Summary
אנו מציגים שיטה לבידוד וטיפוח תאים האפיתל בלוטת הרוק העיקרי של האדם. תאים אלה התערוכה ביטוי גנים דפוסי עקבי עם אותם להיות של מוצא האפיתל הרוק ניתן לגדל כמו כדורי הריר על מטריצות קרום מרתף נגזר אנגלברב-הולם-בתאי הגידול נחיל או כמו monolayers על מנות תרבות מטופלים.
Abstract
בלוטות הרוק הם אתר של עניין משמעותי עבור החוקרים המעוניינים היבטים מרובים של המחלה האנושית. מטרה אחת של החוקרים היא לשחזר פונקציה של בלוטות ניזוק על ידי טיפולים קרינה או עקב הפתווגיות הקשורים תסמונת Sjöגרנה. המטרה השנייה של חוקרים היא להגדיר את המנגנונים שבהם וירוסים לשכפל בתוך רקמת הבלוטות שבו הם יכולים לקבל גישה נוזלי הרוק חשוב עבור הילוכים אופקית. מטרות אלה להדגיש את הצורך חזק ונגיש במודל בלוטת הרוק מבחנה שיכול להיות מנוצל על ידי חוקרים המעוניינים המוזכרים לעיל, כמו גם אזורי מחקר קשורים. כאן אנו דנים פרוטוקול פשוט כדי לבודד תאים אפיתל מבלוטות הרוק האנושי להפיץ אותם בתוך מבחנה. הפרוטוקול שלנו יכול להיות ממוטב נוסף כדי לענות על הצרכים של מחקרים אישיים. בקצרה, רקמת הרוק היא מכנית ואנזימטי מופרדים כדי לבודד תאים בודדים או אשכולות קטנים של תאים. בחירה עבור תאים אפיתל מתרחשת על ידי ציפוי על מטריצה קרום המרתף בנוכחות של מדיה אופטימיזציה לקידום צמיחת תאים אפיתל. ניתן לתחזק את התרבויות הללו כאשכולות תלת-ממדיים, הנקראת "כדורי הערבה", או לגדול כמונאולייר על מנות תרבות של רקמה פלסטית. פרוטוקול זה מביא את הצמיחה של אוכלוסיית הטרוגניים בעיקר תאים אפיתל שניתן להפיץ עבור 5-8 מעברים (15-20 האוכלוסייה טווח) לפני שעברו הזדקנות הסלולר.
Introduction
ביונקים בלוטות הרוק מאורגנים 3 זוגות של בלוטות הרוק הגדולות: הפרוטיד, תת הלסת, ואת בלוטות המשנה. קיימת גם סדרה של בלוטות קטין הממוקם על הלשון ומפוזרים ברחבי חלל אוראלי1. בלוטות הגדולות אחראים נפח בצובר של רוק המיוצר2. בנוסף למתן הגנה מיקרוביאלית באמצעות גורמים מופרש, רוק חשוב בתהליך של לעיסת מזון שימון כפי שהוא עובר דרך הוושט2. ככזה, תפקוד בלוטת הרוק מייצג בעיה רפואית שבה הסובלים שאינם מסוגלים לייצר רוק מספיק נוטים יותר לפתח חלות כגון חללים שיניים או הקנאזיס אוראלי3. בנוסף, מופחתת הרוק גורמת לקושי רב יותר לאכול ולעכל את המזון בעל השפעה משמעותית על איכות החיים.
תפקוד בלוטת הרוק נמצא בעיקר בחולים הסובלים מתסמונת sjöגרנה, הפרעה אוטואימונית, או בחולים עם סרטן ראש וצוואר שעברו טיפול הקרנה3,4,5, . שישה מטרים הפרשה הפגומה acini בתוך הבלוטות כתוצאה של חסינות אוטומטית או טיפול בקרינה לא עוברים התחדשות עצמית, אשר גורמת לחולה החיים עם נזק בלתי הפיך6. המחקר של בלוטות הרוק צברה גם את תשומת הלב או החוקרים המעוניינים מנגנונים של פתוגנזה נגיפית. כמה פתוגנים, כגון cytomegalovirus ירוס האדם (מימן), בהתמדה שכפול בתוך בלוטות הרוק, אשר לאחר מכן מאפשר שידור של וירוס המתהווה למחשב מארח חדש דרך רוק7,8. לפיכך, יש צורך לא מתקיים לפתח חזק ומלא מודלים של בלוטת הרוק להתמודד ולהבין מגוון מגוון של בעיות רפואיות.
