Summary
Presentamos un método para aislar y cultivar células epiteliales derivadas de glándulas salivales humanas primarias. Estas células exhiben patrones de expresión génica consistentes con que son de origen epitelial salival y pueden ser cultivadas como salisferas en matrices de membranas de sótano derivadas de células tumorales Engelbreth-Holm-Swarm o como monocapas en platos de cultivo tratados.
Abstract
Las glándulas salivales son un sitio de interés significativo para los investigadores interesados en múltiples aspectos de la enfermedad humana. Uno de los objetivos de los investigadores es restaurar la función de las glándulas dañadas por las radioterapias o debido a patologías asociadas con el síndrome de Sjogren. Un segundo objetivo de los investigadores es definir los mecanismos por los cuales los virus se replican dentro del tejido glandular donde luego pueden obtener acceso a fluidos salivales importantes para la transmisión horizontal. Estos objetivos ponen de relieve la necesidad de un modelo de glándula salival in vitro robusto y accesible que pueda ser utilizado por investigadores interesados en lo mencionado anteriormente, así como áreas de investigación relacionadas. Aquí discutimos un protocolo simple para aislar las células epiteliales de las glándulas salivales humanas y propagarlas in vitro. Nuestro protocolo se puede optimizar aún más para satisfacer las necesidades de los estudios individuales. Brevemente, el tejido salival se separa mecánica y enzimáticamente para aislar células individuales o pequeños grupos de células. La selección de células epiteliales se produce mediante el enchapado en una matriz de membrana de sótano en presencia de medios optimizados para promover el crecimiento de células epiteliales. Estos cultivos resultantes pueden mantenerse como racimos tridimensionales, llamados "salisferas", o crecer como monocapa en platos de cultivo de tejidos plásticos tratados. Este protocolo resulta en el crecimiento de una población heterogénea de células principalmente epiteliales que se pueden propagar para 5-8 pasajes (15-20 duplicaciones de población) antes de someterse a senescencia celular.
Introduction
En los mamíferos, las glándulas salivales se organizan en 3 pares de glándulas salivales principales: las glándulas parótidas, submandibulares y sublinguales. También existe una serie de glándulas menores ubicadas en la lengua y dispersas por toda la cavidad oral1. Las glándulas principales son responsables del volumen mayor de saliva producida2. Además de proporcionar protección antimicrobiana a través de factores secretos, la saliva es importante en el proceso de masticar y lubricar los alimentos a medida que pasa a través del esófago2. Como tal, la disfunción de la glándula salival representa un problema médico donde los enfermos que son incapacesde producir suficiente saliva son más propensos a desarrollar enfermedades como caries dentales o candidiasis oral 3. Además, la reducción de la saliva da como resultado una mayor dificultad para comer y digerir los alimentos que tienen un impacto significativo en la calidad de vida.
La disfunción de la glándula salival se encuentra principalmente en pacientes que sufren del síndrome de Sjogren, un trastorno autoinmune, o en pacientes con cáncer de cabeza y cuello que se han sometido a terapia de irradiación3,4,5, 6. El secretor dañado acini dentro de las glándulas como resultado de la autoinmunidad o radioterapia no se somete a la auto-renovación, lo que resulta en un paciente que vive con daños irreversibles6. El estudio de las glándulas salivales también ha atraído la atención o investigadores interesados en los mecanismos de la patogénesis viral. Algunos patógenos, como el citomegalovirus humano (HCMV), se replican persistentemente dentro de las glándulas salivales, lo que permite la transmisión del virus naciente a un nuevo huésped a través de la saliva7,8. Por lo tanto, existe una necesidad insatisfecha de desarrollar modelos in vitro robustos y reproducibles de tejido de la glándula salival para abordar y entender una amplia gama de problemas médicos.
Varios modelos del sistema de glándulas salivales murinas se han utilizado como punto de partida paracomprender y caracterizar las diferentes células epiteliales que forman las glándulas salivales 9,10. Existen diferencias obvias y importantes entre las glándulas salivales humanas y murinas11. Más notablemente la glándula parótida humana es más grande en relación con la glándula submandibular mientras que el ratón submandibular y parótido son muy similares en tamaño1,2,11. Si bien existen líneas celulares submandibulares humanas inmortalizadas, hay grandes preocupaciones de que las células inmortalizadas no mantengan con precisión el fenotipo del tejido primario y las preocupaciones secundarias de las que las células inmortalizadas no se derivan realmente epitelio salival en sí12. Por estas razones hay un interés y una necesidad de estudiar el tejido salival primario de los seres humanos.
