Summary
Wir präsentieren eine Methode zur Isolierung und Kultivierung primärer menschlicher Speicheldrüsen-abgeleiteten Epithelzellen. Diese Zellen zeigen Genexpressionsmuster, die mit ihrem Epithel-Ursprung übereinstimmen und können als Salisphären auf Kellermembranmatrizen aus Engelbreth-Holm-Schwarm-Tumorzellen oder als Monolayer auf behandelten Kulturgerichten angebaut werden.
Abstract
Die Speicheldrüsen sind ein Ort von erheblichem Interesse für Forscher, die an mehreren Aspekten der menschlichen Krankheit interessiert sind. Ein Ziel der Forscher ist es, die Funktion der Drüsen wiederherzustellen, die durch Strahlentherapien oder aufgrund von Pathologien im Zusammenhang mit dem Sjögren-Syndrom geschädigt sind. Ein zweites Ziel der Forscher ist es, die Mechanismen zu definieren, durch die sich Viren im Drüsengewebe replizieren, wo sie dann Zugang zu Speicheldrüsenflüssigkeiten erhalten können, die für die horizontale Übertragung wichtig sind. Diese Ziele unterstreichen die Notwendigkeit eines robusten und zugänglichen In-vitro-Speicheldrüsenmodells, das von Forschern genutzt werden kann, die sich für die oben genannten sowie verwandten Forschungsbereiche interessieren. Hier diskutieren wir ein einfaches Protokoll, um Epithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen zu isolieren und sie in vitro zu vermehren. Unser Protokoll kann weiter optimiert werden, um den Anforderungen einzelner Studien gerecht zu werden. Kurz gesagt, Speicheldrüsengewebe wird mechanisch und enzymatisch getrennt, um einzelne Zellen oder kleine Zellhaufen zu isolieren. Die Auswahl für Epithelzellen erfolgt durch Beschichtung auf einer Kellermembranmatrix in Gegenwart von Medien, die optimiert sind, um das Epithelzellwachstum zu fördern. Diese resultierenden Kulturen können als dreidimensionale Cluster, als "Salisphären" bezeichnet, oder als Monolayer auf behandelten Kunststoff-Gewebekultur-Gerichten angebaut werden. Dieses Protokoll führt zum Auswuchs einer heterogenen Population hauptsächlich epitheliale Zellen, die für 5-8 Passagen (15-20 Populationsverdoppelungen) propagiert werden können, bevor sie sich einer zellulären Seneszenz unterziehen.
Introduction
Bei Säugetieren sind die Speicheldrüsen in 3 Paare von Hauptspeicheldrüsen organisiert: die Ohrspeicheldrüsen, submandibulären und sublingualen Drüsen. Es gibt auch eine Reihe von kleineren Drüsen auf der Zunge und verstreut in der Mundhöhle1. Die Hauptdrüsen sind verantwortlich für das Massenvolumen des erzeugten Speichels2. Neben dem antimikrobiellen Schutz durch sezernierte Faktoren ist der Speichel wichtig für den Prozess des Kauens und Schmierens von Lebensmitteln, während er durch die Speiseröhre geht2. Als solche, Speicheldrüsenfunktionsstörungen stellt ein medizinisches Problem, wo Betroffene, die nicht in der Lage sind, genug Speichel zu produzieren sind anfälliger für die Entwicklung von Krankheiten wie Zahnhöhlen oder orale Candidiasis3. Darüber hinaus führt reduzierter Speichel zu größeren Schwierigkeiten beim Essen und Verdauen von Lebensmitteln, die einen erheblichen Einfluss auf die Lebensqualität haben.
Speicheldrüsenfunktionsstörungen finden sich vor allem bei Patienten mit Sjögren-Syndrom, einer Autoimmunerkrankung oder bei Patienten mit Kopf- und Nackenkrebs, die einer Bestrahlungstherapie unterzogen wurden3,4,5, 6. Beschädigte sekretotische Acini in den Drüsen als Folge von Autoimmunität oder Strahlentherapie unterziehen sich keiner Selbsterneuerung, was dazu führt, dass ein Patient mit irreversiblen Schäden lebt6. Die Untersuchung von Speicheldrüsen hat auch die Aufmerksamkeit oder Forscher, die an Mechanismen der viralen Pathogenese interessiert. Einige Krankheitserreger, wie das menschliche Zytomegalievirus (HCMV), replizieren sich hartnäckig innerhalb der Speicheldrüsen, was dann die Übertragung des entstehenden Virus auf einen neuen Wirt über Speichel7,8ermöglicht. Daher besteht ein unerfülltes Bedürfnis, robuste und reproduzierbare In-vitro-Modelle von Speicheldrüsengewebe zu entwickeln, um eine Vielzahl medizinischer Probleme anzugehen und zu verstehen.
