Évaluation des dommages oxydatifs dans les cellules de surface oculaires de la souris primaire/cellules souches en réponse aux dommages causés par les ultraviolets-C (UV-C)

Summary

Ce protocole démontre la détection simultanée d’espèces réactives d’oxygène (ROS), de cellules vivantes et de cellules mortes dans les cultures primaires vivantes à partir de cellules de surface oculaires de souris. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate, propidium iodide, et Hoechst coloration sont utilisés pour évaluer le ROS, les cellules mortes, et les cellules vivantes, respectivement, suivie par l’imagerie et l’analyse.

Abstract

La surface oculaire est soumise à l’usure régulière due à divers facteurs environnementaux. L’exposition aux rayons UV-C constitue un danger pour la santé au travail. Ici, nous démontrons l’exposition des cellules souches primaires de la surface oculaire de la souris au rayonnement UV-C. La formation d’espèces réactives d’oxygène (ROS) est la lecture de l’étendue du stress/dommages oxydatifs. Dans un contexte in vitro expérimental, il est également essentiel d’évaluer le pourcentage de cellules mortes générées par le stress oxydatif. Dans cet article, nous démontrerons la coloration de 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetate (DCFDA) des cellules souches oculaires primaires exposées à la souris et leur quantification basée sur les images fluorescentes de la coloration DCFDA. La coloration DCFDA correspond directement à la génération ROS. Nous démontrons également la quantification des cellules mortes et vivantes en taclant simultanément avec l’iodure de propidium (PI) et Hoechst 3332 respectivement et le pourcentage de cellules positives de DCFDA (ROS positif) et de PI.

Introduction

La surface oculaire (OS) est une unité fonctionnelle principalement composée de la couche externe et épithélia glandulaire de la cornée, glande lachrymal, glande mécidome, conjonctive, partie des marges du couvercle des yeux et innervations qui transduisent les signaux¹. La couche cornéenne transparente en forme de dôme concentre la lumière sur la rétine. Ce tissu avascular est composé de composants cellulaires tels que les cellules épithéliales, les kératocytes, et les cellules endothéliales et les composants acellulaires tels que le collagène et les glycosaminoglycanes². La région est drainée par des larmes qui fournissent également la plupart des nutriments. La position anatomique du système d’exploitation l’oblige à être en contact direct avec l’environnement extérieur, l’exposant souvent à divers composants durs tels que la lumière vive, les microbes, les particules de poussière et les produits chimiques. Ce facteur prédispose le système d’exploitation aux blessures physiques et le rend sujet à diverses maladies.

Le stress oxydatif est causé par le déséquilibre entre la production d’espèces réactives d’oxygène (ROS) et les mécanismes de défense antioxydants endogènes³. Les ROS sont classés en molécules réactives et radicaux libres, qui sont tous deux dérivés de l’oxygène moléculaire (O₂) par la phosphorylation oxydative mitochondriale⁴. Le premier groupe est composé d’espèces non radicales telles que le peroxyde d’hydrogène (H₂O₂), l’oxygène singlet (¹O₂) et le second comprend des espèces telles que les anions de superoxyde (O₂^-), et les radicaux hydroxyles^(OH),entre autres. Ces molécules sont des sous-produits des processus cellulaires normaux et leurs rôles ont été impliqués dans des fonctions physiologiques importantes telles que la transduction du signal, l’expression des gènes et la défense de l’hôte⁵. Une production améliorée de ROS est connue pour être générée en réponse à des facteurs tels que l’invasion d’agents pathogènes, les xénobiotiques et l’exposition au rayonnement ultra-violet (UV)⁴. Cette surproduction de ROS entraîne un stress oxydatif qui entraîne des dommages à des molécules telles que les acides nucléiques, les protéines et les lipides⁶.

