle pellets og spore, om de falder gennem tragten, indtil det samlede antal pellets er blevet dispenseret, og den sidste pellet er enten blevet hentet eller faldet med musen. Programmet vil stoppe automatisk på dette tidspunkt. Hvis det er nødvendigt, kan det også stoppes for tidligt ved at klikke på stop -knappen.
- Når softwaren er sat op, placere hjemmet-bur af musen til at blive testet på piedestal og observere musen, så du kan måle, om musen faktisk har lært at forsøge den nødvendige roman nå adfærd. Efter at have klikket på knappen Kør , lad musen til at undersøge slotspillet og dets nye, ukendte omgivelser.
Bemærk: svarende til når du introducerer mus til konceptet om at nå, forventer nogle mus til at være mere kompatibel end andre. Mus, der har forstået konceptet bør forsøge at nå inden for 5-10 min og vil associere bevægelsen af Auto-træner med den præsenterede pellet, som når de forbinder en udækket slot med mad i de indledende stadier af denne protokol.
- Input oplysninger som krævet for at registrere data om træningssessionen (figur 3 og tabel 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Generelt anbefales det, at hver træningssession består af omkring 20-30 forsøg, som kan indstilles af brugeren, køre automatisk af Auto-træner og gemmes i en enkelt logfil pr session og mus. Hvert forsøg kan køres fortløbende, lige efter den anden, med 2-5 s pause. Mus uddannet på Auto-træner udviser en stigning i færdighed over 10 træningssessioner.
For at sammenligne nytten af Auto-træner til manuel træning (betragtes som guld-standarden), vi uddannet voksne mandlige C57bl/6 mus i alderen 100 til 140 dage gammel manuelt og ved hjælp af Auto-træner. Alle dyr håndtering og brug blev udført i henhold til og med godkendelse fra Johns Hopkins University Animal Care og use udvalget. Mus uddannet med Auto-træner lærte den omfattende opgave og udviser en klar stigning i motorisk dygtighed (figur 4). Denne stigning i færdigheder svarer til den, der ses, når dyret er uddannet manuelt uden brug af Auto-træner (figur 4). For disse data blev manuel afgørelse scoret som en succes, når musen nåede sin forbimb gennem slids, greb pellet, og spiste det uden at banke det fra sin hvileplads, droppe det, eller på anden måde mister kontrollen. Procentdelen af vellykkede forsøg blev fastlagt pr. pellet. En Trænings blok bestod af 30 pellets i en afstand af 1 cm med hver pellet præsenteret en ad gangen. Mus uddannet på Auto-træner blev uddannet pr den protokol, der er beskrevet ovenfor. Hvert punkt i figur 4 repræsenterer en dag med træning, hvor dyrene nåede for 30 pellets og graferet som procent korrekte. Der var ingen statistisk forskel mellem de to linjer ved hjælp af en ikke-parametrisk t-test med korrektion for flere sammenligninger.
Figur 1: eksemplarisk billeder af hjemmet bur. A) fugleperspektiv af et Standardhus, der er modificeret med perron (orange) og slot på forsiden af buret. B) Front-View af et hjem bur modificeret med en kærne åbning med ca. 0,8 cm x 7 cm.C) bur Gate skåret fra en tynd plade af metal og indpakket med tape til at beskytte kanter. (D, E) burlåge anbragt foran åbningen for at fungere som en ensartet åbning, hvorigennem musen skal nå; forreste (D) og skrå (E) synspunkter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Eksemplarisk billeder af Auto-træner. (A, B) Afbilledet er auto-træner uden (A) eller med (B) et modificeret muse bur på plads. (C-J) Detaljeret udsigt over dykker brættet mad pellet holder design set enten forfra (c, D, H, i) eller fra siden (E, f, G, j), med (D, E, f, I) eller uden (c, G, H, j) en føde pille. Bemærk, at pellet afstand fra dyret nemt kan ændres som bur afstand fra dykker brættet er modificerbare. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Skærmbillede af softwaren. Skærmbillede af program, der bruges til at køre Auto-Trainer. Billedet viser de vigtige indtastningsfelter, der er beskrevet i protokollen. Se tabel 2 for yderligere beskrivelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentative data. Faglært enision øges til et lignende plateauet niveau ved hjælp af både Auto-træner og manuelle Trænings paradigmer. Plot viser rækkevidde for at fatte succes (gennemsnit +/-SEM; Manual: grå, n = 14; Auto-træner: sort, n = 15). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Trin | Anslået varighed (i dage) | Kommentar |
| 2,1 vægttab | 3 til 5 | Afhængig af indledende vægt og derfor, hvor meget vægt at tabe indtil på mål |
| 2,2 slot træning | 1 | Mus lærer at føle arrivés nærmer sig åbne slot for mad |
| 2,3 forme | 4 til 8 | |
| 2.3.1 brug af Paw | 1 | Succes her afhænger af hurtigt at give pellet efter musen, nægtet sin mad, paaws for pellet. |
| 2.3.2 indstilling af pote | 1 | Kontrollere, om musen foretrækker venstre eller højre pote. |
| 2.3.3 begrænsning af dårlig pote brug | 2 til 3 | Som i tidligere trin, det er afgørende at forhindre hentning med munden og tungen. |
| 2.3.4 tweezers | 1 | Nogle mus vil snuble ved at tage pellet af sig selv snarere end fra tweezers, fodre dem lidt mindre |
| 3. Auto træning | 10 til 15 | Dage indtil asumptote. |
Tabel 1: tidsplan for mus træning ved hjælp af Auto-træner.