Mehrere Modelle des murinen Speicheldrüsensystems wurden als Ausgangspunkt verwendet, um die verschiedenen Epithelzellen zu verstehen und zu charakterisieren, die die Speicheldrüsen9,10bilden. Es gibt offensichtliche und große Unterschiede zwischen menschlichen und murinen Speicheldrüsen11. Vor allem die menschliche Ohrspeicheldrüse ist größer im Verhältnis zur submandibulären Drüse, während die Maus submanddibuläre und Ohrspeicheldrüse sind viel ähnlich in Größe1,2,11. Während verewigte menschliche submandibuläre Zelllinien existieren, gibt es große Bedenken, dass die verewigten Zellen den Phänotyp des primären Gewebes nicht genau aufrechterhalten, und sekundäre Bedenken, dass die verewigten Zellen nicht tatsächlich von Speichelepithel selbst12. Aus diesen Gründen gibt es ein Interesse und die Notwendigkeit, primäre speicheldrüsengewebe vom Menschen zu studieren.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung primärer Epithelzellen aus menschlichen Speicheldrüsen für die Gewebekultur. Unser Protokoll basiert auf den Arbeiten von Pringle et al. und Tran et al. mit Änderungen, die vorgenommen wurden, um ihre Verfahren generell zu vereinfachen13,14. Erstens: Während das Protokoll von Tran et al. eine lange fünfstündige Inkubation zur enzymatischen Verdauung des Speicheldrüsengewebes fordert, war unser modifiziertes Protokoll mit nur einer Stunde Inkubation erfolgreich, ähnlich wie in Pringle et al. Zweitens verwenden wir verschiedene Enzyme für die Gewebeverdauung, vor allem verwenden wir Trypsin nicht, wie es im ursprünglichen Tran et al.-Protokoll verwendet wird, sondern verwenden eine Mischung aus Dispase und Kollagennase. Wir ziehen es vor, Trypsin in den ersten Verdauungsschritten zu vermeiden, da eine aktuelle Studie nahelegte, dass die Erstverdauung des Speichelgewebes durch Trypsin zu einer verminderten Zelllebensfähigkeit führt, möglicherweise durch den Verlust einer seltenen Stammzellpopulation15. Schließlich bewirtschaften wir die Salisphären auf der Oberfläche der Kellermembranmatrix (BMM) mit einem kommerziell erhältlichen Medium, das ursprünglich für die Ausbreitung von Bronchialepithelzellen entwickelt wurde. Unser Protokoll kann verwendet werden, um Speicheldrüsenzellen aus Ohrspeicheldrüsen, submandibulären und sublingualen Drüsen zu isolieren. Diese Zellen drücken Speicheldrüsenamylase und andere Speicheldrüsen-spezifische Gene aus, was darauf hindeutet, dass sie einen Phänotyp beibehalten, der dem von Speicheldrüsen-Acinar-Epithelzellenähnelt 7. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich Speicheldrüsenkulturen aus >50 primären menschlichen Gewebeproben erzeugt. Darüber hinaus können die primären Speicheldrüsenzellen leicht kryokonserviert werden, um sie zu einem späteren Zeitpunkt zu verwenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Diese Protokolle und Studien wurden vom Institutional Review Board der Universität Cincinnati überprüft und genehmigt (Federal-wide Assurance #00003152, IRB-Protokoll 2016-4183). Speichelgewebe wird häufig in vielen Kopf-und Hals chirurgische nusziert und ist in der Regel unbeteiligtdurcht durch den bösartigen Prozess. Typischerweise wird frisch resektiertes Speicheldrüsengewebe innerhalb von 2-4 h nach der Entfernung vom Patienten verwendet (Abbildung 1A).
1. Reagenz-Vorbereitung
-
Bronchialepitheliale Zellwachstumsmedium (BEGM)
- Fügen Sie Komponenten aus dem vom Hersteller bereitgestellten Kit hinzu (siehe Tabelle der Materialien).
- Waschen Sie jedes Rohr einmal mit dem Basismedium, um eine vollständige Übertragung der Komponenten zu gewährleisten. Dann fügen Sie Holzkohle abgestreift fetales Rinderserum, um eine endgültige Konzentration von 4% Serum zu machen.
