Summary
一次ヒト唾液腺由来上皮細胞を分離・培養する方法を提示する.これらの細胞は唾液上皮起源の遺伝子発現パターンを示し、エンゲルブレス・ホルム・スウォーム腫瘍細胞に由来する基塩膜マトリックス上の唾液圏として、または処理された培養皿上の単層として増殖することができる。
Abstract
唾液腺は、人間の病気の複数の側面に興味を持つ研究者のための重要な関心のサイトです。研究者の1つの目標は、放射線療法によって損傷を受けた腺の機能を回復するか、シェーグレン症候群に関連する病理に起因する。研究者の第二の目標は、ウイルスが腺組織内で複製するメカニズムを定義し、水平伝播に重要な唾液液にアクセスできることです。これらの目標は、上記に興味を持つ研究者だけでなく、関連する研究分野で利用することができる体外唾液腺モデルの堅牢でアクセス可能な必要性を強調しています。ここでは、ヒト唾液腺から上皮細胞を分離し、インビトロで伝播する簡単なプロトコルについて説明します。私たちのプロトコルは、個々の研究のニーズを満たすためにさらに最適化することができます。簡単に言えば、唾液組織は機械的および酵素的に分離され、単一細胞または細胞の小さなクラスターを単離する。上皮細胞の選択は、上皮細胞増殖を促進するために最適化された培地膜マトリックス上にめっきすることによって起こる。これらの得られた培養物は、「唾液圏」と呼ばれる三次元クラスターとして維持することも、処理されたプラスチック組織培養皿上の単層として成長させることができる。このプロトコルは、細胞老化を受け入れる前に5-8の通路(15〜20集団倍増)のために伝播することができる主に上皮細胞の異種集団の成長をもたらす。
Introduction
哺乳類では、唾液腺は、耳下腺、顎下腺、および言語下腺の3組の主要な唾液腺に編成される。また、舌の上に位置し、口腔1全体に散在する一連のマイナー腺が存在する。主要な腺は、2を生成した唾液のバルク量を担当しています.分泌因子を介して抗菌保護を提供することに加えて、唾液は食道2を通過する食品を噛み、潤滑する過程で重要である。したがって、唾液腺機能不全は、十分な唾液を産生することができない患者が、歯科空洞や口腔カンジダ症3などの病気を発症しやすい医学的問題を表す。さらに、唾液の減少は、生活の質に大きな影響を与える食べ物を食べたり消化するのが難しくなります。
唾液腺機能不全は、主にシェーグレン症候群、自己免疫疾患、または照射療法を受けた頭頸部癌患者3,4,5に罹患している患者に見られる。 6.自己免疫または放射線療法の結果として腺内の損傷した分泌性アチーニは自己更新を受けず、不可逆的な損傷を受けた患者を生きる6.唾液腺の研究はまた、ウイルス病因のメカニズムに興味を持つ注目や研究者を集めています。ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)のような一部の病原体は、唾液腺内で持続的に複製し、唾液7、8を介して新しい宿主に新しい宿主に新しい宿主に伝染することを可能にする。したがって、唾液腺組織の堅牢で再現性の高いモデルを開発し、多様な医学的問題に取り組み、理解する必要があります。
マウス唾液腺系のいくつかのモデルは、唾液腺9、10を形成する異なる上皮細胞を理解し、特徴付ける出発点として使用されている。ヒトとマウスの唾液腺11の間には明らかな大きな違いがある。最も顕著なヒト耳下腺は、下顎腺に関連して大きいのに対し、マウスの顎下腺および耳下腺は、サイズ1、2、11でかなり類似している。不死化ヒトのマンディビバル細胞株は存在するが、不死化細胞が原発組織の表現型を正確に維持しておらず、不死化細胞が実際に由来していないという二次的懸念が大きな懸念がある。唾液上皮自体12.これらの理由から、ヒトから一次唾液組織を研究する興味と必要性があります。