Aquí describimos un protocolo para aislar las células epiteliales primarias de las glándulas salivales humanas para el cultivo de tejidos. Nuestro protocolo se basa en las obras de Pringle et al. y Tran et al. con modificaciones realizadas para simplificar generalmente sus procedimientos13,14. En primer lugar, mientras que el protocolo de Tran et al. requiere una larga incubación de cinco horas para digerir enzimáticamente el tejido salival, nuestro protocolo modificado ha tenido éxito con tan solo una hora de incubación, similar a la de Pringle et al. En segundo lugar, utilizamos diferentes enzimas para la digestión de los tejidos, sobre todo no usamos la trippsina como se utiliza en el protocolo original De tran et al., sino que usamos una mezcla de dispensa y colagenasa. Preferimos evitar la trippsina en los pasos iniciales de digestión como un estudio reciente sugirió que la digestión inicial del tejido salival por trippsina resulta en una menor viabilidad celular, posiblemente por la pérdida de una población rara de células madre15. Por último, cultivamos las salisferas en la superficie de la matriz de membrana del sótano (BMM) utilizando un medio disponible comercialmente formulado originalmente para la propagación de células epiteliales bronquiales. Nuestro protocolo se puede utilizar para aislar las células salivales de las glándulas parótidas, submandibulares y sublinguales. Estas células expresan la amilasa salival y otros genes salivales específicos que indican que mantienen un fenotipo similar al de las células epiteliales del acinar salival7. Hemos generado con éxito cultivos salivales a partir de >50 muestras primarias de tejido humano utilizando esta metodología. Además, las células salivales primarias se pueden crioreservar fácilmente para su uso en una fecha posterior.
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Protocol
Estos protocolos y estudios han sido revisados y aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Cincinnati (Federal-wide Assurance #00003152, protocolo IRB 2016-4183). El tejido salival se reseca comúnmente en muchos procedimientos quirúrgicos de cabeza y cuello y generalmente no está involucrado por el proceso maligno. Típicamente, el tejido de la glándula salival recién resecado se utiliza dentro de 2-4 h después de la extracción del paciente (Figura1A).
1. Preparación de reactivos
-
Medio de crecimiento de células epiteliales bronquiales (BEGM)
- Agregue componentes del kit proporcionado por el fabricante (consulte la Tabla de materiales).
- Lave cada tubo una vez con el soporte base para asegurar la transferencia completa de los componentes. Luego agregue carbón despojado de suero bovino fetal para hacer una concentración final de 4% de suero.
-
Tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC)
- Para hacer 10x stock, añadir 40.15 g de NH4Cl, 5.0 g de NaHCO3, y 0.186 g de ácido etilendiaminetetraacético (EDTA) y llevar hasta un volumen final de 200 mL usando dH2O. A continuación, filtrar el esterilizado y almacenar a 4 oC.
- Diluir a una concentración de trabajo de 1x en dH2O estéril antes de su uso.
-
Solución de disociación
- A una botella de 100 ml de solución de dispensación (ver la Tabla de Materiales)añadir 0,15 g de colagenasa tipo III. Después de que la colagenasa se haya disuelto completamente, el filtro esteriliza la nueva solución y la alícuota. Conservar a -20oC.
2. Digestión de tejidos
- Usando una placa de cultivo de tejido de 100 mm, mecánicamente el tejido en trozos finos de 1-2 mm detamaño utilizando tijeras de diselación autoclave esterilizadas y fórceps quirúrgicos (Figura1B,C). El tejido conectivo entre las piezas debe cortarse para garantizar una separación adecuada y facilitar la facilidad en otros pasos.
- Añadir 6 ml de la solución de dispensa/colagenasa al tejido picado. A continuación, incubar a 37oC durante aproximadamente 30 min a 1 h.
- Interrumpa el tejido pipeteando con una pipeta serológica de 5 ml 15-20 veces.
- Incubar a 37oC durante otros 30 min a 1 h.
- Repita los pasos 2.3 y 2.4 dos-tres veces más o hasta que el tejido se asemeje a un lodo y pueda pasar fácilmente a través de la abertura de la pipeta (Figura1D).