-
Red Blood Cell (RBC) Lysepuffer
- Um 10x Lager zu machen, fügen Sie 40,15 g NH4Cl, 5,0 g NaHCO3und 0,186 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzu und bringen bis zu einem Endvolumen von 200 ml mit dH2O. Dann sterilisieren und bei 4 °C lagern.
- Vor der Anwendung auf eine Arbeitskonzentrationvon 1x in sterilem dH2 O verdünnen.
-
Dissoziationslösung
- Zu einer 100 ml Flasche Dispase-Lösung (siehe Materialtabelle) 0,15 g Kollagenase Typ III hinzufügen. Nachdem sich die Kollagenase vollständig aufgelöst hat, sterilisieren Filter die neue Lösung und aliquot. Bei -20 °C lagern.
2. Gewebeverdauung
- Mit einer 100-mm-Gewebekulturplatte wird das Gewebe mit autoklavensterilisierten Sezierenscheren und chirurgischen Zangen mechanisch in feine Stücke mit einer Größe von 1-2 mm zerkleinern (Abbildung 1B,C). Das Bindegewebe zwischen den Teilen sollte geschnitten werden, um eine ordnungsgemäße Trennung zu gewährleisten und in weiteren Schritten zu erleichtern.
- 6 ml der Dispase/Kollagenase-Lösung in das gehackte Gewebe geben. Dann bei 37 °C ca. 30 min bis 1 h inkubieren.
- Stören Sie das Gewebe durch Pipettieren mit einer 5 ml serologischen Pipette 15-20 Mal.
- Bei 37 °C weitere 30 min bis 1 h inkubieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4 zwei-drei mal oder bis das Gewebe einer Gülle ähnelt und leicht durch die Pipettenöffnung passieren kann (Abbildung 1D).
HINWEIS: Die Anfangsgröße der Gewebeprobe und wie feine Gewebeminzeder bestimmen, wie oft man die Schritte 2.3 und 2.4 wiederholen muss. Typischerweise erhalten wir Gewebe ca. 1 cm x 1 cm Größe. Zusätzlich kann man die Gewebedissoziation mit einem Standard-Invertierten Gewebekulturmikroskop überwachen, um den Fortschritt der Zelldissoziation vom Gewebe zu verfolgen. Kleine Zellhaufen sind ideal für das anfängliche Auswachsen von Speicheldrüsenzellen als Speichelsphären.
3. Beschichtung von Brunnen mit Kellermembranmatrix
HINWEIS: Die Kellermembranmatrix (BMM) sollte am Tag vor ihrer Verwendung über Nacht bei 4 °C aufgetaut werden. Nach dem Auftauen sollte BMM ständig auf Eis oder bei 4 °C gehalten werden, da es sich bei wärmeren Temperaturen schnell erstarren (d. h. ein Gel bilden) wird. Darüber hinaus ist Vorsicht geboten, wenn Proben vor der Beschichtung auf BMM auf Eis gekühlt wurden, da kalte Proben das BMM "schmelzen" und Zellen der Kunststoffschale aussetzen.
- Langsam Pipette BMM (siehe Materialtabelle) in jeden zu beschichtenden Brunnen. Gleichmäßig und langsam verteilen Sie das BMM über den Brunnen.
HINWEIS: Im Allgemeinen verwenden wir 500 l pro Bohrgut einer Sechs-Brunnen-Platte, aber dieses Volumen kann für den Einsatz auf anderen Varianten von Platten wie 12-Well oder 24-Well oder nach Bedarf für dickere oder dünnere Hydrogele eingestellt werden. - Inkubieren Sie die beschichteten Platten mindestens 15 min bei 37 °C, bevor Sie sie verwenden, damit sich die BMM-Zeit erstarren kann.
4. Filterung von unverdautem Gewebe, RBC-Lyse und Zellbeschichtung
- Gewebe homogenisieren von Schritt 2,5 auf ein 15 ml konisches Rohr. Waschplatte einmal mit 6 ml Dulbecco Phosphat gepufferte Kochchen (DPBS) zu übertragen verbleibenden Zellen.
- Filtern Sie das Homogenat durch ein 70 m sm Nylon-Netzzellensieb in ein 50 ml konisches Rohr, um unverdautes Gewebe zu entfernen. Zentrifugen-gespannte Zellen für 5 min bei 500 x g.