| INDTASTNINGSFELT | Bruge |
| Muse-ID | Indtast filnavnet, hvorunder de indsamlede data vil blive gemt. |
| Total pellets at dispensere underrutine | Indtast det samlede antal pellets, der vil blive dispenseret under træningssessionen. |
| Pause efter pellet nummer | Forældet funktion. Kan bruges til at sætte træningssessionen på pause, efter at den specificerede pellet er dispenseret. |
| Pause længde (r) | Varigheden af den tid, pausen varer. |
| Afstand mellem rækkevidde (mm) | Optag afstanden over minimum, over hvilken musen skal nå for at hente pellet. Nul som standard. |
| Størrelsen af accelerometer og tids matricer | Funktion eksponeret til fejlfindingsformål. Behold ved standardværdien på 500. |
| Mappe, som skal indeholde logfiler | Klik på mappeikonet for at vælge, hvor de indsamlede data skal gemmes. |
| Enhedens navn | LabVIEW-funktion, der forbinder hardware med software. Som standard til Dev1. Afhængigt af USB-forbindelser kan hardwaren blive vist i rullemenuen under et andet nummer. Vælg enheder, indtil man arbejder. |
| Pileknap, øverst til venstre | Klik her for at køre programmet, uanset om det er til en træningssession eller til kalibrering. |
| Knappen Stop Underskriv, øverst til venstre | Stop programmet for tidligt. |
Tabel 2: software grænseflade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores Auto-træner evaluerer på en automatiseret måde forbimb Reach-to-Grib. For at nå dette endepunkt er mange af de parametre, der er beregnet til at overføre musen, herunder pellet placering, pellet størrelse og Trænings kriterier, blevet itteret over flere år og tilpasset fra tidligere protokoller2,5 ,6. Avancement her er automatisering af opgaven ved hjælp af en robot, der tillader hjem-bur boliger. Hjem-bur boliger tillader mus til at forblive rolig og udføre opgaven med mindre angst. Non-Home-bur uddannelse er forbundet med øget stress, som kan føre til øget tid og nedsat præcision7,8,9. Vi demonstrerer her præcision ligner vores egne resultater med manuel hjem-bur uddannelse5,7,8. Selv om hjem-bur oplæring eksisterer nemlig den rotte10, hen til vor kundskab, indeværende er den først bil-uddannet at tager bedste i oplæring mus i deres hjem-bur.
Vores Auto-træner omfatter en justerbar platform, hvor en kærne bur hviler og kan sænkes eller hæves til den passende højde for tilpasning med en fødevare pellet holder (også kaldet et dykker bræt). Et pellet Dispenseringssystem placerer madpellet på dykker bordholderen. Fødevare pellet holderen har en agn pellet sensor samling bestående af en reflekterende objekt sensor til at opdage, om en fødevare pellet er til stede eller ikke på dykning Board holder. På grund af lysfølsomheds problemer kan den reflekterende objekt sensor kalibreres ved installation, så den passer til laboratoriets belysningsmiljø. Hver mus bur er placeret på Auto-Trainer sådan, at pellet indvendige kant er i overensstemmelse med den ydre kant af burgat's slot, svarende til trin 2.3.4 af den manuelle procedure beskrevet ovenfor. To tabte pellet sensorer orienteret i modsatte retninger i en tragt under dykker brættet pellet holder opdage faldende pellets. En fordel ved at ansætte to tabte pellet sensorer er, at det sikrer høj detekterings nøjagtighed for forskellige fødevare piller i forskellige størrelser og former. Begge mistede pellet sensorer består af en standard over givende foto-interrupter med en gennem-hul design, at fornemme bevægelsen af en faldende pellet uden at kræve kontakt.