מספר דגמים של מערכת בלוטת הרוק murine שימשו נקודת התחלה כדי להבין ולאפיין את התאים האפיתל השונים היוצרים את בלוטות הרוק9,10. קיימים הבדלים ברורים ועיקריים בין בלוטות הרוק אדם מורטין11. בעיקר בלוטת הפרוטיד האנושית גדולה יותר ביחס לבלוטת הלסת התחתונה ואילו הלסת התחתונה והפרוטיד דומים הרבה בגודלם1,2,11. בעוד מונצח האדם קווי הלסת התחתונה קיים, יש חששות עיקריים כי התאים מונצח לא לשמור במדויק את הפנוטיפ של הרקמה הראשונית חששות משניים כי התאים המודרים אינם נגזרים בפועל מ אפיתל הרוק עצמו12. מסיבות אלה יש עניין וצורך ללמוד רקמת הרוק העיקרי מבני אדם.
כאן אנו מתארים פרוטוקול לבודד תאים אפיתל העיקרי מבלוטות הרוק האנושי לתרבות רקמות. הפרוטוקול שלנו מבוסס על יצירותיו של פרינגל ואח ' וטראן ואח '. עם שינויים שבוצעו בדרך כלל לפשט את הנהלים שלהם13,14. ראשית, בזמן שפרוטוקול טראן ואח ' מתקשר לדגירה ארוכה של חמש שעות לעיכול הרוק, הפרוטוקול המתוקן שלנו הצליח עם מעט כמו דגירה של שעה אחת, בדומה לזה בפרינגל ואח '. שנית, אנו משתמשים באנזימים שונים לצורך עיכול רקמות, בעיקר איננו משתמשים בטריפסין כפי שנעשה בשימוש בפרוטוקול Tran et al המקורי, אך במקום זאת להשתמש בתערובת של dispase ו קולגן. אנו מעדיפים להימנע מטריפסין בצעדי העיכול הראשוניים כמחקר שנערך לאחרונה, הציע כי העיכול הראשוני של רקמת הרוק על ידי טריפסין תוצאות מופחתת הכדאיות התא, ואולי על ידי אובדן של אוכלוסיה נדירה של תאי גזע15. לבסוף, אנו התרבות הערבה על פני השטח של מטריקס קרום המרתף (BMM) באמצעות מדיה זמין מסחרית ניסח במקור עבור התפשטות של תאים אפיתל הסימפונות. הפרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי לבודד את תאי הרוק מן הפרוטיד, הלסת התחתונה, ובלוטות תת לשוני. תאים אלה לבטא עמילז הרוק ו גנים ספציפיים אחרים הרוק המציין כי הם שומרים על פנוטיפ דומה לזה של תאים הרוק האפיתל שכבתית7. הצלחנו להפיק בהצלחה תרבויות הרוק מ > 50 דגימות הרקמות האנושיות הראשיות באמצעות מתודולוגיה זו. יתר על כן, התאים הרוק העיקרי יכול בקלות להיות הקפאת שמורות לשימוש במועד מאוחר יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקולים ומחקרים אלה נבדקו ואושרו על ידי מועצת הסקירה המוסדית באוניברסיטת סינסינטי (הביטחון הפדרלי-רחב00003152, IRB פרוטוקול 2016-4183). רקמת הרוק הוא בדרך כלל resected הרבה הראש והצוואר כירורגי הליכים והוא בדרך כלל אינו מעורב על ידי תהליך ממאיר. בדרך כלל, רקמת בלוטת הרוק טרי resected משמש בתוך 2-4 h לאחר ההסרה של המטופל (איור 1A).