- 10x RBC-Lysepuffer in sterilem dH2O verdünnen, um eine 1x Arbeitslösung herzustellen.
- Aspirieren Sie den Überstand. Setzen Sie das Zellpellet dann in 10 ml 1x RBC-Lysepuffer wieder aus. 5 min bei 37 °C inkubieren.
- Fügen Sie 20-25 ml DPBS hinzu, um den RBC-Lysepuffer zu neutralisieren und die Lyse von Speicheldrüsenzellen zu minimieren. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g.
HINWEIS: Nach der Behandlung mit RBC-Lysepuffer sollte das Zellpellet weiß sein. Rote Farbe im Pellet zeigt an, dass nicht alle RBC vollständig lysiert wurden. Wiederholen Sie die Schritte 4.4 bis 4.5, falls erforderlich, um die vollständige Lyse aller RBC zu lysieren. - Aspirieren Sie den Überstand. Das Pellet in 1-2 ml BEGM pro Brunnen wieder aufsetzen und resuspendierte Zellen auf BMM-beschichtete Bohrungen legen. Bei 37 °C inkubieren.
- Einmal auf BMM plattiert, bilden sich Zellen über einen Zeitraum von 2-3 Tagen zu sphärischen Strukturen oder "Salisphären". Zellen können als Salisphären für etwa 5-7 Tage gehalten werden, bevor das BMM zu abbauen beginnt, so dass die Zellen auf den Kunststoff zugreifen und haften und als Monolayer wachsen.
5. Unterkultivierung der Speichelsphären und Wartung auf BMM
- Saugen Sie Medien aus Brunnen, fügen Sie dann 1 ml Dispase/Kollagenase-Lösung zu jedem Brunnen und inkubieren bei 37 °C für 15 min oder bis BMM sich weitgehend aufgelöst hat.
- Übertragen Sie Zellen in ein 15 ml konisches Rohr und waschen Sie Brunnen einmal mit DPBS, um verbleibende Zellen zu erhalten. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g.
- Aspirieren Sie den Überstand. Das Pellet in 2 ml Trypsin wieder aufhängen und dann bei 37 °C für 15 min inkubieren.
- Neutralisieren Sie das Trypsin mit allen vollständigen Medien, die 10% Serum enthalten. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g.
- Aspirieren Sie den Überstand. Unterbrechen Sie die Zellen in DPBS, um Restmedien, Trypsin und Serum zu entfernen. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g.
- Aspirieren Sie den Überstand. In BEGM aufsetzen und die resuspendierten Zellen auf erstarrte BMM-beschichtete Kulturgerichte aufgeben. Resuspendierte Zellen können auch direkt auf zellkulturbehandelte Gerichte zur Proliferation als Monoschicht plattiert werden. Weitere Informationen zum Wachstum von Speicheldrüsenzellen als Monoschicht finden Sie in Abschnitt 6. Zellen, die auf BMM oder auf Kunststoff angebaut werden, sollten alle 2–3 Tage mit frischem BEGM gefüttert werden.
- Kultur die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei37 °C mit 5% CO2 gehalten.
6. Subkulieren der Speichelsphären auf behandelten Kunststoff-Gewebekultur-Gerichte
HINWEIS: Wenn Sie Zellen als Monolayer auf Kunststoff beibehalten, beginnen Sie mit diesem Schritt. Das folgende Protokoll gilt für Zellen, die in einer 100-mm-Schale wachsen.
- Aspirieren Sie die Medien. Einmal mit DPBS waschen, um Restmedien zu entfernen.
- Fügen Sie 2 ml Trypsin hinzu und inkubieren Sie dann bei 37 °C für 15 min, oder bis sich die Zellen vollständig gelöst haben.
- Neutralisieren Sie Trypsin mit 4 ml aller vollständigen Medien, die 10% Serum enthalten. Übertragen Sie Zellen in ein 15 ml konisches Rohr.
- Waschen Sie die Platte einmal mit ca. 5 ml DPBS, um verbleibende Zellen zu sammeln. Zentrifuge für 5 min bei 500 x g.
- Aspirieren Sie den Überstand. Resuspend Zellen in 6-10 ml DPBS, um Restmedien zu entfernen.
- Zentrifuge für 5 min bei 500 x g.
- Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie in BEGM. Plattenzellen auf behandelte Kunststoff-Gewebekultur-Gerichte. Füttern Sie alle 2-3 Tage mit frischem BEGM.