Softwaren består af et program, der kører Auto-træner og indsamler data om succeser og fiaskoer. Brugerinput består af den fil placering, hvor dataene er registreret, hvor mange pellets er dispenseret i en træning session, en mulighed for at pause træningssession efter dispensering en bestemt pellet, et felt til at registrere den øgede afstand (hvis nogen), som musen skal nå, og et felt til at styre array størrelse, der anvendes i programmets beregninger (som kan ignoreres under normal brug). Yderligere, softwaren gør det muligt for brugeren at tune dykker brættet reflekterende objekt sensor for at kalibrere lysfølsomhed efter behov. Et output af hvert forsøg vises til brugeren samt registreres og gemmes i en logfil til senere hentning.
Et enkelt forsøg består af en enkelt madpellet tid brugt på dykker brættet, indtil det fjernes ved handling fra musen. Hvis en pellet forlader dykker brættet som bestemt af agn pellet sensoren, og pellet detekteres falder gennem tragten kort efter af en af de tabte pellet sensorer, det er registreret som en mislykket retssag af softwaren. Hvis agn pellet sensoren afgør, at pellet forlader dykker brættet, men ingen faldende objekt detekteres af en af de tabte pellet sensorer, antages det at have været trukket ind i buret ved musen og tælles som en vellykket retssag.
Denne formulering anvendes, fordi det er nyttigt at designe en adfærdsmæssig analyse, hvor opgaven at udføre direkte, snarere end indirekte, giver belønningen. På denne måde, er der ingen tvetydighed om dyrets del om, hvad opgaven er (f. eks, være sulten, finde mad, få mad, spise mad). Blandt de mange opgaver, der udnytter et sådant paradigme, er den omfattende opgave blevet meget populært for sådanne vurderinger. Opgaven kræver blot, at et dyr bruger et enkelt led til at nå frem til og forstå en enkelt fødevare, som dyret efterfølgende bringer til sin mund til konsum. Den omfattende opgave vurderer en adfærd, der er meget lig en dagligdags adfærd, der anvendes af mange pattedyr. Vigtigst af alt, den omfattende opgave ligner menneskelig motorisk adfærd4. Denne generaliserbarhed øger forventningen om, at principper afledt af den prækliniske vurdering af adfærden er klinisk gældende i sygdomstilstande. For eksempel ses nedskrivninger på faglært forbimb og hånd brug i slagtilfælde, Huntingtons sygdom, Parkinsons sygdom og multipel sklerose. Således modellering adfærdsmæssige underskud og efterfølgende opsving i mus er uvurderlig for at forstå menneskelig genopretning og hvordan det kan fremmes2,11,12,13.
Mange aspekter af Auto-Trainer foreslået heri i høj grad gavne forsknings processen. Første, de fleste adfærdsmæssige assays kræver en eksperimententer til nøje at træne og overvåge daglige sessioner, som kan være dyrt, arbejdskraftintensive og uoverkommeligt tidskrævende. Vores Auto-træner giver mulighed for adfærdsmæssige data, der skal indsamles uafhængigt af en eksperimententer. For det andet kan vores Auto-træner replikeres til at tillade flere mus til at blive uddannet og evalueret objektivt, effektivt og samtidigt, hvilket minimerer tid og kræfter. For det tredje, de lave omkostninger ved auto-Trainer tillader replikering og brug af flere Auto-trænere samtidig for stor skala og effektiv testning.
