Summary
We presenteren een methode voor het isoleren en cultiveren van primaire menselijke speekselklier-afgeleide epitheliale cellen. Deze cellen vertonen genexpressie patronen consistent met hen van speeksel epitheel oorsprong en kunnen worden gekweekt als salispheres op kelder membraan matrices afgeleid van engelbreth-Holm-Swarm tumorcellen of als monolagen op behandelde cultuur gerechten.
Abstract
De speekselklieren zijn een site van aanzienlijke belangstelling voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in meerdere aspecten van de menselijke ziekte. Een doel van de onderzoekers is het herstellen van de functie van klieren beschadigd door straling therapieën of als gevolg van pathologieën geassocieerd met het syndroom van Sjögren. Een tweede doel van de onderzoekers is het definiëren van de mechanismen waarmee virussen repliceren binnen klierweefsel waar ze dan toegang tot speeksel vloeistoffen belangrijk voor horizontale overdracht kunnen krijgen. Deze doelstellingen benadrukken de noodzaak van een robuuste en toegankelijke in vitro speekselklier model dat kan worden gebruikt door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in de bovengenoemde en aanverwante onderzoekgebieden. Hier bespreken we een eenvoudig protocol om epitheliale cellen te isoleren van menselijke speekselklieren en ze in vitro te propageren. Ons protocol kan verder worden geoptimaliseerd om te voldoen aan de behoeften van individuele studies. Kort, speeksel weefsel is mechanisch en enzymatisch gescheiden om te isoleren van enkele cellen of kleine clusters van cellen. Selectie voor epitheliale cellen treedt op door plating op een kelder membraan matrix in de aanwezigheid van media geoptimaliseerd om epitheliale celgroei te bevorderen. Deze resulterende culturen kunnen worden gehandhaafd als driedimensionale clusters, aangeduid als "salispheres", of gekweekt als een monolaag op behandelde kunststof weefselcultuur gerechten. Dit protocol resulteert in de uitgroei van een heterogene populatie van voornamelijk epitheelcellen die kan worden gekweekt voor 5-8 passages (15-20 populatie doublings) voordat het cellulaire senescentie ondergaat.
Introduction
Bij zoogdieren zijn de speekselklieren ingedeeld in 3 paar grote speekselklieren: de parotid, submandibulaire en sublinguale klieren. Er bestaat ook een reeks van kleine klieren gelegen op de tong en verspreid over de mondholte1. De belangrijkste klieren zijn verantwoordelijk voor het bulk volume van speeksel geproduceerd2. Naast het verstrekken van antimicrobiële bescherming door uitgescheiden factoren, het speeksel is belangrijk in het proces van kauwen en smeren van voedsel als het passeert de slokdarm2. Als zodanig, speekselklier dysfunctie vertegenwoordigt een medisch probleem waarbij patiënten die niet in staat zijn om voldoende speeksel te produceren meer vatbaar zijn voor het ontwikkelen van maladies zoals tandheelkundige holten of orale candidiasis3. Bovendien, verminderde speeksel resulteert in grotere moeilijkheden eten en verteerd voedsel met een aanzienlijke invloed op de kwaliteit van leven.
De speekselklier dysfunctie is voornamelijk te vinden bij patiënten die lijden aan het syndroom van Sjögren, een auto-immuunstoornis of bij patiënten met hoofd-en nekkanker die bestraling van3,4,5, 6. Beschadigde secretoire acini binnen de klieren als gevolg van auto-immuniteit of bestralingstherapie ondergaan geen zelf vernieuwing, wat resulteert in een patiënt leven met onherstelbare schade6. De studie van de speekselklieren heeft ook de aandacht of onderzoekers geïnteresseerd in mechanismen van virale pathogenese gegarnerd. Sommige pathogenen, zoals humaan cytomegalovirus (hcmv), voortdurend repliceren binnen de speekselklieren, die vervolgens het mogelijk maakt voor de overdracht van ontluikende virus naar een nieuwe gastheer via speeksel7,8. Zo is er een onvervulde behoefte om robuuste en reproduceerbare in vitro modellen van speekselklier weefsel te ontwikkelen om een divers scala aan medische problemen aan te pakken en te begrijpen.