- Kultur die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei37 °C mit 5% CO2 gehalten.
7. Kryokonservierung von Zellen
HINWEIS: Die Kryokonservierung von Zellen kann aus einer Einzelzellsuspension erfolgen, die entweder aus Salisphären- oder monolayern zellenischen Zellen stammt.
- Zählen Sie die Zellen auf einem Hämatozytometer, um die Gesamtmenge der vorhandenen Zellen zu berechnen.
- Zentrifuge für 5 min bei 500 x g.
- Aspirieren Sie den Überstand. Das Pellet in BEGM mit 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) wieder aufsetzen. Die Konzentration der Zellen sollte 2 x 106 Zellen/ml bis 10 x 106 Zellen/ml betragen.
- Aliquot-Zellen in sterile kryogene Speicherröhrchen. Die Rohre in ein isoliertes Schaumgestell legen und bei -80 °C über Nacht brüten, um die Zellen langsam einzufrieren.
- Legen Sie am nächsten Tag Rohre in flüssigen Stickstoff für die Langzeitlagerung.
HINWEIS: Zellen sollten bei 37 °C schnell aufgetaut werden. Beim Auftauen sollten die Zellen mit 500 x g pelletiert und das DMSO-haltige Medium vor der Beschichtung entfernt werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zwei-drei Tage nach der Beschichtung von Zellen aus verdautem Gewebe auf BMM bilden Zellen leicht kleine Cluster, die sich weiterhin in der Größe von bis zu 15-20 Zellen pro Cluster ausdehnen werden (Abbildung 2A). Zelluläre Trümmer und abgetrennte abgestorbene Zellen sind in der Regel zu sehen und sollten durch Ansaugen und Auffüllen mit frischen Medien entfernt werden. Zellen werden sich als Salisphären für etwa 3-10 Tage weiter ausbreiten, oder solange die BMM-Schicht intakt bleibt. Gelegentlich werden Zellen aufgrund eines teilweisen Zusammenbruchs des BMM an den darunter liegenden Kunststoff gebunden und beginnen sich als Monolayer zu vermehren. Salisphären, die auf BMM angebaut werden, weisen eine Variabilität in Größe und struktureller Komplexität auf. Salisphären können aufrechterhalten werden, indem sie an frisch zubereitete BMM weitergegeben werden, wie im Protokoll beschrieben. Innerhalb von 2-3 Tagen nach der Übergabe an frisches BMM werden sich die Zellen in Sphären reformieren. Salisphärenzellen können auch auf zellkulturbehandelten Kunststoff plattiert und als Monolayer angebaut werden, wo sie eine Morphologie aufweisen, die mit Zellen epitheliaalen Ursprungs übereinstimmt, wie in Abbildung 2Bdargestellt. Während die Speicheldrüsenzellen, die auf BMM als Salisphären angebaut werden, wahrscheinlich einen Phänotyp beibehalten, der charakteristischer für Speichelgewebe ist, können die zellen, die als Monolayer angebaut werden, für einige experimentelle Protokolle von Vorteil sein. Es muss eine umfassendere Charakterisierung durchgeführt werden, um zu bestimmen, inwieweit die Zellen einen Speichelhännotyp beibehalten, wenn sie auf einer Monoschicht angebaut werden, im Vergleich zu Zellen, die als Salisphären angebaut werden.