ここでは、組織培養のためのヒト唾液腺から原発上皮細胞を分離するプロトコルについて説明する。私たちのプロトコルは、一般的に彼らの手順を簡素化するために行われた変更を加えたPringle et al. と Tran らの作品に基づいています13,14.まず、Tran et al.のプロトコルは唾液組織を酵素的に消化するための長い5時間のインキュベーションを必要としますが、私たちの改変されたプロトコルは、プリングルらと同様に、わずか1時間のインキュベーションで成功しています。第二に、我々は組織消化のために異なる酵素を使用し、最も顕著なのは、元のTranらプロトコルで使用されているようにトリプシンを使用せず、代わりにジスパーゼとコラゲナーゼの混合物を使用します。我々は、最近の研究がトリプシンによる唾液組織の初期消化が細胞生存率の低下をもたらすことを示唆したように、初期消化ステップでトリプシンを避けることを好む、おそらくまれな幹細胞集団15の喪失によって。最後に、気管支上皮細胞の伝播のために処方された市販の培地を用いて、基塩膜マトリックス(BMM)の表面に唾液を培養する。私たちのプロトコルは、唾液細胞を耳下腺、顎下腺、および言語下腺から単離するために使用することができます。これらの細胞は唾液アミラーゼおよび他の唾液特異的遺伝子を発現し、唾液アシナー上皮細胞7と同様の表現型を維持することを示す。この方法論を用いて、>50の一次ヒト組織サンプルから唾液培養物を生成することに成功しました。さらに、一次唾液細胞は、後日使用するために容易に凍結保存することができる。
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Protocol
これらのプロトコルと研究は、シンシナティ大学の機関審査委員会(連邦全体保証#00003152、IRBプロトコル2016-4183)によってレビューされ、承認されています。唾液組織は、一般的に多くの頭頸部外科的処置で切除され、通常、悪性プロセスによって関与しない。典型的には、新たに切除された唾液腺組織は、患者から除去した後2〜4時間以内に使用される(図1A)。
1. 試薬の調製
-
気管支上皮細胞増殖培地(BEGM)
- 製造元が提供するキットからコンポーネントを追加します(「材料の表」を参照)。
- 各チューブをベースメディアで1回洗い、コンポーネントの完全な転送を確保します。その後、4%の血清の最終的な濃度を作るために炭剥ぎ取られた胎児の牛血清を追加します。
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赤血球(RBC)リシスバッファー
- 10倍のストックを作るために、NH4 Clの40.15g、NaHCO3の5.0g、およびエチレンディアミンテトラセチン酸(EDTA)の0.186 gを加え、dH2 Oを使用して200mLの最終容積まで持ち上げます。その後、殺菌をフィルタリングし、4 °Cで保存します。
- 使用前に無菌dH2 Oで1xの作業濃度に希釈する。
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解離ソリューション
- 100mLのジスパーゼ溶液(材料表参照)にコラゲナーゼタイプIIIの0.15gを加えます。コラゲナーゼが完全に溶解した後、フィルターは新しい溶液とアリコートを殺菌します。-20 °C.で保存します。
2. 組織消化
- 100mm組織培養プレートを用いて、オートクレーブ殺菌解剖はさみおよび外科鉗子(図1B、C)を用いて組織を微細な部分〜1〜2mmの細分化に機械的にミンチン殖させる。ピース間の結合組織は、適切な分離を確保し、さらなるステップで容易にするために切断する必要があります。
- ジスパーゼ/コラゲナーゼ溶液の6 mLをミンチ組織に加えます。その後、37°Cで約30分~1時間インキュベートします。
- 5 mLの血清ピペット15-20回でピペッティングして組織を破壊する。
- 37 °Cで30分~1時間インキュベートします。
- ステップ2.3と2.4を2~3回繰り返すか、組織がスラリーに似ていて、ピペットの開口部を簡単に通過できるまで(図1D)。
注:組織標本の開始サイズと組織ミンチの細かさによって、ステップ2.3と2.4を繰り返す必要がある回数が決まります。通常、我々は約1 cm x 1 cmのサイズの組織を受け取る。さらに、標準的な反転組織培養顕微鏡を使用して組織解離を監視し、組織からの細胞解離の進行を追跡することができます。細胞の小さなクラスターは、唾液圏としての唾液細胞の初期の増殖に最適です。
3. 地下膜マトリックスで井戸をコーティング