Det skal bemærkes, at det kritiske punkt, der kræver omhyggelig overvågning er under udformningen fase af uddannelsen. Især denne protokols vigtigste svaghed er risikoen for dårlig brug bliver rettet i nogle mus11. Protokollen har til formål at efterligne tests som stigen Rung test i at lykkes i opgaven giver belønningen. Men opgaven selv skal stadig undervises til musene i trin 2,3 i protokollen, i modsætning til stigen Rung test. Konceptet mest tilbøjelige til at forårsage en mus til at snuble i at lære denne opgave er fra at udvide en pote ud af buret til at bruge pote til rent faktisk at forstå pellet. I det første møde i trin 2.3.1, bør mus belønnes simpelthen for at udvide en pote ud af deres bur. Men i løbet af de følgende par dage, bør efterforskere sørge for at belønne mus mindre for blot at forlænge pote, og mere for at udvide pote og røre pellet, som vi beskriver i trin 2.3.3.
Bemærk, at ca. 5% af musene ikke vil gøre fremskridt på dette stadie, typisk på grund af begrænset forlængelse af deres cifre for at trække i fødevare pellet. Sådanne mus vil mislykkes med en eller begge poter med ringe hensyntagen til den faktiske placering af pellet, der giver lidt eller ingen nyttige data. For at minimere en musens potentiale for fiasko på dette tidspunkt, anbefales det kraftigt, når du trækker pellet med pincet under læringsprocessen. Især bør musen belønnes med mad, ikke kun når det udvider en pote, men også når den pote greb pellet og anvender nok kraft til investigators tilfredshed. En lignende risiko for potentiel fiasko på dette stadium er stillet af mus, der bruger deres tunge til at slikke pellets mod dem. Når du træner mus, der har tendens til at slikke, skal du placere pellet yderligere sideværts væk fra åbningen. Mus vil finde det vanskeligt at nå med tungen over en større sidelæns afstand, men rækken af bevægelse af armen og pote er mere i stand til at lukke afstanden.
Vores beskrevne protokol er let udvidet til forskellige laboratoriemiljøer eller forskellige metoder til dataindsamling. Auto-træner, for eksempel, er meget nyttigt som en arbejdsbesparende enhed, men er ikke strengt nødvendigt for dataindsamling, som pellets kan leveres og succeser/fiaskoer kan registreres i hånden. Individuelle når kan også kategoriseres baseret på mere detaljerede oplysninger end blot succes/fiasko, for eksempel ved at overveje vinklen af tilgangen af hver mus, antallet af nå forsøg, der ikke rører pellet, eller mekanik af hentning bevægelse, som har fået større opmærksomhed i de seneste år14. Dyrets evne til at hente en pellet er kun én foranstaltning. Ved hjælp af ekstra hardware, vil vi også være i stand til at måle hastighed, vinkel, og bane af dyrets lemmer bevægelser. Denne kinematik er et vigtigt aspekt af motorisk indlæring både før og efter en neurologisk skade. Til dette formål er vi i øjeblikket indarbejde forskellige nye midler til at analysere bevægelse og kinematik af musens greb handling. Vi udforsker ved hjælp af højhastigheds kameraer for at opnå kinematiske målinger af rækkevidde og fastgørelse af Tryktransducere og accelerometre til madpellet holderen for at måle kraft-og masse data, der er forbundet med rækkevidde. Disse nye funktioner vil forbedre funktionaliteten af Auto-træner til at indsamle betydelige data bestået en simpel pass eller mislykkes retssag og hjælpe med at illustrere gangart af musens greb gennem sygdomsprogression. I fremtiden vil vi bruge robot assisteret tilladsion opgave som en platform til at evaluere type, dosis, og timing af rehabilitering efter Neurologiske skader. Bevæger sig fremad, vil vi fortsætte med at forbedre opgaven, med justeringer for at hjælpe med at mindske forkert adfærd og forbedre opgaven erhvervelse sats og uddannelse tid.
Sammenfattende har vi udviklet en ny Auto-træner til vurdering af øvre forbimb-evner i mus. Opgaven kræver mus til at nå deres pote gennem en spalte, gribe en lille mad pellet, og trække pellet i retning af deres krop, så de kan spise pellet. Opgave opsætningen er mekanisk begrænset til at sikre dominerende pote brug. Mus kan trænes hurtigt og samtidigt, med kun formningsprocessen kræver manuel input. Testen kan administreres effektivt og analyseres automatisk. Denne høje gennemløb adfærdsmæssige analyse kvantificerer succesrate og er let modificeret til fremtidig analyse af kinematik og kraft dynamik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dan Tasch og URI Tasch af trin analyse, LLC har fremstillet Auto-Trainer enhed med betaling fra Richard J. O'Brien og Steven R. Zeiler.