Abbildung 1 : Erstverarbeitung menschlicher submandibulärer Drüsen zur Herstellung der Salisphäre. Ausgeschnittenes Speicheldrüsengewebe mit einem Durchmesser von ca. 1 cm (A) wird mit einer scharfen Schere (B ) mechanisch in kleinere Stücke zerkleinert, bis die Drüse in verdauliche Stücke von ca. 1-2 mm Größe (C)getrennt wird. Die Drüsenstücke werden dann in der Dispase/Kollagenase-Lösung für 30-90 min mit periodischem Durchgang durch serologische Pipetten inkubiert, bis die Probe zu meist einzelnen Zellen oder kleinen Zellklumpen verdaut wird (D). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : Primäre menschliche Speichelditenzellen können als Kugeln auf der Kellermembranmatrix oder als Monolayer auf behandelten Zellkulturschalen kultiviert werden. Nach der Erstverdauung des Speichelgewebes werden die verdauten Drüsen direkt auf BMM plattiert und für 3-10 Tage kultiviert. Die Zellen werden alle 2-3 Tage gefüttert, um frische Nährstoffe zu liefern. Sobald sich die primären Salisphären entwickeln, können die Matrizen in Dispase/Kollagenase-Lösung verdaut, versucht werden, einzelne Zellen zu erzeugen, und auf frische BMM neu plattiert werden, wo sie sich in Sphären (A) reformieren oder auf Zellkulturgerichte plattiert werden, wo sie bilden leicht eine Kopfsteinpflastermorphologie typisch für eine epitheliale Monolayer (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Salivary Dysfunktion stellt ein Anliegen für die Lebensqualität für diejenigen, die mit Sjögren-Syndrom sowie diejenigen, die Strahlentherapie für Krebse neben den Speicheldrüsen3,4,5, 16. Eine vorgeschlagene Therapie zur Behandlung dieser Patienten ist das Anwachsen funktioneller Speichelstammzellen oder Organoide in vitro, die dann in beschädigte Speicheldrüse eingeführt werden können, um das betroffene Gewebe zu ersetzen9. Darüber hinaus sind Speicheldrüsen oft ein Ort für Persistenz und Übertragung von menschlichen Krankheitserregern. Zum Beispiel, menschliche Herpesviren wie menschliche Zytomegalievirus (HCMV) sind dafür bekannt, zu infizieren und verwenden Sie die Speicheldrüsen und Speichel, um Virus auf neue Wirte zu übertragen7,8,17. Die molekularen Mechanismen, die der viralen Persistenz in der Speicheldrüse und der Bewegung zum Speichel zugrunde liegen, bleiben unbekannt. Die Entwicklung von In-vitro-Speichelzellsystemen wird ein wesentliches Modellsystem bieten, um diese mechanistischen Informationen zu erforschen.
Wir berichten hier über ein robustes Protokoll zur Erzeugung von primären Speicheldrüsen-"Salisphären", die in vitro entweder als Cluster auf BMM oder als Monolayer auf Kunststoff angebaut werden können. Die Fähigkeit, primäre menschliche Speicheldrüsenepithelzellen zu kultiieren und zu vermehren, stellt eine wichtige Plattform dar, auf der Forscher (1) potenziell Ersatztherapien für Patienten mit Speicheldrüsenmangel entwickeln können, für die keine anderen Möglichkeiten bestehen. vorhanden sind; (2) die grundlegende Physiologie, die der Entwicklung der Speicheldrüsen, der Proliferation, der Sekretion usw. zugrunde liegt, besser zu verstehen; und (3) Mechanismen definieren, die von Krankheitserregern zur Replikation und Verbreitung auf neue Wirte verwendet werden.
Mit diesen Speichelzellkulturen, Wir haben berichtet, dass HCMV benötigt die pentamerische Glykoprotein-Komplex für primäre Infektion und auch, dass das Virus für einen längeren Zeitraum persisten, erinnert an das, was mit HCMV in vivo7auftritt. Darüber hinaus haben unsere funktionellen Studien gezeigt, dass die Speicheldrüsenkulturen keine kontaminierenden Fibroblasten als Fibroblasten enthalten, laborangepasste Viren können sich nicht in die primären Speicheldrüsenzellen infizieren und vermehren7. Während wir dieses Protokoll verwendet haben, um Zellen für die Auswertung der HCMV-Replikation zu generieren und in einem primären Speicheldrüsensystem zu verbreiten, könnte dieses Protokoll leicht angepasst werden, um Speicheldrüsenzellen zu erzeugen, die für die breite Palette der oben genannten Forschungsthemen nützlich sind. Darüber hinaus könnte dieses Protokoll an die Bedürfnisse und das Budget jedes einzelnen Forschers angepasst werden. Während wir andere Bedingungen selbst nicht validiert haben, haben andere berichtet, dass es erfolgreich an wachsenden Speichelepithelzellen unter verschiedenen Medienbedingungen gibt. Zum Beispiel, Dulbecco modifiziert Eagle Medium (DMEM):F12 Mischung mit epidermalen Wachstumsfaktor und Fibroblasten Wachstumsfaktor-2 ergänzt wurde berichtet, um robustes Wachstum der Speicheldrüsenzellen zu fördern18. Alternativ, Nam et al. verwenden minimale essentielle Medien mit fetalem Rinderserum ergänzt, bevor sie die Zellen auf eine serumfreie Version eines Keratinozyten-Wachstumsmediums übertragen und haben ein robustes Wachstum von Speicheldrüsenzellen auf Kunststoff15berichtet. Es scheint also nicht, dass die Speicheldrüsenepithelzellen eine absolute Anforderung für einen bestimmten Medientyp aufweisen, sondern scheinen auf einer Reihe kommerziell erhältlicher Medientypen zu wachsen und sich zu vermehren.
