이 문서에서는 주어진 환자에게서 다른 견본 중 클론 및 subclonal 변경을 확인하는 방법을 설명합니다. 여기에서 기술된 실험은 특정 종양 모형에 집중하더라도, 접근은 그밖 고형 종양에 광범위하게 적용가능하다.
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이 논문에서
요약
초록
종양 내 이질성 (ITH)을 평가하는 것은 표적으로 한 치료의 실패를 예상하고 그에 따라 효과적인 항 종양 전략을 디자인하기 위하여 가장 중요합니다. 시료 처리 및 커버리지 의 깊이의 차이로 인해 우려가 자주 제기되지만, 고형 종양의 차세대 시퀀싱은 종양 유형 전반에 걸쳐 매우 가변적인 ITH 정도를 해명했습니다. 클론 및 전이성 집단의 식별을 통해 1 차 및 전이성 병변 사이의 유전 적 관련성을 포착하는 것은 사전 단계 질병에 대한 치료법의 설계에 매우 중요합니다. 여기에서, 우리는 동일 환자에서 다른 견본 중 클론 과 subclonal 인구의 확인을 허용하는 비교 병변 분석을 위한 방법을 보고합니다. 여기에서 기술된 실험적인 접근은 세 개의 잘 확립된 접근을 통합합니다: 조직학 분석, 고범위 다중 병변 염기 서열 분석 및 면역 표현형 분석. 부적절한 시료 처리에 의한 소동 적 사건 의 검출에 미치는 영향을 최소화하기 위해, 우리는 신중한 병리학 검사와 신 생물 세포 농축에 조직을 실시했다. 신생물 병변 및 정상 조직으로부터의 품질 조절 DNA는 409개의 관련 암 유전자의 코딩 영역을 표적으로 하는 높은 커버리지 시퀀싱을 실시하였다. 제한된 게놈 공간만을 보는 동안, 우리의 접근은 주어진 환자에게서 명백한 병변에 있는 체세포 변경 (단 핵약 돌연변이 및 사본 수 변이) 중 이질성의 정도를 평가할 수 있습니다. 시퀀싱 데이터의 비교 분석을 통해 클론 과 하위 클론 변경을 구별할 수 있었습니다. ITH의 대다수는 수시로 승객 돌연변이에 기인합니다; 그러므로, 우리는 또한 돌연변이의 기능적인 결과를 예측하기 위하여 면역성 화학을 이용했습니다. 이 프로토콜은 특정 종양 모형에 적용되는 동안, 우리는 여기에서 기술된 방법론이 그밖 고형 종양 모형에 광범위하게 적용가능하다는 것을 예상합니다.
서론
차세대 염기서열 분석(NGS)의 출현은 암이 진단되고 치료되는 방식에 혁명을 일으켰습니다1. 다국지 시퀀싱에 결합된 NGS는 고형 종양2에서고종양 내 이질성(ITH)의 높은 정도를 노출시켰으며, 이는 부분적으로 다른 약물 민감성을 가진 서브클론의 존재로 인한 표적 치료의 실패를 설명한다2 . 게놈 전체 시퀀싱 연구에 의해 제기 된 중요한 도전은 개별 적인 암에 있는 승객 (즉, 중립) 및 드라이버 돌연변이 를 구별하는필요성입니다 3. 몇몇 연구 결과는 실제로, 특정 종양에서, 승객 돌연변이가 ITH의 대다수를 차지한다는 것을 보여주었습니다, 운전사 변경은 동일 개별의 병변 중 보존되는 경향이 있는 동안4. 또한 큰 돌연변이 부담 (폐암 및 흑색종에서 볼 수 있듯이)이 반드시 큰 종하 돌연변이 부담을 의미하지는 않는다는 것을 주의하는 것이 중요합니다2. 따라서, 높은 수준의 ITH는 낮은 돌연변이 부담을 가진 종양에서 발견될 수 있다.