注:基膜マトリックス(BMM)は、使用される前日の4°Cで一晩解凍する必要があります。解凍後、BMMは、より暖かい温度で急速に固化(すなわち、ゲルを形成する)として、氷の上または4°Cで常に維持されるべきです。さらに、冷たいサンプルがBMMを「溶かす」とプラスチック皿に細胞を露出させるので、BMMのめっき前にサンプルが氷の上で冷やされた場合は注意が必要です。
- ゆっくりとピペットBMM(材料の表を参照)を各ウェルにコーティングします。均等かつゆっくりと井戸の上にBMMを配布します。
注:一般的に、我々は6ウェルプレートの各ウェルごとに500 μLを使用しますが、この容積は、12ウェルや24ウェルなどのプレートの他の変種での使用のために、またはより厚いまたは薄いヒドロゲルのために必要に応じて調整することができます。 - BMM時間が固化できるように、使用前に少なくとも15分間37°Cでコーティングされたプレートをインキュベートします。
4. 未消化組織の濾過、RBCリシス、細胞めっき
- ステップ2.5から15 mL円錐管に組織を均質に移す。Dulbeccoのリン酸緩衝生理食べ物(DPBS)の6 mLでプレートを1回洗浄し、残りの細胞を転送します。
- 70 μmのナイロンメッシュセルストレーナーを通して50 mL円錐管に均質化を濾過し、未消化組織を除去します。遠心分離機は500 x gで5分間歪んだ細胞を緊張させた。
- 無菌dH2 Oで10x RBC溶解バッファーを希釈し、1x作動溶液を作ります。
- 上清を吸引する。次いで、1x RBCリシスバッファーの10mLで細胞ペレットを再ステーペンドする。37 °Cで5分間インキュベートします。
- DPBSの20-25 mLを追加してRBCリシスバッファーを中和し、唾液細胞のリシスを最小限に抑えます。500 x gで5分間遠心分離機。
注:RBCリシスバッファーでの治療後、細胞ペレットは白でなければなりません。ペレットの赤色は、すべてのRBCが完全にlysedされていないことを示しています。すべての RBC の完全なリシスに必要な場合は、手順 4.4 ~ 4.5 を繰り返します。 - 上清を吸引する。ベグムの1-2 mLでペレットをウェル当たり再懸濁し、BMMコーティングされたウェルに再懸濁細胞を置きます。37 °Cでインキュベートします。
- BMMでメッキすると、細胞は2〜3日間にわたって球状構造または「唾液圏」に形成されます。細胞は、BMMが分解し始める前に約5〜7日間唾液圏として維持することができ、細胞がプラスチックにアクセスして付着し、単層として成長することを可能にする。
5. BMMの唾液とメンテナンスのサブキュベート
- ウェルから培温を吸引し、各ウェルに1mLのジスパーゼ/コラゲナーゼ溶液を加え、37°Cで~15分間、またはBMMが大部分溶解するまでインキュベートします。
- 細胞を15mL円錐管に移し、DPBSで一度ウェルを洗浄して残りの細胞を得る。500 x gで5分間遠心分離機。
- 上清を吸引する。ペレットを2mLのトリプシンで再濁し、37°Cで15分間インキュベートします。
- 10%の血清を含む任意の完全な媒体を使用してトリプシンを中和します。500 x gで5分間遠心分離機。
- 上清を吸引する。DPBSの細胞を再中断して、残留培養物、トリプシン、血清を除去する。500 x gで5分間遠心分離機。
- 上清を吸引する。BEGMで再懸濁し、固化BMMコーティング培養皿に再懸濁細胞をプレート化します。再懸濁細胞はまた、単層として増殖するための食器を処理した細胞培養に直接めっきすることができる。単層体としての唾液細胞の増殖に関する詳細については、セクション6を参照してください。BMMまたはプラスチック上で成長した細胞は、2〜3日ごとに新鮮なBEGMを供給する必要があります。
- 加湿インキュベーターで細胞を培養し、5%CO2で37°Cで維持した。
6. 処理されたプラスチック組織培養皿の唾液を亜培養する
注: プラスチック上の単層としてセルを維持する場合は、この手順から開始します。以下のプロトコルは、100mm皿で増殖する細胞に適用される。
- メディアを吸引する。DPBSで一度洗って残りのメディアを取り除きます。
- 2 mLのトリプシンを加え、37°Cで15分間、または細胞が完全に剥離するまでインキュベートします。
- 10%の血清を含む任意の完全な培体の4 mLを使用してトリプシンを中和します。細胞を15 mL円錐形チューブに移します。