1. הכנה מגיב
-
ברונכיט הצמיחה האפיתל התאים בינונית (בז)
- הוסף רכיבים מתוך הערכה המסופקת על-ידי היצרן (עיין בטבלת החומרים).
- שטוף כל צינור פעם אחת עם מדיית הבסיס כדי להבטיח העברה מלאה של רכיבים. ואז להוסיף את הסרום העוברי פחם העובר כדי לבצע ריכוז סופי של 4% סרום.
-
מאגר לליזה תא דם אדום (RBC)
- כדי להפוך את מלאי 10x, להוסיף 40.15 g של NH4Cl, 5.0 g של נחקו3, ו 0.186 g של החומצה ethylenediamאצטט (edta) ולהביא נפח סופי של 200 mL באמצעות dH2O. ואז לסנן לעקר ולאחסן ב 4 ° c.
- דלל את הריכוז העובד של 1x ב-dH הסטרילי2O לפני השימוש.
-
פתרון דיסוציאציה
- כדי בקבוק 100 mL של הפתרון dispase (לראות את הטבלה של חומרים) להוסיף 0.15 g של הקולגן הסוג השלישי. לאחר הקולגן התפרקה לחלוטין, מסנן לעקר את הפתרון החדש aliquot. חנות ב-20 ° c.
2. עיכול הרקמה
- באמצעות לוח 100 מ"מ התרבות רקמה, המכונה במיוחד את הרקמה לתוך חתיכות קנס ~ 1-2 מ"מ בגודל באמצעות החיטוי-הניתוח מעוקר מספריים כירורגי מלקחיים (איור 1B,ג). יש לגזור את רקמת החיבור בין החלקים כדי להבטיח הפרדה נכונה וקלות בשלבים נוספים.
- הוסף 6 מ"ל של הפתרון dispase/קולגן לרקמות טחון. ואז הדגירה ב 37 ° c עבור כ 30 דקות עד 1 h.
- משבשים את הרקמה על ידי ליטוף עם הצינורות 5 מ ל 15-20 פעמים.
- מודקון ב 37 ° c עבור עוד 30 דקות עד 1 h.
- חזור על שלבים 2.3 ו-2.4 שתיים-שלוש פעמים נוספות או עד הרקמה דומה לספוגית והוא יכול בקלות לעבור דרך פתיחת הפיפטה (איור 1D).
הערה: הגודל ההתחלתי של הדגימה הרקמה וכיצד מידת העדינות של הממחטת הרקמה תקבע כמה פעמים אדם צריך לחזור על שלבים 2.3 ו 2.4. בדרך כלל, אנו מקבלים רקמות בערך 1 ס מ x 1 גודל. בנוסף, ניתן לפקח על הדיסוציאציה רקמות באמצעות תקן מיקרוסקופ הפוך תרבות הרקמה כדי לעקוב אחר ההתקדמות של דיסוציאציה של התא מן הרקמה. אשכולות קטנים של תאים הם אידיאליים עבור הצמיחה הראשונית של תאי הרוק כספירות הערבה.
3. ציפוי בארות עם מטריצות קרום מרתף
הערה: מטריצת קרום המרתף (BMM) יש להפשיר לילה ב 4 ° c יום לפני שהוא יהיה בשימוש. פעם אחת, BMM צריך להישמר כל הזמן על הקרח או ב 4 ° צ' כפי שהוא יהיה לחזק במהירות (כלומר, ליצור ג'ל) בטמפרטורות חמות יותר. בנוסף, הטיפול צריך להילקח אם הדגימות היה קריר על הקרח לפני ציפוי ב BMM כמו דגימות קר יהיה "להמיס" BMM ולחשוף את התאים לצלחת פלסטיק.
- באיטיות הצינורות BMM (לראות את הטבלה של חומרים) לתוך כל טוב להיות מצופה. באופן שווה ובאיטיות לפזר את BMM מעל הבאר.