Neben der Medienformulierung könnten verschiedene Kellermembranformulierungen auf ihre Fähigkeiten zur Unterstützung eines robusten Speichelspeichelepithelzellwachstums untersucht werden. Das Wachstum von Zellen auf kommerziell erhältlichen Kellermembran-haltigen Matrizen liefert leicht Salisphären und bietet ein einfaches, wenn auch teures Kultivierungssystem7,19. Ähnlich wie die oben diskutierte über die Wahl der Medien für das Zellwachstum, Forscher haben Wachstum und Entwicklung von Salisphären auf einer Reihe von verschiedenen Matrizen und Hydrogel-Systeme berichtet. Hydrogele aus Hyaluronsäure haben den zusätzlichen Vorteil bei der Schaffung einer extrazellulären Matrix, die mit den gewünschten chemischen Bestandteilen vernetzt ist, um ihre Wechselwirkungen und Auswirkungen auf Zellen zu untersuchen. Mit primären menschlichen Gewebe abgeleitet Speicheldrüsenzellen, Srinivasan et al. berichteten Erfolg beim Wachstum und Dieaufrechterhaltung einer Speicheltier-Vorläufer-Zellpopulation in Hyaluronsäure-Hydrogelen; Erhöhtes Wachstum der Vorläuferzellen wurde weiter beobachtet, wenn die Hydrogele mit Peptiden aus den Kellermembranproteinen wie Perlecan und Laminin20eingearbeitet wurden. Ein weiteres System, das kürzlich von Foraida et al. entwickelt wurde, berichtet mit "Elektrospinnen", um ein Nanofasergerüst aus Poly (Milch-Co-Glykolsäure) (PLGA) zu entwickeln. Die PLGA-Hydrogele mit zugesetztem Elastin förderten leicht die Entwicklung eines polarisierten submandibulären Zellsystems, das nützlich sein kann, um festzustellen, wie die Zellpolarisation die Speicheldrüsenbiologie und Biochemie beeinflusst21.
In diesem Protokoll haben wir eine einfache Methode zur Isolierung und zum Wachstum von primären Speicheldrüsen-abgeleiteten Epithelzellen vorgestellt. Dieses Protokoll führt zu einem schnellen Auswuchs einer Epithelzellpopulation, die im Durchschnitt für 5-8 Passagen aufrechterhalten werden kann. Es ist wichtig, das Gewebe während der Behandlung mit Dispase/Kollagenase zu überwachen, um eine angemessene Verdauung zu gewährleisten, wie im Protokoll erwähnt. Eine unvollständige Verdauung wird die Anzahl der Überlebenden der Salisphären stark verringern. Es ist auch wichtig, die Kulturen für das Auswachsen von Fibroblasten zu überwachen, die eine längliche Form haben und sich sehr von den polygonalen Epithelzellen unterscheiden, die typischerweise in diskreten Flecken oder Klumpen wachsen. Wir haben dieses Protokoll für die Isolierung von Epithelzellen von Menschen und Mäusen verwendet, aber es scheint wahrscheinlich, dass es für die Verwendung mit anderen Säugetiersystemen angepasst werden könnte. Darüber hinaus könnte dieses Protokoll durch zusätzliche Reinigungsschritte auf der Grundlage der Zelloberflächenmarkerexpression und der Durchflusszytometrie weiter modifiziert werden, die zur Erzeugung homogenerer Anfangszellpopulationen führen könnten. In ähnlicher Weise könnte dieses Protokoll verwendet werden, um zu bestimmen, wie unterschiedliche Medien- oder Matrix-/Hydrogel-Formulierungen zum Auswachsen bestimmter Zelltypen führen, wenn die Salisphären zuerst erzeugt werden. Zusammenfassend möchte ich sagen, dass dieses Protokoll als robuste Startplattform für die Isolierung und das Wachstum von primären Speichelzellen dienen sollte, die leicht für eine Vielzahl von experimentellen Protokollen und Forschungsbereichen angepasst werden kann.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren berichten nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir möchten James P. Bridges für die wichtige Anleitung zu den Methoden für die Kultivierung von Primärzellen danken. Matthew J. Beucler wurde vom National Institutes of Health Training Grant T32-ES007250 unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch die Stipendien der National Institutes of Health R01-AI121028 und R21-DE026267 an William E. Miller unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dishes | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Media | Lonza | CC-3171 | Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum. |
| Cell strainer 70 µm nylon mesh | Fisher | 22-363-548 | |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Gibco | 12676-029 | |
| Collagenase type III | Worthington | LS004182 | Store at 4 °C. |
| Cryogenic Tube | Fisher | 5000-0020 | |
| Dispase | Cell Applications | 07923 | Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C. |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Dulbecco phosphate buffered saline | Corning | 55-031-PC | |
| General Chemicals | Sigma | ||
| PathClear Basement membrane extract | Cultrex | 3432-005-01 | Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice. |
| Six-well culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Surgical forceps | Fisher | 22-079-742 | |
| Trypsin-EDTA solution | Corning | 25-052-CI |
References
- Kessler, A. T., Bhatt, A. A. Review of the Major and Minor Salivary Glands, Part 1: Anatomy, Infectious, and Inflammatory Processes. Journal of Clinical Imaging Science. 8, 47 (2018).