Verschillende modellen van het Murine speekselklier systeem zijn gebruikt als uitgangspunt voor het begrijpen en karakteriseren van de verschillende epitheelcellen die de speekselklieren vormen9,10. Er bestaan duidelijke en grote verschillen tussen menselijke en muriene speekselklieren11. Met name de humane holte klier is groter ten opzichte van de submandibulaire klier, terwijl de muis submandibulaire en holte veel vergelijkbaar zijn in grootte1,2,11. Terwijl vereeuwigd menselijke submandibulaire cellijnen bestaat, er zijn grote bezorgdheid dat de vereeuwigd cellen niet nauwkeurig het fenotype van het primaire weefsel en secundaire bezorgdheid dat de vereeuwigd cellen niet daadwerkelijk worden afgeleid van speeksel epitheel zelf12. Om deze redenen is er een belang en een noodzaak om primaire speeksel weefsel van de mens te bestuderen.
Hier beschrijven we een protocol om primaire epitheliale cellen te isoleren van menselijke speekselklieren voor weefselkweek. Ons protocol is gebaseerd op de werken van Pringle et al. en Tran et al. met wijzigingen die zijn aangebracht om hun procedures over het algemeen te vereenvoudigen13,14. Ten eerste, terwijl het Protocol van Tran et al. vraagt om een lange incubatietijd van vijf uur voor enzymatisch verteren van het speeksel weefsel, is ons gewijzigde protocol succesvol geweest met zo weinig als een incubatie van één uur, vergelijkbaar met die in Pringle et al. Ten tweede gebruiken we verschillende enzymen voor de spijsvertering van weefsels, met name we gebruiken geen trypsine zoals wordt gebruikt in het oorspronkelijke Tran et al.-Protocol, maar in plaats daarvan een mengsel van dispase en Collagenase gebruiken. We voorkomen dat trypsine in de eerste digestie stappen als een recente studie suggereerde dat de initiële vertering van het speeksel weefsel door trypsine resulteert in verminderde levensvatbaarheid van de cel, mogelijk door het verlies van een zeldzame stamcel populatie15. Ten slotte cultuur we de salispheres op het oppervlak van de kelder membraan matrix (BMM) met behulp van een commercieel beschikbare media oorspronkelijk geformuleerd voor de voortplanting van bronchiale epitheelcellen. Ons protocol kan worden gebruikt om speeksel cellen te isoleren van parotid, submandibulaire en sublinguale klieren. Deze cellen Express speeksel amylase en andere speeksel specifieke genen die erop wijzen dat ze een fenotype vergelijkbaar met dat van speeksel acineuze epitheelcellen7. We hebben met succes speeksel culturen gegenereerd uit > 50 primaire menselijke weefselmonsters met behulp van deze methodologie. Bovendien kunnen de primaire speeksel cellen gemakkelijk worden cryopreserved voor gebruik op een later tijdstip.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze protocollen en studies zijn beoordeeld en goedgekeurd door de institutioneel Review Board van de Universiteit van Cincinnati (Federal-Wide Assurance #00003152, IRB protocol 2016-4183). Speeksel weefsel wordt gewoonlijk in veel hoofd-en nekchirurgische ingrepen door de hand gelopen en is meestal niet betrokken bij het maligne proces. Normaalgesproken wordt na verwijdering van de patiënt (Figuur 1a) binnen 2-4 h een vers verwijderd speekselklier weefsel gebruikt.
1. bereiding van het reagens
-
Bronchiale epitheliale celgroei medium (BEGM)
- Voeg onderdelen uit de door de fabrikant geleverde Kit toe (Zie de tabel met materialen).
- Was elke buis één keer met de basismedia om volledige overdracht van componenten te garanderen. Voeg vervolgens houtskool gestript foetaal runderserum toe om een uiteindelijke concentratie van 4% serum te maken.
-
Rode bloedcel (RBC) lysisbuffer
- Voeg, om 10x voorraad te maken, 40,15 g NH4Cl, 5,0 g NaHCO3en 0,186 g ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) toe en breng tot een eindvolume van 200 ml met DH2O. Filter vervolgens steriliseren en bewaren bij 4 °C.
