표적 시퀀싱 접근법을 통한 비교 병변 분석

요약

이 문서에서는 주어진 환자에게서 다른 견본 중 클론 및 subclonal 변경을 확인하는 방법을 설명합니다. 여기에서 기술된 실험은 특정 종양 모형에 집중하더라도, 접근은 그밖 고형 종양에 광범위하게 적용가능하다.

초록

종양 내 이질성 (ITH)을 평가하는 것은 표적으로 한 치료의 실패를 예상하고 그에 따라 효과적인 항 종양 전략을 디자인하기 위하여 가장 중요합니다. 시료 처리 및 커버리지 의 깊이의 차이로 인해 우려가 자주 제기되지만, 고형 종양의 차세대 시퀀싱은 종양 유형 전반에 걸쳐 매우 가변적인 ITH 정도를 해명했습니다. 클론 및 전이성 집단의 식별을 통해 1 차 및 전이성 병변 사이의 유전 적 관련성을 포착하는 것은 사전 단계 질병에 대한 치료법의 설계에 매우 중요합니다. 여기에서, 우리는 동일 환자에서 다른 견본 중 클론 과 subclonal 인구의 확인을 허용하는 비교 병변 분석을 위한 방법을 보고합니다. 여기에서 기술된 실험적인 접근은 세 개의 잘 확립된 접근을 통합합니다: 조직학 분석, 고범위 다중 병변 염기 서열 분석 및 면역 표현형 분석. 부적절한 시료 처리에 의한 소동 적 사건 의 검출에 미치는 영향을 최소화하기 위해, 우리는 신중한 병리학 검사와 신 생물 세포 농축에 조직을 실시했다. 신생물 병변 및 정상 조직으로부터의 품질 조절 DNA는 409개의 관련 암 유전자의 코딩 영역을 표적으로 하는 높은 커버리지 시퀀싱을 실시하였다. 제한된 게놈 공간만을 보는 동안, 우리의 접근은 주어진 환자에게서 명백한 병변에 있는 체세포 변경 (단 핵약 돌연변이 및 사본 수 변이) 중 이질성의 정도를 평가할 수 있습니다. 시퀀싱 데이터의 비교 분석을 통해 클론 과 하위 클론 변경을 구별할 수 있었습니다. ITH의 대다수는 수시로 승객 돌연변이에 기인합니다; 그러므로, 우리는 또한 돌연변이의 기능적인 결과를 예측하기 위하여 면역성 화학을 이용했습니다. 이 프로토콜은 특정 종양 모형에 적용되는 동안, 우리는 여기에서 기술된 방법론이 그밖 고형 종양 모형에 광범위하게 적용가능하다는 것을 예상합니다.

서론

차세대 염기서열 분석(NGS)의 출현은 암이 진단되고 치료되는 방식에 혁명을 일으켰습니다^1. 다국지 시퀀싱에 결합된 NGS는 고형 종양^2에서고종양 내 이질성(ITH)의 높은 정도를 노출시켰으며, 이는 부분적으로 다른 약물 민감성을 가진 서브클론의 존재로 인한 표적 치료의 실패를 설명한다² . 게놈 전체 시퀀싱 연구에 의해 제기 된 중요한 도전은 개별 적인 암에 있는 승객 (즉, 중립) 및 드라이버 돌연변이 를 구별하는^{필요성입니다 3.} 몇몇 연구 결과는 실제로, 특정 종양에서, 승객 돌연변이가 ITH의 대다수를 차지한다는 것을 보여주었습니다, 운전사 변경은 동일 개별의 병변 중 보존되는 경향이 있는 동안^4. 또한 큰 돌연변이 부담 (폐암 및 흑색종에서 볼 수 있듯이)이 반드시 큰 종하 돌연변이 부담을 의미하지는 않는다는 것을 주의하는 것이 중요합니다^2. 따라서, 높은 수준의 ITH는 낮은 돌연변이 부담을 가진 종양에서 발견될 수 있다.

전이는 전 세계적으로 암 관련 죽음의 90% 이상에 책임 있습니다^5; 그러므로, 1 차및 전이성 병변 중 드라이버 유전자의 돌연변이 이질성을 포착하는 것은 고급 단계 질병을 위한 효과적인 치료의 디자인에 중요합니다. 임상 시퀀싱은 일반적으로 고정 된 조직에서 핵산에 수행, 때문에 가난한 DNA 품질의 게놈 전체 탐사 어려운 렌더링. 다른 한편으로는, 임상 순서의 의도는 주어진 치료 식이요법에 응답성/무반응을 예측할 수 있는 실행 가능한 돌연변이 및/또는 돌연변이를 확인하는 것입니다. 시퀀싱은 임상적으로 관련된 정보를 적시에 추출하기 위해 게놈의 작은 분획으로 제한될 수 있습니다. 낮은 처리량의 DNA 프로파일링(예: Sanger Sequencing)에서 NGS로의 전환은 수백 개의 암 관련 유전자를 높은 범위의 범위에서 분석할 수 있게 하여 종전 이벤트를 검출할 수 있게 합니다. 여기에서, 우리는 동일 개별에게서 다른 견본 중 클론 과 subclonal 인구의 확인을 허용하는 비교 병변 분석을 위한 방법을 보고합니다. 여기에 설명된 방법은 세 가지 잘 확립된 접근법(조직학적 분석, 고커버리지 다중 병변 염기 서열 분석 및 면역 표현형 분석)을 통합하여 확인된 변이의 기능적 결과를 예측합니다. 접근법은 도 1에 개략적으로 설명되고 췌장의 고체 가성 신생물(SPN)의 5가지 전이성 사례의 연구에 적용되었다. 우리는 포르말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 견본의 처리 그리고 분석을 기술하는 동안, 동일 절차는 신선한 동결 조직에서 유전 물질에 적용될 수 있습니다.