הערה: בדרך כלל, אנו משתמשים 500 μL לכל טוב של צלחת שש-היטב, אבל זה יכול להיות מותאם לשימוש על גרסאות אחרות של צלחות כגון 12-טוב או 24-טוב, או כנדרש עבור הידרוג עבה או דק יותר. - מודטה את הצלחות מצופה ב 37 ° c עבור לפחות 15 דקות לפני השימוש כדי לאפשר את הזמן BMM לגבש.
4. סינון רקמה בלתי מתעכלת, לליזה RBC וציפוי תאים
- העברת רקמות המגון משלב 2.5 לשפופרת חרוט של 15 מ"ל. לשטוף את הצלחת פעם אחת עם 6 מ ל של מלוחים הפוספט של Dulbecco באגירה (DPBS) כדי להעביר את התאים הנותרים.
- לסנן את ההגון לתוך שפופרת 50 mL באמצעות מסננת של רשת ניילון 70 יקרומטר שינוי להסיר רקמות לא מתעכל. צנטריפוגה תאים מתוחים עבור 5 דקות ב 500 x g.
- לדלל מאגר הליזה 10x RBC ב dH מעוקר2O כדי להפוך פתרון עבודה 1x.
- . ומכה את הסופרנטאנט לאחר מכן השהה מחדש את הגלולה ב-10 מ ל של מאגר הליזה 1 x RBC. דגירה עבור 5 דקות ב 37 ° c.
- הוסף 20-25 mL של DPBS לנטרל את המאגר לפירוק RBC ולמזער את הליזה של תאים הרוק. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g.
הערה: לאחר הטיפול עם מאגר הליזה RBC, הגלולה צריכה להיות לבנה. צבע אדום בתוך הגלולה מציין כי לא כל RBC כבר במלואו. חזור על שלבים 4.4 עד 4.5 במידת הצורך עבור השלמות המלאה של כל RBC. - . ומכה את הסופרנטאנט השהה מחדש את הגלולה ב 1-2 מ ל של ברוטו לאחר מכן הניחו את התאים מחדש על בארות מצופות BMM. מודטה ב 37 ° c.
- ברגע שהוא מצופה ב-BMM, התאים יוצרים מבנים כדוריים או "כדורי ערבה" במשך תקופה של 2-3 יום. תאים ניתן לשמור על כדורי הריר עבור כ 5-7 ימים לפני BMM מתחיל לבזות המאפשר את התאים כדי לגשת ולדבוק פלסטיק ולצמוח כמונאולייר.
5. העלאת כדורי הערבה ותחזוקתו ב-BMM
- התקשורת מוחלק מבארות, ולאחר מכן להוסיף 1 מ ל של dispase/קולגן הפתרון לכל טוב ו-מודטה ב 37 ° צ' עבור ~ 15 דקות או עד BMM התפרקה בעיקר.
- העבר תאים כדי 15 מ"ל שפופרת חרוט ולשטוף בארות פעם עם DPBS כדי להשיג את התאים הנותרים. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g.
- . ומכה את הסופרנטאנט השהה את הגלולה ב-2 מ ל של טריפסין ולאחר מכן דגירה ב 37 ° c עבור 15 דקות.
- נטרל את הטריפסין באמצעות כל מדיה מלאה המכילה 10% סרום. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g.
- . ומכה את הסופרנטאנט השהה מחדש את התאים ב-DPBS כדי להסיר מדיה שיורית, טריפסין ונסיוב. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g.
- . ומכה את הסופרנטאנט השהה מחדש את התאים המושהים על מנות תרבות מצופות ב-BMM. ניתן גם לציפוי תאים שהושעו ישירות על תרבות התא שטופלו מנות להפצה כמונאולייר. לקבלת מידע נוסף אודות הצמיחה של תאי הרוק כמונאולייר, ראה סעיף 6. תאים גדלו על BMM או על פלסטיק יש להאכיל עם בז טרי מדי 2 – 3 ימים.