NOTA: El tamaño inicial de la muestra de tejido y la forma en que la finura de la picadura del tejido determinará cuántas veces se necesita repetir los pasos 2.3 y 2.4. Típicamente, recibimos tejido de aproximadamente 1 cm x 1 cm de tamaño. Además, se puede monitorear la disociación del tejido usando un microscopio de cultivo de tejido invertido estándar para rastrear el progreso de la disociación celular del tejido. Pequeños racimos de células son ideales para el crecimiento inicial de células salivales como salisferas.
3. Revestimiento de pozos con matriz de membrana de sótano
NOTA: La matriz de membrana del sótano (BMM) debe descongelarse durante la noche a 4 oC el día antes de su uso. Una vez descongelado, BMM debe mantenerse constantemente en hielo o a 4 oC, ya que se solidifique rápidamente (es decir, formar un gel) a temperaturas más cálidas. Además, se debe tener cuidado si las muestras se han enfriado en hielo antes de enchapar en BMM, ya que las muestras frías "derretirán" el BMM y expondrán las células a la placa de plástico.
- Lentamente pipetear BMM (ver la Tabla de Materiales)en cada pocal a recubrir. Distribuir uniforme y lentamente el BMM sobre el pozo.
NOTA: Generalmente, utilizamos 500 ol por cada pozo de una placa de seis pocillos, pero este volumen se puede ajustar para su uso en otras variantes de placas como 12 pocillos o 24 pocillos, o según se desee para hidrogeles más gruesos o más delgados. - Incubar las placas recubiertas a 37oC durante al menos 15 minutos antes de su uso para permitir que el tiempo de la MMC se solidifique.
4. Filtrado de tejido no digerido, lisis RBC y revestimiento celular
- Transfiera el tejido homogeneizar del paso 2.5 a un tubo cónico de 15 ml. Lave la placa una vez con 6 ml de solución salina tamponada de fosfato de Dulbecco (DPBS) para transferir las células restantes.
- Filtrar el homogeneizado en un tubo cónico de 50 ml a través de un colador de células de malla de nylon de 70 m para eliminar el tejido no digerido. Células tensadas centrífugas durante 5 min a 500 x g.
- Diluir 10x Tampón de lisis RBC en dH2O estéril para hacer una solución de trabajo 1x.
- Aspira al sobrenadante. A continuación, resuspenda el pellet celular en 10 ml de 1 búfer de lisis RBC 1x. Incubar durante 5 min a 37oC.
- Añadir 20-25 mL de DPBS para neutralizar el tampón de lisis RBC y minimizar la lisis de las células salivales. Centrífuga durante 5 min a 500 x g.
NOTA: Después del tratamiento con tampón de lisis RBC, el pellet celular debe ser blanco. El color rojo en el pellet indica que no todos los RBC han sido completamente lysed. Repita los pasos 4.4 a 4.5 si es necesario para la lisis completa de todo el RBC. - Aspira al sobrenadante. Resuspenda el pellet en 1-2 ml de BEGM por pozo y luego coloque las células resuspendidas en los pozos recubiertos con BMM. Incubar a 37oC.
- Una vez chapadas en BMM, las células se formarán en estructuras esféricas o "salisfersferas" durante un período de 2-3 días. Las células se pueden mantener como salisferas durante unos 5-7 días antes de que el BMM comience a degradarse permitiendo que las células accedan y se adhieran al plástico y crezcan como una monocapa.
5. Suculturar las salisferas y el mantenimiento en BMM
- Aspirar los medios de los pozos, luego añadir 1 mL de solución de dispensa/colagenasa a cada pocal e incubar a 37 oC durante 15 min o hasta que bMM se haya disuelto en su mayoría.
- Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml y lave los pozos una vez con DPBS para obtener las células restantes. Centrífuga durante 5 min a 500 x g.
- Aspira al sobrenadante. Resuspenda el pellet en 2 ml de trippsina y luego incuba a 37oC durante 15 min.
- Neutralizar la trippsina utilizando cualquier medio completo que contenga 10% de suero. Centrífuga durante 5 min a 500 x g.
- Aspira al sobrenadante. Resuspenda las células de DPBS para eliminar los medios residuales, la trippsina y el suero. Centrífuga durante 5 min a 500 x g.