La lumière naturelle du soleil, la source la plus prédominante de rayonnement UV, est composée d’UV-A (400 à 320 nm), d’UV-B (320 à 290 nm) et d’UV-C (290 à 200 nm)⁷. Une corrélation inverse entre la longueur d’onde et les énergies spectrales a été rapportée. Bien que les rayonnements UV-C naturels soient absorbés par l’atmosphère, les sources artificielles telles que les lampes au mercure et les instruments de soudage émettent et constituent donc un danger professionnel. Les symptômes de l’exposition aux yeux comprennent la photokératite et la photokeratoconjonctivite⁸. La production de ROS est l’un des principaux mécanismes d’infliger des dommages cellulaires induits par les UV⁹. Dans la présente étude, nous démontrons la détection de ROS à l’aide de la méthode de coloration 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein (DCFDA) dans les cellules de surface oculaires primaires de souris/cellules souches exposées aux UV-C. La fluorescence verte a été capturée à l’aide d’une microscopie fluorescente. Les cellules ont été contre-tachées avec deux colorants, Hoechst 33342 et l’iodure rouge de propidium, pour tacher les cellules vivantes et mortes, respectivement.

Protocol

L’expérience a été réalisée sur des cellules oculaires primaires/cellules souches dérivées de l’œil de souris albinos suisse. L’utilisation d’animaux pour la récolte des yeux pour cette expérience a été approuvée par le Comité institutionnel d’éthique animale, Yenepoya (Considéré comme l’Université) (numéro d’approbation de l’AIEC, 6a/19.10.2016).

1. Préparation des réactifs

REMARQUE : La dérivation des cellules primaires/cellules souches de la surface oculaire de la souris dépasse le cadre de ce protocole. Par conséquent, nous démontrons les doses d’exposition UV-C, la préparation de réactif pour évaluer ROS, les cellules vivantes et mortes et leur quantification. Veuillez consulter le tableau 1 pour les volumes respectifs des réactifs (10 % de sérum bovin fœtal, DCFDA, Hoechst et propidium iodide solutions à ajouter pour obtenir la solution finale de coloration).

1. Préparer une solution de stock de 10 mM DCFDA en dissolvant 25 mg de poudre DCFDA dans 5,13 mL de DMSO. Aliquot 250 l chacun dans des tubes de 1,5 ml de couleur ambre et stocker à -20 oC.
2. Préparer une solution de stock de 10 mg/mL (16,23 mM solution) Hoechst 33342 en dissolvant le contenu entier du flacon de 25 mg dans 2,5 mL d’eau déionisée. Faire des aliquots de 100 l dans des tubes microcentrifugeurs de couleur ambre et les conserver à 2-6 oC pendant jusqu’à 6 mois. Pour un stockage à plus long terme, entreposer à -20 oC.
3. Préparer une solution de bouillon de 1 mg/mL d’iodure de propidium dans de l’eau déionisée, aliquot 1 ml chacun dans des tubes de 1,5 mL de couleur ambre, et stocker à 4 oC.

2. Placage cellulaire et radiothérapie UV-C

1. Avant le placage, dissocier les cellules de surface oculaireprimaire de souris isolées dans notre laboratoire (résultats non publiés ; ces cellules sont un mélange d’épithélial cornéen, de cellules stromales et de kéatocytes) à l’aide d’un agent de dissociation cellulaire douce(Tableau des matériaux).
2. Plaque 0.2 x 10⁶ cellules oculaires oculaires primaires de souris dans 35 mm 0.2% de la matrice de membrane de sous-sol enduit des plats de culture cellulaire dans 2.5 ml de médias complets. Incuber toute la nuit à 37 oC dans un incubateur de CO₂ de 5 % et humidifié.
   REMARQUE : Le support complet pour cultiver les cellules primaires de la surface oculaire de souris est composé de glucose élevé de DMEM contenant 20% de FBS, 1% de Pen-streptop, 1% de Glutamax, 1% d’acide aminé non essentiel (NEAA), 1% de pyruvate de sodium et 0,1% de mercaptoéthanol.
3. Avant d’exposer les cellules à diverses doses d’UV-C, jetez le volume maximum de la médie et ne laissez qu’une mince couche de support (500 l) rester en contact avec les cellules, juste assez pour les couvrir.
4. Emmenez la vaisselle, une à la fois, à la source/chambre UV-C (chambre inférieure d’un four d’hybridation/lien croisé UV; Tableau des matériaux). Placer le plat dans la chambre et retirer le couvercle du plat. La position du couvercle ouvert du plat garantit que les cellules reçoivent la dose maximale d’UV-C pendant l’exposition aux UV-C.
5. Exposer les cellules à différentes catégories/doses d’UV-C : 1 J/m², 100J/m², 1 000 J/m² et 10 000 J/m².
6. Après l’exposition aux UV-C, remplacez immédiatement le couvercle de chacun des plats et retirez-les de la chambre source UV-C.
7. Apportez chacun des plats à la hotte laminaire et rechargez chacun des plats avec 2 ml de supports frais et complets.
8. Incuber les cellules pendant 3 h dans un incubateur co₂ de 37 oC. Trois heures d’incubation après l’exposition aux UV-C sont optimales pour visualiser et quantifier les premiers effets.