- תרבות התאים בתוך מחולל לחות בחממה הנשמרת ב 37 ° c עם 5% CO2.
6. שישה כדורי הערבה על מנות מטופלות של רקמה פלסטית
הערה: אם שמירה על תאים כמונאולייר על גבי פלסטיק, התחל בשלב זה. הפרוטוקול הבא חל על תאים הגדלים בצלחת 100 מ"מ.
- . מרוב את התקשורת שטוף פעם אחת עם DPBS כדי להסיר מדיה שיורית.
- הוסיפו 2 מ ג של טריפסין לאחר מכן ב-37 מעלות צלזיוס עבור 15 דקות, או עד שהתאים מנותקים לחלוטין.
- נטרל טריפסין באמצעות 4 מ ל של כל מדיה מלאה המכילה 10% סרום. העבר תאים לשפופרת חרוט בעלת 15 מ"ל.
- לשטוף את הצלחת פעם אחת עם כ 5 מ ל של DPBS לאסוף את התאים הנותרים. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g.
- . ומכה את הסופרנטאנט השהה תאים מחדש ב-6-10 mL של DPBS כדי להסיר מדיה שיורית.
- צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g.
- . והשעיה מחדש בבמ תאי לוחית על מטופלים. בתרבית רקמה מפלסטיק להאכיל עם בז טרי מדי 2-3 ימים.
- תרבות התאים בתוך מחולל לחות בחממה הנשמרת ב 37 ° c עם 5% CO2.
7. קריוגנית של תאים
הערה: ניתן לבצע הקפאה של תאים מתוך השעיית תא בודד שמקורם בתאי הערבה או התאים הגדלים במונאולייר.
- ספור את התאים במטציטוטומטר כדי לחשב את הכמות הכוללת של התאים הנוכחים.
- צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 500 x g.
- . ומכה את הסופרנטאנט השהה מחדש את הגלולה ב-באגמ עם 10% diמתיל סולפוקסיד (DMSO). ריכוז של תאים צריך להיות 2 x 106 תאים/ml כדי 10 x 106 תאים/ml.
- . תאים מחלקים לצינורות אחסון קריוגניים מניחים את הצינורות בתוך מדף קצף מבודדים ו-דגירה ב-80 ° c בלילה כדי להקפיא באיטיות את התאים.
- ביום למחרת, מניחים צינורות בחנקן נוזלי לאחסון ארוך טווח.
הערה: יש להפשיר את התאים במהירות 37 ° c. עם הפשרה, תאים צריך להיות מחורץ ב 500 x g ואת המדיה המכילה dmso להסיר לפני ציפוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שניים-שלושה ימים לאחר הציפוי התאים מרקמות מתעכל על BMM, תאים בקלות טופס אשכולות קטנים שימשיכו להרחיב בגודל של עד 15-20 תאים לכל אשכול (איור 2A). פסולת סלולרית ותאים מתים מנותקים נראים בדרך כלל ויש להסירו על ידי מועך ומחדש עם מדיה טרייה. תאים ימשיכו להתרבות כמו כדורי הערבה עבור כ 3-10 ימים, או כל עוד השכבה BMM נשאר שלם. מדי פעם, בשל פירוק חלקי של BMM, התאים יצורפו הפלסטיק הבסיסי ולהתחיל להתרבות כמונאולייר. כדורי הסאליניים שגדלו ב-BMM מציגים שינויים בגודל ובמורכבות מבנית. ניתן לתחזק את הסליספירות באמצעות העברתם אל BMM טרי כפי שמתואר בפרוטוקול. בתוך 2-3 ימים לאחר שעברו אל BMM טרי, התאים הרפורמה לתוך התחומים. תאים סאליספירה יכול גם להיות מצופה על התרבות תאים פלסטיק מטופלים וגדל כמו mon, שם הם מוצגים מורפולוגיה עקבית עם תאים של מוצא אפיתל כפי שמוצג באיור 2B. בעוד תאים הערבה גדל על bmm כמו כדורי הערבה צפויים לשמור על פניטיפ מאפיין של רקמת הרוק, התאים גדלו כמו דופלקס יכול להיות יתרון עבור כמה פרוטוקולים ניסיוניים. אפיון נרחב יותר יהיה צורך לבצע כדי לקבוע מה היקף התאים לשמור על פנוטיפ הרוק כאשר גדל על מונאולייר לעומת תאים גדל כמו כדורי הערבה.