프로토콜

연구에 사용된 자료는 특정 프로토콜에 따라 수집되었으며, 이는 지역 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 환자로부터 서면 으로 통보 된 동의가 가능했습니다.

1. 조직 표본의 조직학적 및 면역적 전형적 개정

참고 : 전문 병리학자는 이후에 설명 된 활동에 대한 책임이 있습니다.

1. 잘 확립 된 진단 기준에 따라 선택된 경우의 조직 병리학 적 개정.
   1. 마이크로토메를 사용하여 대표적인 FFPE 조직 블록에서 4−5 μm 두께의 조직 섹션을 절단하고 표준 조직학 슬라이드에 섹션을 장착하십시오.
   2. 자동화 된 조직 슬라이드 염색기(재료 표)를사용하여 각 슬라이드에 대해 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행합니다.
   3. WHO 진단 기준에 따라 선택된 종양 케이스의 조직 병리학 적 진단을 검토하십시오.
      참고: 이 단계에서, 병리학자는 동일 조직 단면도 내의 종양의 형태학적으로 명백한 지역을 확인할 수 있습니다. 해당 영역을 별도로 수확할 수 있습니다(섹션 2 참조). SPN에 대한 종양 및 정상 세포의 조직학적 유사성은 그림 2에제공된다.
   4. 조직학적 분석을 보완하고 면역 phenotypic 이질성을 추정하기 위해 확립 된 마커에 대한 면역 조직 화학 염색을 수행합니다.
      참고: 병리학자는 동일 조직 단면도 내의 종양의 전형적으로 명백한 지역을 면역pheno를 확인할 수 있습니다. 해당 영역을 별도로 수확할 수 있습니다(섹션 2 참조).
2. 종양 조직 섹션의 신가소성 셀룰러를 평가하고 그에 따라 수동 미세 해부를 계획합니다.
   참고: 이것은 종양 세포의 병리학 생성 한 추정입니다.
   1. 조직 섹션의 신생물 세포 함량이 70 % 이상이면 수동 미세 해부가 필수적이지 않습니다. 3.1단계로 바로 이동합니다.
      참고: (i) 돌연변이 대립 유전자 주파수 추정에 대한 적절한 감도를 보장하고 (ii) 덜 민감한 방법론(예를 들어, 모세관 시퀀싱)에 의해 클론 돌연변이를 검증하기 위해 신생물 세포 함량의 70%를 타겟팅합니다.
   2. 조직 섹션의 신생물 세포 함량이 70 % 미만이면 미세 해부가 필요하며 2 단계로 이동합니다.
3. 비 신생물 조직이 샘플링 된 FFPE 블록에서 조직 섹션을 평가하십시오. 이 조직은 생식선 DNA의 근원으로 이용됩니다.
   참고: 혈액은 생식선 DNA의 대체 공급원입니다. 이 경우, 4.1단계의 노트에서 권장되는 대로 DNA 추출을 진행한다.
   1. 비 신생물 조직만 조직 섹션(그림 2D)에서볼 수있는 경우, 수동 미세 절제술이 필요하지 않습니다. 3.1단계로 바로 이동합니다.
   2. 신생물 세포에서 상당한 오염이 조직 섹션에 존재하는 경우, 수동 미세 해부가 필요합니다. 섹션 2로 이동합니다.

2. 수동 미세 해부

참고 : 이 방법은 다양한 고형 종양 유형에 적용 가능하며 조직 표본의 신생물 세포 함량을 증가시키기위한 것입니다. 대안적으로, 이 방법은 형태학적으로 및/또는 면역페노전형적으로 동일한 조직 섹션 내의 별개의 영역을 수확하는데 사용될 수 있다.