- 約5mLのDPBSでプレートを1回洗い、残りの細胞を回収します。500 x gで5分間遠心分離機。
- 上清を吸引する。DPBSの6-10 mLで細胞を再中断し、残留培養物を除去する。
- 500 x gで5分間遠心分離機。
- 上清を吸引し、BEGMで再中断する。処理されたプラスチック組織培養皿にプレート細胞。新鮮なBEGMを2-3日ごとに供給します。
- 加湿インキュベーターで細胞を培養し、5%CO2で37°Cで維持した。
7. 細胞の凍結保存
注:細胞の凍結保存は、唾液圏または単層増殖細胞のいずれかに由来する単一細胞懸濁液から達成することができる。
- 血球計で細胞を数え、存在する細胞の総量を計算します。
- 500 x gで5分間遠心分離機。
- 上清を吸引する。10%ジメチルスルホキシド(DMSO)でBEGMのペレットを再中断します。細胞の濃度は、2 x 106細胞/mLに10 x 106細胞/mLでなければなりません。
- 無菌低温貯蔵管にアリコート細胞。チューブを絶縁されたフォームラックに入れ、-80°Cで一晩インキュベートし、ゆっくりと細胞を凍結させます。
- 翌日、チューブを液体窒素に入れ、長期保存します。
注:細胞は37°Cで急速に解凍する必要があります。解凍時に、細胞を500xgでペレット化し、メッキの前にDMSO含有培媒を除去する必要があります。
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Representative Results
消化された組織からBMMに細胞をめっきしてから2~3日後、細胞はクラスター当たり最大15~20個の細胞の大きさで膨張し続ける小さなクラスターを容易に形成する(図2A)。細胞の破片や剥離した死細胞は一般的に見られ、新鮮な媒体を吸引し、補充することによって除去されるべきです。細胞は、約3〜10日間、またはBMM層がそのまま残っている限り、唾液球として増殖し続けます。時折、BMMの部分的な破壊のために、細胞は基礎となるプラスチックに付着し、単層として増殖し始める。BMMで成長した唾液は、サイズと構造の複雑さの変動を示します。唾液圏は、プロトコルに記載されているように、新たに調製されたBMMにそれらを渡すことによって維持することができる。新鮮なBMMに渡してから2〜3日以内に、細胞は球体に変調する。唾液圏細胞はまた、細胞培養処理プラスチック上にめっきし、それらが図2Bに示すように上皮起源の細胞と一致する形態を示す単層として成長させることができる。唾液球としてBMM上で増殖した唾液圏細胞は唾液組織のより特徴的な表現型を維持する可能性が高いが、単層として増殖した細胞は、いくつかの実験プロトコルに有利であり得る。唾液として増殖した細胞と比較して、単層で増殖した場合、細胞がどの程度唾液表現型を維持するかを決定するために、より広範な特徴付けを行う必要があります。
図 1: 唾液分形成のためのヒト界下腺の初期処理。切除された唾液腺組織は直径約1cm(A)で、腺が約1〜2mmの消化可能な部分(C)に分離されるまで鋭いはさみ(B)を用いて機械的に小片に細分される。その後、腺片は、サンプルが主に単一細胞または細胞の小さな塊に消化されるまで、血清的なピペットを通して周期的な通過を伴う30〜90分間、ジスパーゼ/コラゲナーゼ溶液中でインキュベートされる(D)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2:一次ヒト唾液圏細胞は、基塩膜マトリックス上の球体として、または処理された細胞培養皿上の単層として培養することができる。唾液組織の初期消化後、消化腺はBMMに直接めっきされ、3〜10日間培養される。細胞は、新鮮な栄養素を提供するために2〜3日ごとに供給されます。一次唾液圏が発達すると、マトリックスはジスパーゼ/コラゲナーゼ溶液で消化し、単一細胞を生成するために試用し、新鮮なBMMに再めっきして球(A)に再び入れ直すか、細胞培養皿にめっきすることができる。上皮単層(B)の典型的な石畳形態を容易に形成する。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