Acknowledgments
Auto-Training-enheden blev konstrueret af Jason Dunthorn, URI Tasch og Dan Tasch at Step Analysis, LLC, med design input support og instruktioner fra Robert Hubbard, Richard O'Brien og Steven Zeiler.
Teresa Duarte fra Champalimaud-centret for det ukendte gav værdifuld indsigt og ideer til at beskrive og kategorisere musehandlinger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABS Filament | Custom 3D Printed | N/A | utilized for pellet holder, frame, arm and funnel |
| ABS Sheet | McMaster-Carr | 8586K581 | 3/8" thickness; used for platform compononents, positioning stand guides and base |
| Adruino Mini | Adruino | A000087 | nano version also compatiable as well as other similar microcontrollers |
| Bench-Top Adjustable-Height Positioning Stand | McMaster-Carr | 9967T43 | 35 lbs. load capacity |
| Clear Acrylic Round Tube | McMaster-Carr | 8532K14 | ID 3/8" |
| Low-Carbon Steel Wire | McMaster-Carr | 8855K14 | 0.148" diameter |
| Pellet Dispenser | Lafayette Instrument: Neuroscience | 80209-45 | with 45 mg interchangeable pellet size wheel and optional stand |
| Photointerrupter Breakout Board | SparkFun | BOB-09322 ROHS | designed for Sharp GP1A57HRJ00F |
| Reflective Object Sensor | Fairchild Semiconductor | QRD1113 | phototransistor output |
| Servo Motor | SparkFun | S8213 | generic metal gear (micro size) |
| Transmissive Photointerrupter | Sharp | GP1A57HRJ00F | gap: 10 mm, slit: 1.8 mm |
References
- Whishaw, I. Q. An endpoint, descriptive, and kinematic comparison of skilled reaching in mice (mus musculus) with rats (rattus norvegicus). Behavior Brain Research. 78, 101-111 (1996).
- Farr, T. D., Whishaw, I. Q. Quantitative and qualitative impairments in skilled reaching in the mouse (mus musculus) after a focal motor cortex stroke. Stroke. 33, 1869-1875 (2002).
- Zeiler, S. R., Krakauer, J. W. The interaction between training and plasticity in the poststroke brain. Current Opinion in Neurology. 26, 609-616 (2013).
- Klein, A., Sacrey, L. A., Whishaw, I. Q., Dunnett, S. B. The use of rodent skilled reaching as a translational model for investigating brain damage and disease. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36, 1030-1042 (2012).
- Zeiler, S. R., et al. Medial premotor cortex shows a reduction in inhibitory markers and mediates recovery in a mouse model of focal stroke. Stroke. 44, 483-489 (2013).
- Becker, A. M., Meyers, E., Sloan, A., Rennaker, R., Kilgard, M., Goldberg, M. P. An automated task for the training and assessment of distal forelimb function in a mouse model of ischemic stroke. Journal of Neuroscience Methods. 258, 16-23 (2016).
- Bruinsma, B., et al. An automated home-cage-based 5-choice serial reaction time task for rapid assessment of attention and impulsivity in rats. Psychopharmacology. , 1-12 (2019).
- Francis, N. A., Kanold, P. O. Automated operant conditioning in the mouse home cage. Frontiers in Neural Circuits. 11 (10), (2017).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 43, 42-51 (2004).
- Fenrich, K. K., et al. Improved single pellet grasping using automated ad libitum full-time training robot. Behavior Brain Research. 281, 137-148 (2015).
- Ng, K. L., et al. Fluoxetine maintains a state of heightened responsiveness to motor training early after stroke in a mouse model. Stroke. 46 (10), 2951-2960 (2015).
- Whishaw, I. Q., Suchowersky, O., Davis, L., Sarna, J., Metz, G. A., Pellis, S. M. Impairment of pronation, supination, and body co-ordination in reach-to-grasp tasks in human parkinson's disease (pd) reveals homology to deficits in animal models. Behavior Brain Research. 133, 165-176 (2002).
- Dobrossy, M. D., Dunnett, S. B. The influence of environment and experience on neural grafts. Nature Review Neuroscience. 2, 871-879 (2001).
- Alaverdashvili, M., Foroud, A., Lim, D. H., Whishaw, I. Q. "Learned baduse" limits recovery of skilled reaching for food after forelimb motor cortex stroke in rats: A new analysis of the effect of gestures on success. Behavior Brain Research. 188, 281-290 (2008).