- Verdun tot een werkconcentratie van 1x in steriele dH2O vóór gebruik.
-
Dissociatie oplossing
- Naar een flesje van 100 mL dispase (Zie de tabel met materialen) Voeg 0,15 g Collagenase type III toe. Nadat Collagenase volledig is opgelost, steriliseren filter de nieuwe oplossing en aliquot. Bewaren bij-20 °C.
2. weefsel spijsvertering
- Met behulp van een 100 mm weefselcultuur plaat, mechanicallymince het weefsel in fijne stukken ~ 1-2 mm in grootte met behulp van autoclaaf gesteriliseerde ontleden schaar en chirurgische Tang (Figuur 1b,C). Bindweefsel tussen stukken moet worden gesneden om een goede scheiding en gemak in verdere stappen te garanderen.
- Voeg 6 mL van de dispase/Collagenase-oplossing toe aan het fijngehakte weefsel. Inincuberen bij 37 °C gedurende ongeveer 30 minuten tot 1 uur.
- Ontwer het weefsel door pipetteren met een serologische Pipet van 5 mL 15-20 keer.
- Inincuberen bij 37 °C voor nog eens 30 min tot 1 uur.
- Herhaal de stappen 2,3 en 2,4 tweemaal drie keer of totdat het weefsel lijkt op een slurry en gemakkelijk de pipet opening kan passeren (figuur 1d).
Opmerking: De begingrootte van het weefsel specimen en hoe fijnheid van de weefsel gehakt zal bepalen hoe vaak men de stappen 2,3 en 2,4 moet herhalen. Meestal ontvangen we weefsel ongeveer 1 cm x 1 cm groot. Daarnaast kan men weefsel dissociatie bewaken met behulp van een standaard omgekeerde weefselkweek Microscoop om de voortgang van celdissociatie van het weefsel te volgen. Kleine clusters van cellen zijn ideaal voor initiële uitgroei van speeksel cellen als salispheres.
3. coating putten met kelder membraan matrix
Opmerking: de kelder membraan matrix (BMM) moet 's nachts op 4 °C worden ontdooid op de dag voordat deze wordt gebruikt. Eenmaal ontdooid, moet BMM constant worden gehandhaafd op ijs of op 4 °C, omdat het snel stollen (d.w.z. een gel vormen) bij warmere temperaturen. Bovendien moet worden gezorgd als monsters zijn gekoeld op ijs voorafgaand aan het beplating op BMM als koude monsters zal "smelten" de BMM en bloot cellen aan de plastic schotel.
- Pipetteer langzaam BMM (Zie de tabel met materialen) in elk goed om te worden gecoat. Gelijkmatig en langzaam verdelen de BMM over de put.
Opmerking: over het algemeen gebruiken we 500 μL per stuk van een zes-waterput, maar dit volume kan worden aangepast voor gebruik op andere varianten van platen zoals 12-well of 24-Well, of zoals gewenst voor dikkere of dunnere hydrogels. - Inincubeer de gecoate platen bij 37 °C gedurende ten minste 15 minuten vóór gebruik, zodat de BMM-tijd kan stollen.
4. filtreren van onverteerd weefsel, RBC lysis en celplating
- Overdracht weefsel homogenaat van stap 2,5 naar een conische buis van 15 mL. Was één keer met 6 mL van Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) om de resterende cellen over te brengen.
- Filtreer het homogenaat in een conische buis van 50 mL door middel van een 70 μm nylon mesh Cell zeef om onverteerd weefsel te verwijderen. Centrifugeer cellen gedurende 5 min bij 500 x g.
- Verdun 10x RBC lysisbuffer in steriele dH2O om een 1x werkoplossing te maken.
- Aspireren het supernatant. Breng vervolgens de celpellet in 10 mL van 1x RBC lysisbuffer. Inincuberen gedurende 5 min bij 37 °C.
- Voeg 20-25 mL DPBS toe om de RBC lysisbuffer te neutraliseren en Lysis van de speeksel cellen te minimaliseren. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.