唾液機能不全は、シェーグレン症候群に罹患している人々の生活の質に対する懸念を表し、唾液腺3、4、5に隣接する癌に対する放射線治療を受けている人々の生活の質に関する懸念を表します。 16.これらの患者を治療するための1つの提案された治療法は、インビトロで機能性唾液幹細胞またはオルガノイドを成長させ、損傷した唾液腺に挿入して患部組織9を置き換えることができる。さらに、唾液腺は、多くの場合、ヒト病原体の持続性および伝達のための部位である。例えば、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)などのヒトヘルペスウイルスは、唾液腺および唾液を感染させ、新しい宿主7、8、17にウイルスを感染させることが知られている。唾液腺のウイルス持続性と唾液への動きの基礎となる分子機構は未知のままである。インビトロ唾液細胞系の開発は、この機械的情報を探索するために不可欠なモデルシステムを提供します。
ここでは、BMM上のクラスターとして、またはプラスチック上の単層としてインビトロで成長することができる一次唾液「唾液」を生成するための堅牢なプロトコルを報告します。一次ヒト唾液腺上皮細胞を培養し伝播する能力は、研究者が(1)他の選択肢がない唾液腺欠乏患者に対する代替療法を潜在的に開発できる重要なプラットフォームを表している。が存在します。(2)唾液腺の発達、増殖、分泌等の基礎となる基本的な生理学をよりよく理解すること。(3)病原体が複製して新しい宿を複製し、新しい宿間に広めるために使用するメカニズムを定義する。
これらの唾液細胞培養物を用いて、HCMVは一次感染に対してペンタメリック糖タンパク質複合体を必要とし、またウイルスが長期間持続することを報告し、生体内7のHCMVで何が起こるかを思い起こさせる。さらに、我々の機能的研究は、唾液培養物が線維芽細胞熱帯として汚染線維芽細胞を含まないことを明らかにし、実験室適応ウイルスは、一次唾液由来細胞7に感染および複製することができない。このプロトコルを使用してHCMV複製の評価と一次唾液系への広がりのための細胞を生成してきましたが、このプロトコルは、上記の幅広い研究トピックに有用な唾液細胞を生成するために容易に適応することができます。さらに、このプロトコルは、個々の研究者のニーズと予算に合わせて調整することができます。我々自身が他の条件を検証していない間、他の人は、異なる培地条件下で唾液上皮細胞を成長させる成功を報告しています。例えば、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM):表皮成長因子および線維芽細胞増殖因子-2を補合したF12混合物は、唾液細胞18の堅牢な増殖を促進することが報告されている。あるいは、Nam et al. は、細胞を血清フリーバージョンのケラチノサイト増殖培地に移す前に胎児ウシ血清を補充した最小限の必須培地を使用し、プラスチック15上の唾液細胞の堅牢な増殖を報告している。したがって、唾液上皮細胞は、1つの特定の培地タイプに対して絶対的な要件を示すようには見えないが、むしろ市販の多くのメディアタイプで増殖および増殖するように見える。
培地製剤に加えて、異なる塩分膜製剤は、堅牢な唾液上皮細胞増殖をサポートする能力について評価することができる。市販の基塩膜含有マトリックス上の細胞の増殖は、唾液圏を容易に得、かつ高価な培養システム7、19を提供する。細胞増殖のための培地の選択に関して上記で議論したのと同様に、研究者は、異なるマトリックスおよび水力システムの数に対する唾液圏の成長と発達を報告している。ヒアルロン酸から作られたヒドロゲルは、細胞との相互作用と細胞への影響を研究するために、所望の化学成分と架橋した細胞外マトリックスを作成する際に付加的な利点を有する。一次ヒト組織由来唾液細胞を用いて、Srinivasanらはヒアルロン酸ヒドロゲルにおける唾液前駆細胞集団の増殖および維持の成功を報告した。増血前駆細胞増殖は、ペルレカンおよびラミニン20などの地下膜タンパク質に由来するペプチドをヒドロゲルが組み込まれたときにさらに観察された。Foraidaらが最近開発した別のシステムは、ポリ(乳酸共糖酸)(PLGA)から作られたナノファイバー足場を開発するために「エレクトロスピニング」を用いて報告する。プラスチンを添加したPLGAヒドロゲルは、分極性亜マンディブ状細胞系の開発を容易に促進することが見出され、これは細胞偏光が唾液生物学および生化学にどのように影響するかを調するのに有用でありうる21。