איור 1 : עיבוד ראשוני של בלוטות הלסת האנושית להכנת הערבה. רקמת בלוטת הרוק מחפירה כ 1 ס מ בקוטר (א) הוא מכני טחון לחתיכות קטנות יותר באמצעות מספריים חדים (ב) עד בלוטת מופרד לחתיכות לעיכול של כ 1-2 מ"מ בגודל (ג). החלקים הבלוטות הם לאחר מכן מודלים ב-dispase/קולגן פתרון עבור 30-90 דקות עם מעבר תקופתי באמצעות פיפטות סרולוגית עד המדגם מתעכל בעיקר תאים בודדים או גושים קטנים של תאים (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : התאים הראשוניים של האדם העיקרי יכולים להיות מתורבתים כמו כדורים על מטריצת קרום המרתף או כמונאולייר על מאכלים מטופלים של תרבות התא. בעקבות העיכול הראשוני של רקמת הרוק, בלוטות מתעכל מצופה ישירות על BMM ותרבותי עבור 3-10 ימים. תאים מוזנים כל 2-3 ימים כדי לספק חומרים מזינים טריים. ברגע שהספירות הראשיות מתפתחות, המיטריצות יכולות להיות מעושנות בתמיסה המומנת, הטריסיזציה להפקת תאים בודדים, ומצופה מחדש ב-BMM טרי, שם הם מתעמים לתחומים (א) או מצופים על מנות תרבות תאים שבהן בקלות מורפולוגיה האבן האופיינית של מונאולייר אפיתל (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תפקוד הרוק מייצג דאגה לאיכות החיים עבור אלה הסובלים מתסמונת sjöגרנה, כמו גם אלה שעברו טיפול הקרנות סרטן בסמוך לבלוטות הרוק3,4,5, . שישה עשרה אחד הציע טיפול כדי לטפל בחולים אלה היא לגדל תאים גזע הרוק פונקציונלי או אורגנואידים בתוך מבחנה, אשר ניתן להוסיף לתוך בלוטת הרוק ניזוק כדי להחליף את הרקמה המושפעת9. בנוסף, בלוטות הרוק הם לעתים קרובות אתר להתמדה ושידור של פתוגנים אנושיים. לדוגמה, הרפס האנושי כגון cytomegalovirus ירוס האדם (מימן) ידועים להדביק ולהשתמש בלוטות הרוק ורוק לשדר וירוס מארחים חדשים7,8,17. המנגנונים המולקולריים שבבסיס ההתמדה הנגיפית בבלוטת הרוק והתנועה לרוק נותרים בלתי ידועים. הפיתוח של מערכות הרוק מחוץ למערכת מבחנה יספק מערכת מודל חיונית כדי לחקור את המידע המכונה.
אנו מדווחים כאן על פרוטוקול חזק ליצירת הרוק הראשי "כדורי הערבה" כי ניתן לגדל בתוך מבחנה או כאשכולות על BMM או כמו monolayers על פלסטיק. היכולת תרבות והפצת תאים האפיתל בלוטת הרוק האנושי הראשי מייצג פלטפורמה חשובה שבה החוקרים יכולים (1) לפתח טיפולים חלופיים עבור חולים עם ליקויים בלוטת הרוק למי אין אפשרויות אחרות קיים (2) להבין טוב יותר את הפיזיולוגיה הבסיסית הבסיסית פיתוח בלוטת הרוק, התפשטות, הפרשה, וכו '; ו (3) להגדיר מנגנונים בשימוש על ידי פתוגנים לשכפל ולהתפשט מארחים חדשים.