1. 마이크로토메를 사용하여 최대 10개의 4-6 μm 두께의 FFPE 종양 조직 부분을 잘라내고 충전되지 않은 슬라이드에 장착합니다.
   참고 : 암 세포의 1mm² 둥지가 표본에서 볼 수있는 경우, 10 개의 조직 슬라이드를 절단하고 DNA (40 ng)의 표적 량을 얻기 위해 수동 미세 해부를 실시해야합니다. 이것은 1 mm² 클러스터가 700과 1000 종양 핵 사이를 포함한다는 것을 가정합니다.
2. 60 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.
3. 슬라이드를 랙에 놓고 20 분 동안 자일렌, 10 분 동안 100 % 에탄올, 10 분 동안 80 % 에탄올, 10 분 동안 70 % 에탄올, 1 0 분 동안 증류수, 10 s의 헤마톡실린 카운터 스테인, 1 분 동안 수돗물을 하십시오.
4. 표준 반전 현미경에, 현미경 으로 주사기에 27 G 바늘을 사용 하 고 종양 세포의 대표 클러스터를 수집. 시퀀싱에 필요한 양의 DNA를 보장하기 위해 최소 1mm² 세포 군집을 수확합니다.
   참고: 형태학적으로 구별되는 영역을 다른 개체로 분석하려는 경우 미세 해부 도구를 사용하여 해당 영역을 별도로 수확합니다.
5. 이전에 프로테아제 K 20 μL과 용해 완충액 180 μL로 채워진 1.5 mL 튜브(재료 표)에수확 한 클러스터를 놓고 소용돌이에 의해 혼합하십시오.

3. 사전 미세 해부없이 조직 처리

참고 : 이 절차는 비 신생물 세포 (생식선 DNA의 근원)만 포함하거나 형태학적으로 균질한 암세포의 적어도 70 %를 포함하는 조직 블록에 사용됩니다.

1. 선택된 FFPE 조직 블록으로부터 최대 6개의 4-5 μm 두께의 조직 절편을 마이크로토메를 사용한다. 2.5단계에서 설명한 대로 조직 두루마리를 1.5 mL 튜브에 놓습니다.

4. 정상 및 신생물 세포에서 DNA 추출

1. 제조업체의 지시에 따라 DNA FFPE 조직 추출 키트(재료 표)를사용하여 정상 및 신생물 조직에서 DNA를 정화합니다.
   참고 : 혈액이 생식선 핵산의 공급원으로 사용되는 경우 DNA 혈액 추출 키트(재료 표)를사용하여 DNA를 정화하십시오.
2. DNA 정량화 및 품질 검사
   1. 이중 가닥(dsDNA)의 양을 정량화하기 위해 형광 핵산얼룩(물자 표)을함유하는 용액에 DNA 샘플의 aliquot를 추가하고 벤치탑 형광계를 사용하여 방출된 형광을 측정합니다(재료표) ).
      참고: 이 분석은 dsDNA에 부착된 형광 염료에서 방출되는 형광 신호의 강도를 측정하고 표준 곡선을 사용하여 DNA의 양을 결정합니다.
   2. 마이크로볼륨 분광광도계(재료표)를사용하여 DNA를 검증하기 위해 시료의 260/280 및 260/230 비율을 측정합니다. "순수한" DNA는 1.8의 260/280및 1.8−2.2의 범위에 있는 260/230이 있어야 합니다.
      참고: 시료의 분광도 측정 평가는 하류 반응에 영향을 미치는 화학 적 오염 물질 (예 : 페놀)의 존재를 입증하기위한 것입니다. 화학 시약으로 인한 오염의 경우 컬럼 기반 키트를 사용하여 정화 단계를 수행합니다.

5. 도서관 준비 및 정량화

참고: 라이브러리 준비 및 정량화 단계의 회로도는 그림 3에보고됩니다.