Opmerking: na behandeling met de RBC lysisbuffer moet de celpellet wit zijn. Rode kleur in de pellet geeft aan dat niet alle RBC volledig lysed zijn geweest. Herhaal stap 4,4 tot en met 4,5 indien nodig voor volledige lysis van alle RBC. - Aspireren het supernatant. Resuspendeer de pellet in 1-2 mL BEGM per putje en plaats vervolgens de herhangende cellen op BMM gecoate putten. Incuberen bij 37 °C.
- Eenmaal verguld op BMM, cellen zullen vormen in sferische structuren of "salispheres" over een periode van 2-3 dagen. Cellen kunnen worden gehandhaafd als salispheres voor ongeveer 5-7 dagen voordat de BMM begint te degraderen waardoor de cellen te openen en te hechten aan het plastic en groeien als een monolayer.
5. subculturing van de salispheres en onderhoud op BMM
- Aspirate media uit putten, voeg vervolgens 1 mL dispase/Collagenase oplossing aan elk putje en inbroed bij 37 ° c voor ~ 15 min of tot BMM is meestal opgelost.
- Breng cellen over naar een conische buis van 15 mL en spoel de putjes eenmaal met DPBS om de resterende cellen te verkrijgen. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.
- Aspireren het supernatant. Hervat de pellet in 2 mL trypsine en inincuberen bij 37 °C gedurende 15 minuten.
- Neutraliseer de trypsine met behulp van alle volledige media die 10% serum bevatten. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.
- Aspireren het supernatant. Respendeer de cellen in DPBS om rest media, trypsine en serum te verwijderen. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.
- Aspireren het supernatant. Resuspendeer in BEGM en plaat de geredigeerde cellen op gestijde BMM gecoate cultuur gerechten. Resuspendeerde cellen kunnen ook direct worden geplateerd op celcultuur behandeld gerechten voor proliferatie als een monolayer. Voor meer informatie over de groei van speeksel cellen als monolayer, zie rubriek 6. Cellen geteeld op BMM of op plastic moeten worden gevoed met verse BEGM elke 2 – 3 dagen.
- Cultuur de cellen in een bevoficeerde incubator onderhouden bij 37 °C met 5% CO2.
6. subculturing de salispheres op behandelde kunststof weefselcultuur gerechten
Opmerking: als u cellen als een monolaag op plastic onderhoudt, begint u bij deze stap. Het volgende protocol is van toepassing op cellen die groeien in een schaal van 100 mm.
- De media te aspireren. Was één keer met DPBS om rest media te verwijderen.
- Voeg 2 mL trypsine toe en inincuberen bij 37 °C gedurende 15 minuten, of totdat de cellen volledig zijn losgemaakt.
- Neutraliseer trypsine met behulp van 4 mL van alle volledige media die 10% serum bevatten. Breng cellen over in een conische buis van 15 mL.
- Was de plaat één keer met ongeveer 5 mL DPBS om de resterende cellen te verzamelen. Centrifugeer 5 min bij 500 x g.
- Aspireren het supernatant. Respendeer cellen in 6-10 mL DPBS om rest media te verwijderen.
- Centrifugeer 5 min bij 500 x g.
- Aspireren de supernatant en respenderen in BEGM. Plaat cellen op behandelde kunststof weefselcultuur gerechten. Voer elke 2-3 dagen met verse BEGM.
- Cultuur de cellen in een bevoficeerde incubator onderhouden bij 37 °C met 5% CO2.
7. cryopreservering van cellen
Opmerking: cryopreservering van cellen kan worden bewerkstelligd door een enkele celsuspensie die afkomstig is van ofwel salisphere of monolaag gekweekte cellen.
- Tel de cellen op een hematocytometer om de totale hoeveelheid aanwezige cellen te berekenen.
- Centrifugeer 5 min bij 500 x g.
- Aspireren het supernatant. Respendeer de pellet in BEGM met 10% dimethylsulfoxide (DMSO). Concentratie van cellen moet 2 x 106 cellen/ml tot 10 x 106 cellen/ml.
- Aliquot cellen in steriele cryogene opslag buizen. Plaats de buisjes in een geïsoleerde schuimrek en inincuberen bij-80 °C 's nachts om de cellen langzaam te bevriezen.
- Op de volgende dag, plaats buizen in vloeibare stikstof voor lange termijn opslag.