- Aspira al sobrenadante. Resuspenda en BEGM y placa las células resuspendidas en platos de cultivo recubiertos con BMM solidificados. Las células resuspendidas también se pueden chapar directamente en platos tratados con cultivo celular para la proliferación como monocapa. Para obtener más información sobre el crecimiento de células salivales como monocapa, ver sección 6. Las células cultivadas en BMM o en plástico deben ser alimentadas con BEGM fresco cada 2-3 días.
- Cultivo de las células en una incubadora humidificadamantenida a 37oC con 5% de CO2.
6. Suculturar las salisferas en platos de cultivo de tejido plástico tratados
NOTA: Si mantiene las células como una monocapa en plástico, comience en este paso. El siguiente protocolo se aplica a las células que crecen en un plato de 100 mm.
- Aspira a los medios de comunicación. Lavar una vez con DPBS para eliminar los medios residuales.
- Añadir 2 ml de trippsina y luego incubar a 37 oC durante 15 minutos, o hasta que las células se hayan separado por completo.
- Neutralizar la trippsina utilizando 4 ml de cualquier medio completo que contenga un 10% de suero. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml.
- Lave la placa una vez con aproximadamente 5 ml de DPBS para recoger las celdas restantes. Centrífuga durante 5 min a 500 x g.
- Aspira al sobrenadante. Resuspenda las células en 6-10 mL de DPBS para eliminar los medios residuales.
- Centrífuga durante 5 min a 500 x g.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender en BEGM. Células de placa sobre platos de cultivo de tejido plástico tratado. Alimentar con BEGM fresco cada 2-3 días.
- Cultivo de las células en una incubadora humidificadamantenida a 37oC con 5% de CO2.
7. Criopreservación de células
NOTA: La criopreservación de células se puede lograr a partir de una suspensión de una sola célula originada de células cultivadas en salisfersfera o monocapa.
- Cuente las células en un hematómetro para calcular la cantidad total de células presentes.
- Centrífuga durante 5 min a 500 x g.
- Aspira al sobrenadante. Resuspenda el pellet en BEGM con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). La concentración de células debe ser de 2 x 106 celdas/ml a 10 x 106 celdas/ml.
- Células alícuotas en tubos de almacenamiento criogénicos estériles. Coloque los tubos en un estante de espuma aislado e incubaa a -80 oC durante la noche para congelar lentamente las células.
- Al día siguiente, coloque los tubos en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.
NOTA: Las células deben descongelarse rápidamente a 37 oC. Al descongelarse, las células deben ser peletadas a 500 x g y el medio que contiene DMSO se debe eliminar antes del enchapado.
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Representative Results
Dos-tres días después de las células de chapado del tejido digerido en BMM, las células formarán fácilmente pequeños racimos que continuarán expandiéndose en tamaño hasta 15-20 células por racimo (Figura2A). Los desechos celulares y las células muertas desprendidas se ven típicamente y deben ser eliminados aspirando y reponiendo con medios frescos. Las células continuarán proliferando como salisferas durante unos 3-10 días, o mientras la capa BMM permanezca intacta. Ocasionalmente, debido a la descomposición parcial de la BMM, las células se unen al plástico subyacente y comienzan a proliferar como una monocapa. Las salisferas cultivadas en BMM mostrarán variabilidad en tamaño y complejidad estructural. Las salisferis se pueden mantener pasándolas a BMM recién preparada como se describe en el protocolo. Dentro de 2-3 días después de pasar a BMM fresco, las células se reformarán en esferas. Las células de salisfera también se pueden chapar en plástico tratado con cultivo celular y cultivarse como una monocapa donde exhiben morfología consistente con células de origen epitelial como se muestra en la Figura 2B. Mientras que las células de salisfersfera cultivadas en BMM como salisferas son propensos a mantener un fenotipo más característico del tejido salival, las células cultivadas como monocapa pueden ser ventajosas para algunos protocolos experimentales. Será necesario realizar una caracterización más extensa para determinar en qué medida las células mantienen un fenotipo salival cuando se cultivan en una monocapa en comparación con las células cultivadas como salisferas.