1. DNA 라이브러리 준비 (각 샘플에 대해 설정 된 4 프라이머 풀)
   참고 : 4 프라이머 풀은보고 암 패널에 속한다재료 표. 각 풀에는 409개의 유전자의 다중화 표적 선택을 위해 설계된 프라이머 쌍이 포함되어 있습니다. NGS 패널을 구성하는 유전자 목록에 대한 링크가 제공됩니다.재료 표.
   1. 프라이머 풀당 하나씩 각 샘플에 대해 4개의 DNA 표적 증폭 반응을 준비합니다. 각 프라이머 풀(재료 표)에대해 0.2 mL 튜브(재료 표)4 μL의 마스터 믹스(재료 표,라이브러리 키트에 포함), 10 μL의 고충실도 프라이머 풀 믹스(재료 표,포함) 암 패널 라이브러리), DNA의 6 μL (총 10 ng).
   2. 다음 프로그램을 실행하는 4개의 1.5 mL 튜브에서 각 프라이머 풀의 대상 영역을 별도로 증폭: 2분 동안 99°C에서 홀드(핫 스타트 폴리머라제의 활성화), 16사이클(15s의 경우 99°C에서 변성, 어닐레및 60°C에서 8분 동안 연장) , 4 °C에서 유지합니다.
      참고: 중지 지점. 대상 증폭 반응을 하룻밤 동안 4°C 또는 -20°C에서 장시간 저장합니다.
   3. 앰플리온 의 부분 소화 끝
      참고: NGS 제조업체 키트에서 제공하는 설명서는 부분 소화 전에 각 샘플의 다양한 증폭 반응이 결합되는 단계를 예견합니다. 이 단계를 피하고 각 증폭 소화를 별도로 처리하십시오.
      1. 각 샘플의 각 증폭 풀에 특정 소화혼합(재료 표,라이브러리 키트에 포함됨)의 2 μL을 추가합니다(각 0.2 mL 튜브의 총 부피는 22μL입니다). 소용돌이 철저하게 각 튜브를 원심 분리하여 물방울을 수집합니다.
      2. 튜브를 열 사이클러에 로드하고 다음 프로그램을 실행합니다: 10분 동안 50°C, 10분동안 55°C, 20분동안 60°C, 10°C 홀드(최대 1시간).
         참고: 중지 지점. 플레이트를 -20°C에서 장시간 보관하십시오.
   4. 앰플리톤과 정화에 리게이트 어댑터.
      참고: 단일 칩에서 여러 라이브러리를 시퀀싱할 때 각 샘플에 대해 다른 바코드 어댑터를 사용합니다. 동일한 샘플의 4가지 증폭 반응은 모두 동일한 바코드를 수신해야 합니다.
      1. 어댑터 준비(재료 표,바코드 어댑터 키트). 각 바코드 X에 대해 P1 어댑터와 고유한 바코드 어댑터(재료표)를1:4의 최종 희석시 에 혼합하여 준비합니다. 물 4 μL을 P1 어댑터 2 μL과 독특한 바코드 어댑터 2 μL과 혼합합니다. 다운스트림 통로에는 이 바코드 어댑터 믹스의 2 μL을 사용합니다.
      2. 각 시료의 각 증폭풀에 이 순서대로 합리반응을 수행한다: 스위치 용액 4μL(재료표,라이브러리 키트에 포함), 바코드 어댑터 믹스 2 μL 및 DNA 리가제 2 μL(재료표, 포함) 라이브러리 키트) (총 볼륨 = 30 μL).
      3. 소용돌이철분과 짧은 원심분리기는 물방울을 수집합니다.
      4. 각 튜브를 열 사이클러에 로드하고 다음 프로그램을 실행합니다: 30분 동안 22°C, 5분 동안 68°C, 5분 동안 72°C, 4°C 홀드(최대 24시간).
         참고: 중지 지점. 플레이트를 -20°C에서 장시간 보관하십시오.
   5. 라이브러리 정화 및 증폭
      1. 각 튜브를 원심분리하고 각 바코드 샘플을 1.5 mL 튜브로 옮김을 옮김을 전송합니다. 각 시료의 각 풀에 45 μL의 비드 계 정제 시약(재료표)을추가합니다. 비드 현탁액을 DNA와 혼합하기 위해 5배 위아래로 피펫을 피펫합니다.
      2. 실온 (RT)에서 5 분 동안 혼합물을 배양 한 다음 각 튜브를 자기 랙에 넣고 2 분 동안 배양하십시오.
      3. 각 튜브에 신선한 70 % 에탄올150 μL을 추가하십시오. 각 튜브를 자석의 두 위치의 좌우로 움직이는 구슬을 세척합니다. 상급자를 버리고 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오.
      4. 5.1.5.3 단계에서 설명된 절차를 반복한 다음 튜브를 자석에 넣고 5분 동안 RT에서 구슬을 공기 건조시.
      5. 자석에서 각 프라이머 풀의 정제 된 라이브러리와 튜브를 제거하고 고충실도 PCR 믹스(재료 표)의50 μL과 라이브러리 증폭 프라이머 믹스 2 μL을 추가(재료표,라이브러리 키트에 포함) 구슬 펠릿에 각 튜브.
      6. 소용돌이 각 1.5 mL 튜브 및 잠시 원심 분리기를 물방울을 수집합니다.
      7. 1.5 mL 튜브를 자석에 2 분 동안 놓고 각 튜브에서 상층부 (~ 50 μL)를 펠릿을 방해하지 않고 새로운 0.2 mL 튜브로 조심스럽게 옮니다.
      8. 다음 프로그램을 실행하는 각 프라이머 풀의 라이브러리를 증폭: 효소를 활성화하기 위해 2 분 동안 98 °C에서 홀드, 5 사이클 (15 s에 대한 98 °C에서 변성, 어닐및 64 °C에서 연장 1 분), 4 °C에서 유지. 샘플을 -20°C에서 보관합니다.
   6. 증폭 된 라이브러리의 정화
      1. 각 튜브를 원심분리기하여 하단에 있는 내용물들을 수집하고 각 증폭된 라이브러리 샘플을 1.5 mL 튜브로 옮김을 전송한다.
      2. 25 μL의 비드 계 정제 시약을 첨가하십시오. 비드 현탁액을 DNA와 혼합하기 위해 5배 위아래로 피펫을 피펫합니다.
      3. RT에서 5 분 동안 혼합물을 인큐베이션 한 다음 튜브를 자석에 5 분 동안 넣습니다.
      4. 앰플리컨이 들어있는 상급체를 각 튜브에서 펠릿을 방해하지 않고 새로운 튜브로 조심스럽게 옮김을 옮김을 옮김을 조심스럽게 옮김.
      5. 비드 현탁액과 DNA를 혼합하기 위해 각 튜브의 상층부와 피펫에 60 μL의 비드 기반 정제 시약을 추가합니다.
      6. RT에서 5 분 동안 혼합물을 인큐베이션 한 다음 튜브를 자석에 3 분 동안 놓습니다.
      7. 각 튜브에서 상급을 버리고 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오.
         참고 : 앰플리폰은 구슬에 바인딩됩니다.
      8. 각 튜브에 신선한 70 % 에탄올150 μL을 추가하십시오. 튜브를 좌우로 움직이는 구슬을 자석의 두 위치에서 세척합니다. 상급자를 버리고 펠릿을 방해하지 않도록주의하십시오.
      9. 5.1.6.8 단계에서 절차를 반복하고 RT에서 구슬을 3 분 동안 건조시고 구슬을 과도하게 건조하지 마십시오.
      10. 자석에서 튜브를 제거하고 50 μL의 낮은 Tris EDTA (TE)(재료 표,라이브러리 키트에 포함)를 펠릿에 추가하여 구슬을 분산시다.
      11. 혼합물을 위아래로 여러 번 파이펫하고 RT에서 2 분 동안 배양하십시오.
      12. 적어도 2 분 동안 자석에 튜브를 놓고 조심스럽게 구슬을 방해하지 않고 앰플리온을 포함하는 상급을 새로운 튜브로 옮김하십시오.
2. 라이브러리 정량화
   1. 고감도 DNA 키트 프로토콜에 따라 DNA 칩을 실행하기 위해 단편 분석기기(물자 표)를사용한다.