שימוש אלה בתרביות תאים הרוק, אנו דיווחו כי מימן מחייב מורכבים המחומש מחומש לזיהום ראשוני גם כי הנגיף ממשיך לתקופה ממושכת, מזכיר מה מתרחש עם הבאמMV ב vivo7. יתר על כן, המחקרים הפונקציונליים שלנו חשף כי תרבויות הרוק אינם מכילים פיברופיצוצים מזהם כמו הפיצוץ המעיים, מעבדה וירוסים המותאמים להיכשל להדביק ולשכפל את התאים הראשי הרוק נגזר7. בעוד השתמשנו בפרוטוקול זה כדי ליצור תאים להערכת שכפול מימן ולהתפשט במערכת הרוק הראשי, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי ליצור תאים הרוק שימושי עבור מגוון רחב של נושאי מחקר שהוזכרו לעיל. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי להתאים את הצרכים והתקציב של כל חוקר בודד. בעוד אנחנו לא אימות תנאים אחרים בעצמנו, אחרים דיווחו על הצלחה הגוברת תאים אפיתל הרוק תחת תנאי מדיה שונים. לדוגמה, בינונית שונה של מדיום הנשר (DMEM): התערובת F12 בתוספת עם גורם הגידול באפידרמיס ומקדם הצמיחה פיברובסט-2 דווח לקדם צמיחה חזקה של תאים הרוק18. לחילופין, נאם et al השתמש במדיה חיונית מינימלית בתוספת סרום של שור עוברי לפני העברת התאים לגרסה ללא סרום של מדיה צמיחה keratinocyte דיווחו על צמיחה חזקה של תאים הרוק על פלסטיק15. לכן, זה לא נראה כי התאים האפיתל הרוק התערוכה דרישה מוחלטת עבור סוג מדיה אחד מסוים, אלא להיראות לגדול ולהתרבות על מספר סוגי מדיה זמינים מסחרית.
בנוסף ניסוח מדיה, ניסוחים שונים ממברנה מרתף יכול להיות מוערך עבור היכולות שלהם כדי לתמוך חזק הרוק האפיתל צמיחה תאים. גידול של תאים על מרתף זמין מסחרית קרום המכיל מטריצות בקלות והוא מספק מערכת culturing פשוטה, אם כי יקר7,19. בדומה לעובדה שנדונה לעיל בנוגע לבחירת אמצעי התקשורת לצמיחת התאים, החוקרים דיווחו על צמיחה ופיתוח של כדורי הערבה על מספר מטריצות ומערכות הידרוג'ל שונות. הידרולים שנעשו מחומצה יאלורונית יש יתרון נוסף ביצירת מטריצה החילוץ מקושרת עם המרכיבים הכימיים הרצוי כדי ללמוד אינטראקציות שלהם ואפקטים על תאים. באמצעות רקמת האדם העיקרי הנגזרים תאים הרוק, srinivasan ואח ' דיווח על הצלחה בצמיחה ותחזוקה של אוכלוסיית הרוק מחולל קדמון בחומצה יאלורונית הידרולים; גדל צמיחת תאים מחולל קדמון נצפתה עוד כאשר ההידרוג היו משולבים עם פפטידים שמקורם במרתף קרום חלבונים כגון perlecan ו למינציה ב20. מערכת אחרת שפותחה לאחרונה על ידי Foraida ואח ' דוח באמצעות "electrospinning" כדי לפתח לגרדום nanofiber עשוי פולי (חומצת חלב-co-החומצה הגליקולית) (PLGA). The PLGA הידרוג'לים עם אלסטין הוסיף נמצאו בקלות לקדם את הפיתוח של מערכת תא תת הלסת מקוטב, אשר עשוי להיות שימושי ברור כיצד פולריזציה התא משפיע על ביולוגיה הרוק ו ביוכימיה21.