- Holmberg, K. V., Hoffman, M. P. Anatomy, Biogenesis and Regeneration of Salivary Glands. Monographs in Oral Science. Ligtenberg, A. J. M., Veerman, E. C. I. 24, S. KARGER AG. 1-13 (2014).
- Vissink, A., et al. Prevention and Treatment of the Consequences of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 213-225 (2003).
- Gualtierotti, R., Marzano, A., Spadari, F., Cugno, M. Main Oral Manifestations in Immune-Mediated and Inflammatory Rheumatic Diseases. Journal of Clinical Medicine. 8, 21 (2018).
- Tsukamoto, M., Suzuki, K., Takeuchi, T. Ten-year observation of patients with primary Sjögren's syndrome: Initial presenting characteristics and the associated outcomes. International Journal of Rheumatology. Dis. , (2018).
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: A literature review. Cancer. 107, 2525-2534 (2006).
- Morrison, K. M., et al. Development of a primary human cell model for the study of human cytomegalovirus replication and spread within salivary epithelium. Journal of Virology. , (2018).
- Pomeroy, C., Englund, J. A. Cytomegalovirus: epidemiology and infection control. American Journal of Infection Control. 15, 107-119 (1987).
- Maimets, M., et al. Long-Term In Vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6, 150-162 (2016).
- Varghese, J. J., et al. Salivary gland cell aggregates are derived from self-organization of acinar lineage cells. Archives of Oral Biology. 97, 122-130 (2019).
- Maruyama, C., Monroe, M., Hunt, J., Buchmann, L., Baker, O. Comparing human and mouse salivary glands: A practice guide for salivary researchers. Oral Diseases. , (2018).
- Lin, L. C., et al. Cross-contamination of the human salivary gland HSG cell line with HeLa cells: A STR analysis study. Oral Diseases. 24, 1477-1483 (2018).
- Tran, S. D., et al. Primary Culture of Polarized Human Salivary Epithelial Cells for Use in Developing an Artificial Salivary Gland. Tissue Engineering. 11, 172-181 (2005).
- Pringle, S., et al. Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Nam, H., et al. Characterization of Primary Epithelial Cells Derived from Human Salivary Gland Contributing to in vivo Formation of Acini-like Structures. Molecules and Cells. 41, 515-522 (2018).
- Vissink, A., Jansma, J., Spijkervet, F. K. L., Burlage, F. R., Coppes, R. P. Oral Sequelae of Head and Neck Radiotherapy. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14, 199-212 (2003).
- Cannon, M. J., et al. Repeated measures study of weekly and daily cytomegalovirus shedding patterns in saliva and urine of healthy cytomegalovirus-seropositive children. BMC Infect. Dis. 14, (2014).
- Pringle, S., et al. Human Salivary Gland Stem Cells Functionally Restore Radiation Damaged Salivary Glands: Hyposalivation Cell Therapy. STEM CELLS. 34, 640-652 (2016).
- Maria, O. M., Maria, O., Liu, Y., Komarova, S. V., Tran, S. D. Matrigel improves functional properties of human submandibular salivary gland cell line. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43, 622-631 (2011).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture: Differentiation of Salivary Stem/Progenitor Cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6, 110-120 (2017).
- Foraida, Z. I., et al. Elastin-PLGA hybrid electrospun nanofiber scaffolds for salivary epithelial cell self-organization and polarization. Acta Biomaterialia. 62, 116-127 (2017).