6. 라이브러리 풀링 및 시퀀싱 실행

1. 각 라이브러리를 뉴클레아제없는 물로 100 pM으로 희석합니다. 단일 튜브에서 단일 실행을 위해 각 100 pM 라이브러리의 10 μL을 결합합니다. 파이펫팅하여 결합된 라이브러리를 혼합하고 템플릿 및 시퀀싱을 진행합니다.
2. 계획된 실행 생성
   참고: 일반적인 실행에는 실험실에서 사용할 수 있는 시퀀서(Ion Proton System 또는 GeneStudio S5 시스템, 재료 표)에따라 두 가지 유형의 반도체 칩(이온 PI 칩 또는 이온 540 칩)에 로드할 수 있는 4개의 샘플이 포함됩니다. 이러한 시스템은 일반적으로 실행당 8천만 개의 읽기를 생성합니다.
   1. 시퀀싱 시스템(예: 이온 셰프 시스템)에 연결된 컴퓨터에서 토런트 브라우저를 열고 선택한 응용 프로그램(AmpliSeqDNA)에 대한 일반 템플릿을 사용하여 새 실행을 계획합니다.
   2. 계획의 키트 탭으로 전환합니다. 사용 중인 시퀀싱 시스템에 따라 계측기 드롭다운 목록에서 이온 양성자 시스템 또는 이온 GeneStudio S5 시스템을 선택합니다.
   3. 시퀀싱 시스템에 따라 칩 유형 드롭다운 목록에서 적절한 칩(이온 양성자 시스템의 PI 칩, Ion GeneStudio S5 시스템의 경우 540칩)을 선택합니다.
   4. 라이브러리 키트 드롭다운 목록에서 이온 AmpliSeq 2.0 라이브러리 키트를 선택합니다.
   5. 템플릿 키트의 이온 셰프 버튼을 선택한 다음 템플릿 키트 드롭다운 목록에서 적절한 Chef 키트(PI 칩용 Ion PI Hi-Q Chef 키트 또는 540 칩용 Ion 540 키트-Chef)를 선택합니다.
   6. 시퀀싱 키트 드롭다운 목록에서 적절한 시퀀싱 키트(PI 칩용 Ion PI Hi-Q 시퀀싱 200 키트 또는 540 칩용 Ion S5 시퀀싱 키트)를 선택한 다음 바코드 세트 드롭다운 목록에서 IonXpress를 선택합니다.
   7. 플러그인 탭으로 전환하고 커버리지 분석 플러그인을 선택합니다.
   8. 계획 탭으로 전환. 참조 라이브러리 드롭다운 목록에서 GRCh37/hg19 게놈을 선택합니다. 대상 영역 드롭다운 목록에서 순서대로 지정할 적절한 패널을 선택합니다.
   9. 시퀀스할 바코드 수와 라이브러리 샘플 튜브의 레이블을 적절한 필드로 설정합니다.
   10. 각 라이브러리의 바코드 이름과 샘플 이름을 설정합니다.
3. 샘플 라이브러리 희석 및 로딩.
   1. PI 칩의 경우 25 pM, 540 칩의 경우 32 pM으로 뉴클레아제 없는 물로 스톡 라이브러리를 희석합니다.
   2. 각 희석 된 라이브러리의 50 μL을 적절한 라이브러리 샘플 튜브의 바닥에 피펫.
   3. 시퀀싱 시스템을 켜고 화면의 지침에 따라 필요한 모든 시약을 로드하고 실행 계획을 가져옵니다.
   4. 풀링된 라이브러리가 포함된 라이브러리 샘플 튜브를 로드하고 클론 증폭 프로그램을 시작합니다.
      참고: 이온 셰프 시스템은 실행당 두 개의 칩을 준비해야 합니다.
4. 이온 양성자 또는 이온 진 스튜디오 S5에 시퀀싱.
   1. 시퀀싱 시스템을 켜고 화면의 지침에 따라 시퀀싱을 초기화하고 실행 계획을 가져옵니다.
   2. 시퀀싱 시스템에서 분리한 후 시퀀싱 칩을 로드합니다.
      참고: 정전기 방전으로 인한 칩 손상을 방지하기 위해 칩을 집어 들기 전에 접지하십시오. 칩 처리/위치 지정 및 성공/실패 로딩의 예는 그림 4에보고됩니다.
   3. 칩 구획 뚜껑을 닫고 칩 상태 아이콘이 "준비됨"을 표시할 때까지 기다립니다.
   4. 첫 번째 실행이 완료되면 폐기물 용기를 비우고 가능한 한 빨리 나머지 칩을 순서를 정합니다.