전이는 전 세계적으로 암....
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프로토콜
연구에 사용된 자료는 특정 프로토콜에 따라 수집되었으며, 이는 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 환자로부터 서면 으로 통보 된 동의가 가능했습니다.
1. 조직 표본의 조직학적 및 면역적 전형적 개정
참고 : 전문 병리학자는 이후에 설명 된 활동에 대한 책임이 있습니다.
- 잘 확립 된 진단 기준에 따라 선택된 경우의 조직 병리학 적 개정.
- 마이크로토메를 사용하여 대표적인 FFPE 조직 블록에서 4−5 μm 두께의 조직 섹션을 절단하고 표준 조직학 슬라이드에 섹션을 장착하십시오.
- 자동화 된 조직 슬라이드 염색기(재료 표)를사용하여 각 슬라이드에 대해 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행합니다.
- WHO 진단 기준에 따라 선택된 종양 케이스의 조직 병리학 적 진단을 검토하십시오.
참고: 이 단계에서, 병리학자는 동일 조직 단면도 내의 종양의 형태학적으로 명백한 지역을 확인할 수 있습니다. 해당 영역을 별도로 수확할 수 있습니다(섹션 2 참조). SPN에 대한 종양 및 정상 세포의 조직학적 유사성은 그림 2에제공된다. - ....
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결과
스터디 워크플로는 그림 1에나와 있습니다. 409개의 암 관련 유전자의 코딩 서열을 표적으로 하는 5개의 SPN 케이스의 다중 병변 (n=13) 염기서열 분석은 8개의 유전자에서 총 27개의 체세포 돌연변이를확인하였다(CTNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1및 FGFR3). 돌연변이는 주어진 환자의 모든 병변 사이에서 공유될 때 창립자/클로날로 정의되었고, 주어진 환자의 모든 병변에서 검출될 때 진행자/소클레날(subclonal)으로 정의되었다(그림5A,B). 전반적으로, 코호트에 걸쳐 확인된 점 돌연변이의 대다수는 CTNNB1, KDM6A, TET1 및 FLT1의돌.......
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토론
우리의 방법은 주어진 환자의 별개의 병변에서 수직 데이터 (즉, 형태학, DNA 염기서열 분석 및 면역 조직 화학)의 통합을 통해 고형 종양의 진행에 관여하는 분자 변이를 식별 할 수 있습니다. 우리는 409개의 암 관련 유전자8의 코딩 서열을 심문하여 돌연변이 침묵 종양 유형(즉, SPN, 췌장의 고체-가성세포 신생물)에서 클론 및 하부 클론 이벤트를 검출하는우리의 방법의 능력을 입증하였다. 여기서 사용되는 앰플리코 기반 표적 시퀀싱 접근법의 장점은 1000x의 전형적인 평균 커버리지 깊이에서 심문 된 영역 (15,992)에 걸쳐 커버리지 (90 % 표적 염기는 100x, 95 %는 20 배 커버)의 균일성입니다. 미세 해부를 통한 신생물 세포 농축에 결합된 높은 커버리지 커버리지는 낮은 대문자 주파수 이벤트를 검출하기 위한 높은 감도를 보장합니다. 우리가 이전에9를보여주었듯이, 표적으로 한 순서 는 FFPE 조직에서 DNA 견본에 2% ee.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없다.
감사의 글
연구 결과는 이탈리아 암 게놈 프로젝트 (그랜트 번호)에 의해 지원되었습니다. FIRB RBAP10AHJB), 아소시아지오네 이탈리아나 리케르카 칸크로 (AIRC; 그랜트 번호 12182 에 AS 와 18178 VC), FP7 유럽 공동체 보조금 (캠 팩 No 602783 에 AS). 자금 조달 기관은 데이터의 수집, 분석 및 해석또는 원고 작성에 아무런 역할을하지 않았다.
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참고문헌
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