Figura 1 : Procesamiento inicial de glándulas submandibulares humanas para la preparación de la salisfersfera. El tejido de la glándula salival extirpada de aproximadamente 1 cm de diámetro (A) se pica mecánicamente en trozos más pequeños utilizando tijeras afiladas (B) hasta que la glándula se separa en trozos digeribles de aproximadamente 1-2 mm de tamaño (C). Las piezas glandulares se incuban en la solución dispasse/collagenasa durante 30-90 min con paso periódico a través de pipetas serológicas hasta que la muestra se digiere en su mayoría células individuales o pequeños grupos de células (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Las células de salisfersfera humana primarias se pueden cultivar como esferas en la matriz de membrana del sótano o como una monocapa en platos de cultivo celular tratados. Después de la digestión inicial del tejido salival, las glándulas digeridas se chapan directamente en BMM y se cultivan durante 3-10 días. Las células se alimentan cada 2-3 días para proporcionar nutrientes frescos. Una vez que las salisferas primarias se desarrollan, las matrices pueden ser digeridas en solución dispásida/colagenasa, taquipsicadas para generar células individuales, y re-placadas en BMM fresco donde se reforman en esferas(A) o chapadas en platos de cultivo celular donde se forma fácilmente una morfología adoquinada típica de una monocapa epitelial (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La disfunción salival representa una preocupación por la calidad de vida de los que sufren el síndrome de Sjogren, así como por los que se someten a radioterapia para cánceres adyacentes a las glándulas salivales3,4,5, 16. Una terapia propuesta para tratar a estos pacientes es cultivar células madre salivales funcionales u organoides in vitro, que luego se pueden insertar en la glándula salival dañada para reemplazar el tejido afectado9. Además, las glándulas salivales son a menudo un sitio para la persistencia y transmisión de patógenos humanos. Por ejemplo, se sabe que los herpesvirus humanos como el citomegalovirus humano (HCMV) infectan yutilizan las glándulas salivales y la saliva para transmitir virus a nuevos hosts 7,8,17. Los mecanismos moleculares subyacentes a la persistencia viral en la glándula salival y el movimiento a la saliva siguen siendo desconocidos. El desarrollo de sistemas celulares salivales in vitro proporcionará un sistema modelo esencial para explorar esta información mecanicista.
Informamos aquí de un protocolo robusto para generar "salisferas" salivales primarias que se pueden cultivar in vitro ya sea como racimos en BMM o como monocapas en plástico. La capacidad de cultivar y propagar células epiteliales de la glándula salival humana primaria representa una plataforma importante en la que los investigadores pueden (1) desarrollar terapias de reemplazo para pacientes con deficiencias de glándulas salivales para los que no hay otras opciones existen; (2) comprender mejor la fisiología básica subyacente al desarrollo de la glándula salival, proliferación, secreción, etc.; y (3) definir los mecanismos utilizados por los patógenos para replicar y propagar se propagan a nuevos huéspedes.
Utilizando estos cultivos de células salivales, hemos informado que HCMV requiere el complejo de glicoproteína pentamérica para la infección primaria y también que el virus persiste durante un período prolongado, recordando lo que ocurre con HCMV in vivo7. Además, nuestros estudios funcionales revelaron que los cultivos salivales no contienen fibroblastos contaminantes como el trópicode fibroblastos, los virus adaptados al laboratorio no infectan y se replican en las células derivadas salivales primarias 7. Si bien hemos utilizado este protocolo para generar células para la evaluación de la replicación del HCMV y propagarse en un sistema salival primario, este protocolo podría adaptarse fácilmente para generar células salivales útiles para la amplia gama de temas de investigación mencionados anteriormente. Además, este protocolo podría adaptarse a las necesidades y presupuesto de cada investigador individual. Si bien no hemos validado otras condiciones nosotros mismos, otros han reportado éxito cultivando células epiteliales salivales bajo diferentes condiciones de los medios de comunicación. Por ejemplo, el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM):Mezcla F12 complementada con factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento fibroblasto-2 se ha divulgado para promover el crecimiento robusto de células salivales18. Alternativamente, Nam et al. utilizan medios esenciales mínimos complementados con suero bovino fetal antes de transferir las células a una versión libre de suero de un medio de crecimiento de queratinocitos y han reportado un crecimiento robusto de células salivales en plástico15. Por lo tanto, no parece que las células epiteliales salivales muestren un requisito absoluto para un tipo de medio en particular, sino que parecen crecer y proliferar en una serie de tipos de medios disponibles comercialmente.