7. 돌연변이 및 카피 수 변이 (CNV) 분석

참고: GRCh37/hg19 인간 참조 게놈에 대한 시퀀싱 데이터의 정렬은 계획(6.2.8 단계)에 설정되면 자동으로 수행됩니다.

1. 커버리지 분석플러그인(재료 표)출력을 사용하여 커버리지 깊이와 균일성을 확인합니다.
2. 적절 한 생식선 또는 신체 워크플로를 선택 하는 Torrent 변형 호출자 플러그인(재료의 표)를사용 하 여 변형 호출을 수행 합니다.
3. 필터링 된 변형 변형 호출 형식 (VCF) 파일을 다운로드합니다. 변형 효과 예측기(VEP) 소프트웨어⁶ 및 NCBI RefSeq 데이터베이스를 사용하여 변형에 추가합니다.
4. Ion Reporter 업로더 플러그인을 사용하여 이온 리포터 소프트웨어의 로드 시퀀싱 데이터를 사용하고 포괄적인 암 패널 종양-정상 쌍 워크플로우를 사용하여 CNV를 추정하기 위해 데이터를 분석합니다.
5. 소프트웨어에서 할당한 점수를 기반으로 수동으로 돌연변이 및 CNV를 필터링하고 통합 유전체학 뷰어(IGV)^7을통해 시각적으로 확인합니다.
   1. artefactual 호출을 생성할 수 있는 비정상적인 읽기(예: 잘못된 프림, 과암화 또는 소프트 클리핑 읽기)에 대한 정렬을 시각적으로 검사합니다.
   2. 기준선의 정규화된 엄호에 대하여 주어진 유전자에 걸쳐 있는 모든 앰플리코에 대한 정규화된 엄호를 검사하여 CNV를 확인하십시오.
      참고 : 이것은 때때로 하나의 유전자의 끝과 연속유전자의 시작 부분에 몇 앰플리콘의 대칭 비정상적인 범위에 따라 CNV를 호출 하는 세분화 소프트웨어로 인해 거짓 호출을 수정 하는 데 도움이.
6. 체세포 돌연변이의 색인
   1. 각 경우에 대 한, 인덱스 돌연변이 정상 조직/혈액의 시퀀싱에서 호출, 원발 성 종양 및 전이.
   2. 생식선으로 플래그를 표시하고 생식선 DNA의 시퀀싱 데이터에서 명백한 호출을 폐기합니다.
   3. 클론 / 설립자로 플래그 주어진 환자의 모든 병변 사이에 공유되는 돌연변이.
   4. 주어진 환자의 모든 병변을 제외한 일부에서 검출되는 돌연변이를 소동/진행자로 플래그합니다.

8. 면역 표현형 분석 : 관련 단백질 발현을위한 면역 성화학

참고: 면역성 화학은 종양 억제 유전자에 있는 돌연변이를 비활성화의 기능적인 결과를 검증하기 위하여 이용되었습니다.