Opmerking: cellen moeten snel ontdooid worden bij 37 °C. Bij het ontdooien moeten de cellen worden omhuld met 500 x g en de DMSO-bevattende media vóór het beplating worden verwijderd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Twee-drie dagen na het plating van cellen van verteerd weefsel op BMM, cellen zullen gemakkelijk vormen kleine clusters die zullen blijven uitbreiden in grootte tot 15-20 cellen per cluster (Figuur 2a). Cellulaire puin en losgekoppelde dode cellen worden meestal gezien en moeten worden verwijderd door aspireren en aanvullen met verse media. Cellen zullen blijven prolifereren als salispheres voor over 3-10 dagen, of zolang de BMM laag intact blijft. Af en toe, als gevolg van gedeeltelijke afbraak van de BMM, cellen zullen worden gehecht aan de onderliggende plastic en beginnen te vermenigvuldigen als een monolayer. De op BMM gekweekte salibollen vertonen variabiliteit in grootte en structurele complexiteit. De salisferen kunnen worden gehandhaafd door ze op vers bereide BMM door te geven, zoals beschreven in het protocol. Binnen 2-3 dagen na het passeren van verse BMM, zullen de cellen in bollen hervormen. Salisphere cellen kunnen ook worden verguld op celcultuurbehandelde kunststof en gekweekt als een monolaag waar ze morfologie vertonen die consistent is met cellen van epitheliale oorsprong, zoals weergegeven in Figuur 2b. Terwijl de salisphere cellen geteeld op BMM als salispheres waarschijnlijk een fenotype meer karakteristiek van speeksel weefsel te behouden, de cellen gekweekt als een monolaag kan voordelig zijn voor sommige experimentele protocollen. Een uitgebreidere karakterisering moet worden uitgevoerd om te bepalen in hoeverre de cellen een speeksel fenotype behouden wanneer ze op een monolaag worden geteeld in vergelijking met cellen die als salispheres worden geteeld.
Figuur 1 : Initiële verwerking van humane submandibulaire klieren voor de bereiding van de salisphere. Excised speekselklier weefsel ongeveer 1 cm in diameter (A) wordt mechanisch fijngehakt in kleinere stukjes met behulp van een scherpe schaar (B) totdat de klier is afgescheiden in verteerbare stukjes van ongeveer 1-2 mm groot (C). De klier stukjes worden vervolgens geïnineerd in de dispase/Collagenase-oplossing voor 30-90 min met periodieke doorgang door Serologische pipetten totdat het monster wordt verteerd tot meestal enkele cellen of kleine klonters cellen (D). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Primaire menselijke salisphere cellen kunnen worden gekweekt als bollen op de kelder membraan matrix of als een monolaag op behandelde celcultuurgerechten. Na de initiële vertering van speeksel weefsel, de verteerde klieren worden verguld rechtstreeks op BMM en gekweekt voor 3-10 dagen. Cellen worden elke 2-3 dagen gevoed om nieuwe voedingsstoffen te leveren. Zodra de primaire salispheres zich ontwikkelen, kunnen de matrices worden verteerd in dispase/Collagenase-oplossing, trypsinized om afzonderlijke cellen te genereren, en opnieuw op verse BMM, waar ze hervormen in bollen (A) of verguld op celkweek gerechten waar ze vorm een kasseien morfologie die typerend is voor een epitheel monolaag (B). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Speeksel dysfunctie is een zorg voor de kwaliteit van leven voor mensen die lijden aan het syndroom van Sjögren, evenals degenen die radiotherapie ondergaan voor kankers naast de speekselklieren3,4,5, 16. Een voorgestelde therapie voor de behandeling van deze patiënten is om te groeien functionele speeksel stamcellen of organoïden in vitro, die vervolgens kunnen worden ingebracht in beschadigde speekselklier om getroffen weefsel te vervangen9. Bovendien, speekselklieren zijn vaak een site voor persistentie en overdracht van menselijke pathogenen. Bijvoorbeeld, menselijke herpesvirussen zoals humaan cytomegalovirus (hcmv) zijn bekend om te infecteren en gebruik maken van de speekselklieren en speeksel te verzenden virus naar nieuwe hosts7,8,17. De moleculaire mechanismen onderliggende virale persistentie in de speekselklier en beweging naar speeksel blijven onbekend. De ontwikkeling van in vitro speeksel cellen systemen zal een essentieel modelsysteem om deze mechanistische informatie te verkennen bieden.