Además de la formulación de medios, diferentes formulaciones de membrana de sótano podrían ser evaluados por sus habilidades para apoyar el crecimiento robusto de células epiteliales salivales. El crecimiento de células en matrices que contienen membranas de sótano disponibles comercialmente produce salisferas fácilmente y proporciona un sistema de cultivo simple, aunque caro7,19. Al igual que lo discutido anteriormente con respecto a la elección de los medios de comunicación para el crecimiento celular, los investigadores han reportado crecimiento y desarrollo de salisferas en una serie de matrices diferentes y sistemas de hidrogel. Los hidrogeles hechos de ácido hialurónico tienen el beneficio añadido en la creación de una matriz extracelular reticulada con los componentes químicos deseados para estudiar sus interacciones y efectos en las células. Utilizando células salivales derivadas del tejido humano primario, Srinivasan et al. informaron éxito en el crecimiento y mantenimiento de una población de células de progenitor salival en hidrogeles de ácido hialurónico; se observó un mayor crecimiento de la célula progenitora cuando los hidrogeles se incorporaron con péptidos derivados de las proteínas de membrana del sótano como perlecan y laminina20. Otro sistema desarrollado recientemente por Foraida et al. report using "electrospinning" to develop a nanofiber scaffold made of poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA). Se encontró que los hidrogeles PLGA con elastina añadida promueven fácilmente el desarrollo de un sistema de células submandibulares polarizadas, lo que puede ser útil para determinar cómo la polarización celular influye en la biología salival y la bioquímica21.
En este protocolo, hemos presentado un método simple para el aislamiento y crecimiento de células epiteliales derivadas de la glándula salival primaria. Este protocolo da como resultado el rápido crecimiento de una población de células epiteliales que se puede mantener en promedio para 5-8 pasajes. Es fundamental controlar el tejido durante el tratamiento con dosis/colagenasa para asegurar una digestión adecuada como se menciona en el protocolo. La digestión incompleta disminuirá gravemente el número de salisferas que sobreviven. También es importante monitorear los cultivos para el crecimiento de fibroblastos que tienen una forma alargada y son muy distintos de las células epiteliales poligonales que normalmente crecen en parches discretos o grumos. Hemos utilizado este protocolo para el aislamiento de células epiteliales de humanos y ratones, pero parece probable que pueda adaptarse para su uso con otros sistemas de mamíferos. Además, este protocolo podría modificarse mediante el uso de pasos de purificación adicionales basados en la expresión del marcador de superficie celular y la citometría de flujo que podrían conducir a la generación de poblaciones celulares iniciales más homogéneas. Del mismo modo, este protocolo podría utilizarse para determinar cómo diferentes medios o formulación de matriz/hidrogeles conducen al crecimiento de tipos de células específicos cuando se generan por primera vez las salisferas. En conclusión, este protocolo debe servir como una plataforma de partida sólida para el aislamiento y el crecimiento de células salivales primarias que se pueden adaptar fácilmente para una amplia variedad de protocolos experimentales y áreas de investigación.
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Disclosures
Los autores no informan nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a James P. Bridges por proporcionar una orientación significativa sobre las metodologías involucradas para el cultivo de células primarias. Matthew J. Beucler fue apoyado por la Beca T32-ES007250 de los Institutos Nacionales de Capacitación en Salud. Este trabajo también fue apoyado por las becas de los Institutos Nacionales de Salud R01-AI121028 y R21-DE026267 otorgadas a William E. Miller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mm culture dishes | Thermo Scientific | 172931 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339651 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339653 | |
| Bronchial Epithelial Cell Growth Media | Lonza | CC-3171 | Add bullet kit as per manufacturer's instructions. Supplement with 20 mL of charcoal stripped serum. |
| Cell strainer 70 µm nylon mesh | Fisher | 22-363-548 | |
| Charcoal stripped fetal bovine serum | Gibco | 12676-029 | |
| Collagenase type III | Worthington | LS004182 | Store at 4 °C. |
| Cryogenic Tube | Fisher | 5000-0020 | |
| Dispase | Cell Applications | 07923 | Dissolve collagenase to make a 0.15% (w/v) stock. Filter sterilize then store at -20 °C. |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Dulbecco phosphate buffered saline | Corning | 55-031-PC | |
| General Chemicals | Sigma | ||
| PathClear Basement membrane extract | Cultrex | 3432-005-01 | Thaw at 4 °C at least 24 hr prior to use. Always handle on ice. |
| Six-well culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Surgical forceps | Fisher | 22-079-742 | |
| Trypsin-EDTA solution | Corning | 25-052-CI |
References
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