1. 마이크로토메를 사용하여 3−4 μm 두께의 FFPE 조직 섹션을 잘라내고 충전된 슬라이드에 장착하고 60°C에서 10분 동안 배양합니다.
2. 슬라이드를 랙에 놓고 10 분 동안 자일렌, 10 분 동안 자일렌, 4 분 동안 95 % 에탄올, 4 분 동안 95 % 에탄올, 4 분 동안 70 % 에탄올, 4 분 동안 70 % 에탄올, 4 분 동안 증류수를 수행하십시오.
3. 항체 의 제조자(재료표)의표시에 근거를 둔 항원 검색을 수행합니다.
   1. 슬라이드를 특정 항원 회수 용액이 있는 랙에 놓고 끓는 온도에서 수조에 담급하십시오.
   2. 욕조에서 슬라이드를 제거하고 수돗물을 실행하여 10 분 동안 식힙니다.
4. 내생성 과산화증을 비활성화하기 위해 RT에서 20 분 동안 1 x 트리스 버퍼링 식염수 (TBS)에 3 % H_2O2로 새 랙에 슬라이드를 놓습니다.
5. 슬라이드를 새 랙에 놓고 TBS로 3x를 세척하고 Tween 20(TBST)의 0.1%를 세척합니다.
6. PAP펜(재료 표)을사용하여 슬라이드 장착 조직 주위에 소수성 원을 그립니다.
7. 습한 챔버에 슬라이드를 놓고 차단 용액으로 TBST에서 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 사용하여 RT에서 1 시간 동안 차단을 수행합니다.
8. 1차항체(재료 표)로슬라이드를 밤새 4°C에서 습한 챔버에 인큐베이팅한다. 권장대로 차단 용액으로 1 차 항체를 희석하십시오.
9. 슬라이드를 새 랙에 놓고 TBST로 3x를 세척합니다.
10. 습한 챔버에서 RT에서 30 분 동안 특정 이차 항체 (항 마우스 또는 항 토끼)(1 슬라이드에 4−5 방울)로 배양하십시오.
11. 슬라이드를 새 랙에 놓고 TBST로 3x를 씻고 증류수로 씻으십시오.
12. 희석 완충제 1 mL에 1 방울을 희석하는 3,3'-다이아미노벤지딘(DAB) 용액을 준비한다(재료표). 현미경으로 검사하는 5 분 동안 최대 인큐베이트 슬라이드.
13. 현미경 하에서 반응의 발달을 따라 배양 시간을 계산하기 위해 양성 대조군을 사용한다.
    참고: 각 항체는 특정 인큐베이션 시간이 필요합니다.
14. 비활성 DAB (크로모겐 침전을 중지)는 증류수에 슬라이드를 침수하여.
15. 10s에 대한 헤마톡슬린과 새로운 랙에 침지하여 카운터 스테인 슬라이드 다음 수돗물로 헹구십시오.
16. 슬라이드를 랙에 놓고 4분 동안 70% 에탄올, 4분 동안 70% 에탄올, 4분 동안 95% 에탄올, 4분 동안 95% 에탄올, 10분 동안 자일렌, 10분 동안 자일렌을 수행합니다.
17. 밀봉 슬라이드는 각 조직 슬라이드에 장착 매체(재료 표)의몇 방울을 넣고 커버 슬립으로 덮습니다.
18. 커버 슬립에 압력을 가하여 여분의 매체와 기포를 조직에서 멀리 그리고 커버슬립에서 밖으로 옮기고 공기건조로 옮김을 제거합니다.
19. 전문 병리학자와 함께 반전 된 현미경으로 염색 결과를 평가하고 점수를 매김하십시오.
    참고 : 채점 시스템은 문헌의 정보가 이미 존재 할 수있는 특정 항원에 따라 달라집니다. 문헌에서 정보를 사용할 수 없는 경우, 정상 조직에서 항원발현을 기준으로 하여 채점 시스템을 도출한다.

결과

스터디 워크플로는 그림 1에나와 있습니다. 409개의 암 관련 유전자의 코딩 서열을 표적으로 하는 5개의 SPN 케이스의 다중 병변 (n=13) 염기서열 분석은 8개의 유전자에서 총 27개의 체세포 돌연변이를확인하였다(CTNB1, KDM6A, BAP1, TET1, SMAD4, TP53, FLT1및 FGFR3). 돌연변이는 주어진 환자의 모든 병변 사이에서 공유될 때 창립자/클로날로 정의되었고, 주어진 환자의 모든 병변에서 검출될 때 진행자/소클레날(subclonal)으로 정의되었다(그림5A,B). 전반적으로, 코호트에 걸쳐 확인된 점 돌연변이의 대다수는 CTNNB1, KDM6A, TET1 및 FLT1의돌...