このプロトコルでは、一次唾液腺由来上皮細胞の単離および増殖のための簡単な方法を提示した。このプロトコルは、5〜8の通過について平均して維持することができる上皮細胞集団の急速な成長をもたらす。プロトコルに記載されているように適切な消化を確保するために、ジスパーゼ/コラゲナーゼで治療中に組織を監視することが重要です。不完全な消化は、生き残る唾液の数を著しく減少させる。また、細長い形状を有し、通常離散的なパッチまたは塊で成長する多角形上皮細胞とは非常に異なる線維芽細胞の増殖の培養物を監視することも重要です。このプロトコルは、ヒトやマウスから上皮細胞を単離するために使用してきましたが、他の哺乳類系での使用に適応できる可能性が高いと思われます。さらに、このプロトコルは、より均質な初期細胞集団の生成につながる可能性のある細胞表面マーカー発現およびフローサイトメトリーに基づく追加の精製ステップを使用することによって、さらに改変することができる。同様に、このプロトコルは、異なる培養物またはマトリックス/ヒドロゲル製剤が、唾液圏を最初に生成する際に特定の細胞タイプの成長につながる方法を決定するために使用することができる。結論として、このプロトコルは、多種多様な実験プロトコルおよび研究領域に容易に適応することができる一次唾液細胞の単離および成長のための堅牢な出発プラットフォームとして機能する必要があります。
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Disclosures
著者らは何も開示していない。
Acknowledgments
一次細胞の培養に関わる方法論に関する重要なガイダンスを提供してくださったジェームズ・P・ブリッジスに感謝します。マシュー・J・ベクラーは、国立衛生研修助成金T32-ES007250によって支援されました。この研究はまた、国立衛生研究所の助成金R01-AI121028とR21-DE026267ウィリアム・E・ミラーに授与されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dishes | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Media | Lonza | CC-3171 | Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum. |
| Cell strainer 70 µm nylon mesh | Fisher | 22-363-548 | |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Gibco | 12676-029 | |
| Collagenase type III | Worthington | LS004182 | Store at 4 °C. |
| Cryogenic Tube | Fisher | 5000-0020 | |
| Dispase | Cell Applications | 07923 | Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C. |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Dulbecco phosphate buffered saline | Corning | 55-031-PC | |
| General Chemicals | Sigma | ||
| PathClear Basement membrane extract | Cultrex | 3432-005-01 | Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice. |
| Six-well culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Surgical forceps | Fisher | 22-079-742 | |
| Trypsin-EDTA solution | Corning | 25-052-CI |
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