בפרוטוקול זה, הצגנו שיטה פשוטה לבידוד וצמיחה של תאים האפיתל בלוטת הרוק העיקרי הנגזר. פרוטוקול זה מביא את הצמיחה המהירה של אוכלוסיה של תאים אפיתל שניתן לשמור בממוצע עבור 5-8 מעברים. זה קריטי לפקח על הרקמה במהלך הטיפול עם dispase/קולגן כדי להבטיח את העיכול המתאים כפי שהוזכר בפרוטוקול. עיכול לא מושלם יפחית באופן חמור את מספר כדורי הסאליש השורדים. חשוב גם לנטר את התרבויות לצמיחת הגידולים בעלי צורה מאורכים ומאוד ברורים מתאי האפיתל המצולעים הגדלים בדרך כלל בכתמים בדידים או בגושים. השתמשנו בפרוטוקול זה עבור בידוד של תאים אפיתל מבני אדם ועכברים, אבל נראה כי זה יכול להיות מותאם לשימוש עם מערכות יונקים אחרים. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות שונה עוד יותר באמצעות שלבי טיהור נוספים המבוססים על ביטוי סמן משטח התא ואת cy, הזרימה העלולה להוביל ליצירת אוכלוסיות הומוגנית יותר של תאים התחלתיים. באופן דומה, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לקבוע כיצד הניסוח שונה מדיה או מטריצה/הידרוג'ל להוביל את הצמיחה של סוגי תאים ספציפיים כאשר הראשון ליצור את הכדורים. לסיכום, פרוטוקול זה צריך לשמש פלטפורמת התחלה חזקה עבור בידוד וצמיחה של תאי הרוק העיקרי אשר ניתן בקלות להתאים עבור מגוון רחב של פרוטוקולים ניסיוניים ואזורי מחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. המחברים לא מדווחים על דבר לחשוף
Acknowledgments
ברצוני להודות לג פ. ברידג על מתן הדרכה משמעותית למתודולוגיות המעורבות בתאים ראשוניים של מעגלי התפירה. מתיו J. ביופורד היה נתמך על ידי המכונים הלאומיים של מלגת הכשרת בריאות T32-ES007250. עבודה זו נתמכת גם על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים R01-AI121028 ו R21-DE026267 הוענק לוויליאם E. מילר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dishes | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Media | Lonza | CC-3171 | Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum. |
| Cell strainer 70 µm nylon mesh | Fisher | 22-363-548 | |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Gibco | 12676-029 | |
| Collagenase type III | Worthington | LS004182 | Store at 4 °C. |
| Cryogenic Tube | Fisher | 5000-0020 | |
| Dispase | Cell Applications | 07923 | Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C. |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Dulbecco phosphate buffered saline | Corning | 55-031-PC | |
| General Chemicals | Sigma | ||
| PathClear Basement membrane extract | Cultrex | 3432-005-01 | Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice. |
| Six-well culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Surgical forceps | Fisher | 22-079-742 | |
| Trypsin-EDTA solution | Corning | 25-052-CI |
References
- Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).
- Holmberg, K. V., Hoffman, M. P. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. Monographs in Oral Science. Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. 24, S. KARGER AG. 1-13 (2014).
- Vissink, A., et al. Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).
- Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases. Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).
- Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. Ten-year observation of patients with primary Sjögren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes. International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review. Cancer. 107, 2525-2534 (2006).
- Morrison, K. M., et al. Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium. Journal of Virology. , (2018).
- Pomeroy, C., Englund, J. A. Cytomegalovirus: epidemiology and infection control. American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).
- Maimets, M., et al. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).
- Varghese, J. J., et al. Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells. Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).
- Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers. Oral Diseases. , (2018).
- Lin, L. C., et al. Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study. Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).
- Tran, S. D., et al. Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland. Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).
- Pringle, S., et al. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Nam, H., et al. Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures. Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).
- Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).
- Cannon, M. J., et al. Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children. BMC Infect. Dis. 14, (2014).
- Pringle, S., et al. Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy. STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).
- Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).
- Foraida, Z. I., et al. Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization. Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).