토론

우리의 방법은 주어진 환자의 별개의 병변에서 수직 데이터 (즉, 형태학, DNA 염기서열 분석 및 면역 조직 화학)의 통합을 통해 고형 종양의 진행에 관여하는 분자 변이를 식별 할 수 있습니다. 우리는 409개의 암 관련 유전자8의 코딩 서열을 심문하여 돌연변이 침묵 종양 유형(즉, SPN, 췌장의 고체-가성세포 신생물)에서 클론 및 하부 클론 이벤트를 검출하는우리의 방법의 능력을 입증하였다. 여기서 사용되는 앰플리코 기반 표적 시퀀싱 접근법의 장점은 1000x의 전형적인 평균 커버리지 깊이에서 심문 된 영역 (15,992)에 걸쳐 커버리지 (90 % 표적 염기는 100x, 95 %는 20 배 커버)의 균일성입니다. 미세 해부를 통한 신생물 세포 농축에 결합된 높은 커버리지 커버리지는 낮은 대문자 주파수 이벤트를 검출하기 위한 높은 감도를 보장합니다. 우리가 이전에^9를보여주었듯이, 표적으로 한 순서 는 FFPE 조직에서 DNA 견본에 2% ee...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2100 바이오분석기 기기	애질런트 테크놀로지스	G2939BA	자동 전기영동 도구
Agencourt AMPure XP 키트	피셔 사이언티픽	NC9959336	PCR 산물 정제를 위한 비드 기술; 비즈 기반 정제 시약
애질런트 고감도 DNA 키트	애질런트 테크놀로지스	5067-4627	라이브러리 정량화
안티 BAP1	산타크루즈 생명공학	SC-28383	항체
안티 GLUT1	써모 사이언티픽	RB-9052	항체
안티 KDM6A	세포 신호 전달	#33510	항체
안티 p53	노보카스트라	NCL-L-p53-DO7	항체
안티 & 베타; 카테닌	시그마-알드리치	C7207	항체
차단 솔루션	수제	-	TBST의 5% 소 혈청 알부민(BSA)
내인성 과산화효소 비활성화 용액	수제	-	트리스 완충 식염수(TBS)에서 3% H2O2
라이카 CV 울트라	라이카	70937891	Entellan mountin 미디어
에피토프 회수 솔루션 1	라이카 바이오시스템즈	AR9961	구연산염 기반 pH 6.0 에피토프 회수 용액
에피토프 회출 솔루션 2	라이카 바이오시스템즈	AR9640	EDTA 기반 pH 9.0 에피토프 회수 용액
Eppendorf 0.2 ml PCR 튜브, 투명	에펜도르프	951010006	튜브
Eppendorf DNA LoBind 튜브, 1.5 mL	에펜도르프	22431021	튜브
에탄올	디아패스	A0123	IHC 탈파라핀화 시약
ImmEdge 펜  소수성  장벽  펜	벡터 연구소	H­ 4000	소수성 펜
ImmPACT DAB  과산화효소	벡터 연구소	SK­ 4105	HRP 기질
ImmPRESS 안티 & 수줍음; 토끼  Ig  시약  과산화효소	벡터 연구소	MP­ 7401­ 50	2차 항체
ImmPRESS 안티 & 수줍음; 마우스  Ig  시약  과산화효소	벡터 연구소	MP­ 7402­ 50	2차 항체
통합 유전체학 뷰어(IGV)	브로드 인스티튜트	-	https://software.broadinstitute.org/software/igv/home
Ion AmpliSeq 종합 암 패널	써모피셔 사이언티픽	4477685	409개 암 관련 유전자의 다중화된 표적 선택. https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CSD/Reference-Materials/ion-ampliseq-cancer-panel-gene-list.pdf
Ion AmpliSeq 라이브러리 키트 2.0	써모피셔 사이언티픽	4480441	Ion AmpliSeq 패널을 사용한 앰플리콘 라이브러리 준비
Ion Chef 기기	써모피셔 사이언티픽	4484177	자동 라이브러리 준비, 템플릿 준비 및 칩 로딩
Ion PI 칩 키트 v3 또는 Ion 540 칩	써모피셔 사이언티픽	A26771 또는 A27766	시퀀싱을 위한 바코드 칩
Ion PI Hi-Q Chef 키트 또는 Ion 540 Kit-Chef	써모피셔 사이언티픽	A27198 또는 A30011	템플릿 준비
Ion PI Hi-Q 시퀀싱 200 키트 또는 Ion S5 시퀀싱 키트	써모피셔 사이언티픽	A26433 또는 A30011	시퀀싱
Ion Proton 또는 Ion GeneStudio S5 시스템	써모피셔 사이언티픽	4476610 또는 A38196	시퀀싱 시스템
Ion Reporter 소프트웨어 - AmpliSeq 종합 암 패널 종양-정상 쌍	써모피셔 사이언티픽	4487118	워크플로
Ion Reporter 소프트웨어 - 업로더 플러그인	써모피셔 사이언티픽	4487118	데이터 분석 도구
Ion Torrent Suite 소프트웨어 - Coverege Analysis 플러그인	써모피셔 사이언티픽	4483643	생성된 순차 커버리지 수준을 설명하는 플러그인
Ion Torrent Suite 소프트웨어 - Variant Caller 플러그인	써모피셔 사이언티픽	4483643	참조를 통해 샘플에서 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 삽입 및 결실을 식별할 수 있는 플러그인
Ion Xpress 바코드 어댑터 1-96 키트	써모피셔 사이언티픽	4474517	고유한 바코드 어댑터
NanoDrop 2000/2000c 분광 광도계	써모피셔 사이언티픽	ND-2000 시리즈	DNA 순도 검출
NCBI 참조 시퀀스(RefSeq) 데이터베이스	NCBI	-	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/
Platinum PCR SuperMix 하이 피델리티	피셔 사이언티픽	12532-016 또는 12532-024	PCR 증폭을 위한 SuperMix; 충실도가 높은 PCR 믹스
QIAamp DNA 혈액 미니 키트	퀴아겐	51106 0R 51104	DNA 혈액 추출 키트
QIAamp DNA FFPE 조직	퀴아겐	56404	DNA FFPE 조직 추출 키트
Qubit 2.0 형광계	써모피셔 사이언티픽	질문32866	DNA 정량화
Qubit dsDNA BR 분석 키트	써모피셔 사이언티픽	질문32850	Qubit 2.0 형광계에서 DNA 정량화를 위한 키트
TBST	수제	-	트리스 완충 식염수(TBS) 및 0.1%의 Tween 20
티슈텍 프리즈마 플러스 & 티슈텍 필름	사쿠라 유럽	6172	자동 조직 슬라이드 염색기
VEP(Variant Effect Predictor) 소프트웨어	엠비-EBI	-	http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens /도구/VEP
자일렌, 이성질체 혼합물	카를로 에르바	492306	IHC 탈파라핀화 시약