We rapporteren hier een robuust protocol voor het genereren van primaire speeksel "salispheres" dat in vitro kan worden gekweekt als clusters op BMM of als monolagen op plastic. De mogelijkheid om te cultuur en propageren primaire menselijke speekselklier epitheelcellen vertegenwoordigt een belangrijk platform waarop onderzoekers kunnen (1) potentieel ontwikkelen vervangende therapieën voor patiënten met speekselklier tekortkomingen voor wie geen andere opties bestaat (2) beter inzicht in de fundamentele fysiologie onderliggende speekselklier ontwikkeling, proliferatie, secretie, enz.; en (3) Definieer mechanismen die worden gebruikt door pathogenen om te repliceren en zich te verspreiden naar nieuwe hosts.
Met deze speeksel celculturen hebben we gemeld dat HCMV het pentameric glycoproteïne complex vereist voor primaire infectie en ook dat het virus gedurende een langere periode aanhoudt, wat doet denken aan wat er gebeurt met HCMV in vivo7. Bovendien toonden onze functionele studies aan dat de speeksel culturen geen contaminerende fibroblasten bevatten als fibroblast trope, Lab aangepaste virussen niet te infecteren en repliceren in de primaire speeksel afgeleide cellen7. Hoewel we dit protocol hebben gebruikt om cellen te genereren voor de evaluatie van HCMV-replicatie en verspreid in een primair speeksel systeem, kan dit protocol gemakkelijk worden aangepast om speeksel cellen te genereren die nuttig zijn voor het brede scala aan bovengenoemde onderzoeksonderwerpen. Bovendien kan dit protocol worden aangepast aan de behoeften en het budget van elke individuele onderzoeker. Terwijl we niet zelf andere voorwaarden gevalideerd, anderen hebben gemeld succes groeiende speeksel epitheliale cellen onder verschillende media voorwaarden. Bijvoorbeeld, Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM): F12 mengsel aangevuld met epidermale groeifactor en fibroblast groeifactor-2 is gemeld ter bevordering van de robuuste groei van de speeksel cellen18. Als alternatief nam et al. gebruik minimale essentiële Media aangevuld met foetaal runderserum voordat de cellen worden overgebracht naar een serum vrije versie van een in groeimedium en hebben een robuuste groei van de speeksel cellen op plastic15gerapporteerd. Het lijkt er dus niet op dat de speeksel epitheelcellen een absolute vereiste vertonen voor een bepaald mediatype, maar lijken te groeien en te vermenigvuldigen met een aantal commercieel beschikbare mediatypen.
Naast de media-formulering, verschillende kelder membraan formuleringen kunnen worden geëvalueerd voor hun capaciteiten ter ondersteuning van robuuste speeksel epitheliale celgroei. Groei van cellen op de commercieel beschikbare kelder membraan-bevattende matrixen gemakkelijk opleveren salispheres en biedt een eenvoudige, zij het dure kweek systeem7,19. Vergelijkbaar met die hierboven besproken met betrekking tot de keuze van media voor celgroei, onderzoekers hebben gemeld groei en ontwikkeling van de salispheres op een aantal verschillende matrices en hydrogel systemen. Hydrogels gemaakt van hyaluronzuur hebben het extra voordeel bij het creëren van een extracellulaire matrix gecrosslinkt met de gewenste chemische bestanddelen om hun interacties en effecten op cellen te bestuderen. Met behulp van primaire menselijke weefsel afgeleide speeksel cellen, Srinivasan et al. gemeld succes in de groei en het onderhoud van een speeksel voorloper celpopulatie in hyaluronzuur hydrogels; verhoogde voorlopercellen groei werd verder waargenomen wanneer de hydrogels werden opgenomen met peptiden afgeleid van de kelder membraan eiwitten zoals perlecan en laminine20. Een ander systeem onlangs ontwikkeld door Foraida et al. rapport met behulp van "electrospinning" om een nano vezel steiger gemaakt van poly (melkzuur-co-glycolic zuur) (PLGA) te ontwikkelen. De PLGA-hydrogels met toegevoegde elastine bleken de ontwikkeling van een gepolariseerd submandibulaire celsysteem gemakkelijk te bevorderen, wat nuttig kan zijn bij het bepalen van de invloed van celpolarisatie op de speeksel biologie en biochemie21.
In dit protocol hebben we een eenvoudige methode gepresenteerd voor de isolatie en groei van primaire speekselklier-afgeleide epitheliale cellen. Dit protocol resulteert in de snelle uitgroei van een epitheliale celpopulatie die gemiddeld kan worden gehandhaafd voor 5-8 passages. Het is van cruciaal belang om het weefsel tijdens de behandeling met dispase/collagenase te controleren om een juiste spijsvertering te waarborgen, zoals vermeld in het protocol. Onvolledige spijsvertering zal ernstig verminderen het aantal salispheres die overleven. Het is ook belangrijk om de culturen te monitoren voor de uitgroei van fibroblasten die een langwerpige vorm hebben en zeer verschillend zijn van de veelhoekige epitheelcellen die doorgaans in discrete vlekken of klonten groeien. We hebben dit protocol gebruikt voor de isolatie van epitheelcellen van mensen en muizen, maar het lijkt waarschijnlijk dat het kan worden aangepast voor gebruik met andere zoogdier systemen. Bovendien kan dit Protocol verder worden gewijzigd door gebruik te maken van extra zuiveringsstappen op basis van de celoppervlak marker expressie en flow cytometrie die kan leiden tot het genereren van meer homogene initiële celpopulaties. Op dezelfde manier kan dit protocol worden gebruikt om te bepalen hoe verschillende media of matrix/hydrogels formulering leiden tot de uitgroei van specifieke celtypen bij het eerste genereren van de salispheres. Tot slot moet dit Protocol dienen als een robuust startplatform voor de isolatie en groei van primaire speeksel cellen die gemakkelijk kunnen worden aangepast voor een breed scala aan experimentele protocollen en onderzoeksgebieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs rapporteren niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen James P. Bridges bedanken voor het verstrekken van belangrijke richtsnoeren voor de methoden die betrokken zijn bij het kweken van primaire cellen. Matthew J. Beucler werd gesteund door de National Institutes of Health Training Grant T32-ES007250. Dit werk werd ook gesteund door National Institutes of Health subsidies R01-AI121028 en R21-DE026267 uitgereikt aan William E. Miller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dishes | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Media | Lonza | CC-3171 | Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum. |
| Cell strainer 70 µm nylon mesh | Fisher | 22-363-548 | |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Gibco | 12676-029 | |
| Collagenase type III | Worthington | LS004182 | Store at 4 °C. |
| Cryogenic Tube | Fisher | 5000-0020 | |
| Dispase | Cell Applications | 07923 | Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C. |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Dulbecco phosphate buffered saline | Corning | 55-031-PC | |
| General Chemicals | Sigma | ||
| PathClear Basement membrane extract | Cultrex | 3432-005-01 | Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice. |
| Six-well culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Surgical forceps | Fisher | 22-079-742 | |
| Trypsin-EDTA solution | Corning | 25-052-CI |
References
- Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).
- Holmberg, K. V., Hoffman, M. P. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. Monographs in Oral Science. Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. 24, S. KARGER AG. 1-13 (2014).
- Vissink, A., et al. Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).
- Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases. Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).
- Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. Ten-year observation of patients with primary Sjögren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes. International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review. Cancer. 107, 2525-2534 (2006).
- Morrison, K. M., et al. Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium. Journal of Virology. , (2018).
- Pomeroy, C., Englund, J. A. Cytomegalovirus: epidemiology and infection control. American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).
- Maimets, M., et al. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).
- Varghese, J. J., et al. Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells. Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).
- Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers. Oral Diseases. , (2018).
- Lin, L. C., et al. Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study. Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).
- Tran, S. D., et al. Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland. Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).
- Pringle, S., et al. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Nam, H., et al. Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures. Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).
- Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).
- Cannon, M. J., et al. Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children. BMC Infect. Dis. 14, (2014).
- Pringle, S., et al. Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy. STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).
- Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).
- Foraida, Z. I., et al. Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization. Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).