3. Préparation des supports de coloration en cellule vivante

1. Préparer le média de coloration frais pendant les 15 dernières min de l’incubation de 3 h cellules après l’exposition AUX UV-C.
2. Pré-chaud 10 ml du support de coloration contenant 10% FBS-DMEM complété avec 1% Pen-Strep à 37 oC.
3. Ajouter 5 ll de 10 mM DCFDA; 5 l de 10 mg/mL de solution Hoechst et 200 oL d’iodure de propidium de 1 mg/mL. Les concentrations finales de DCFDA, Hoechst et PI sont de 5 M, 5 g/mL et 20 g/mL, respectivement, dans les 10 mL de supports de coloration.

4. Coloration DCFDA des cellules oculaires primaires exposées à la souris EXPOSÉE aux UV-C

1. Après 3 h d’incubation des cellules oculaires primaires exposées à la souris uv-C à diverses doses, aspirez les médias des plats de 35 mm.
2. Réapprovisionner avec 2 ml de supports de coloration DCFDA fraîchement préparés à chacun des plats doucement sur les côtés.
3. Incuber les cellules avec le support de coloration pendant 15 min dans l’obscurité dans un incubateur de CO₂ de 37 oC pour la coloration des cellules vivantes.

5. Affichage des cellules tachées DCFDA (ROS), Hoechst et PI

1. Après l’achèvement de l’incubation, jetez les supports de coloration.
2. Ajouter un nouveau support complet aux cellules et observer les cellules sous un microscope fluorescent inversé / imageur cellulaire (Tableau des matériaux). Photographiez les champs désirés : champ lumineux, fluorescence bleue, fluorescence rouge, fluorescence verte.
   REMARQUE: Les cellules bleues tachées fluorescentes sont les noyaux, la fluorescence verte est pour les cellules génératrices ROS et la fluorescence rouge indique les cellules mortes positives PI.

6. Quantification des cellules tachées (Hoechst-Blue, PI-Dead et Green-ROS) à l’aide de techniques d’imagerie

1. Exportez les images capturées sous le microscope fluorescent inversé/imageur cellulaire à ImageJ pour la quantification.
2. Ouvrez chacune des images une à la fois, en utilisant chaque canal (c.-à-d. bleu (Nuclei/Hoechst), vert (ROS), rouge (Mort/PI positif)) séquentiellement, pour le comptage. Commencez par le contrôle non exposé et se déplacer séquentiellement à 1, 100, 1000 et 10.000 J/m^-2.
3. Compter les cellules à l’aide de l’outil de comptage cellulaire marqué comme une croix dans le menu logiciel pour chacun des champs [bleu positif (Hoechst positif; noyaux), positif rouge (PI positif; cellules mortes); positif vert (ROS)] dans chacune des images correspondant à chacun des Traitements.
4. Comptez en cliquant sur chacun des signaux spécifiques dans chacun des champs. Par exemple, en cliquant sur les noyaux tachés bleu/Hoechst donnera le nombre total de noyaux dans un champ donné.
5. Calculez les résultats comme le pourcentage de décès cellulaire par les dommages UV (nombre de cellules positives IP x 100 divisé par le nombre de cellules positives Hoechst) et le pourcentage de la production de ROS par les dommages UV (nombre de cellules positives DCFDA x 100 divisé par le nombre de cellules positives Hoechst).

Representative Results

DCFDA est un colorant incolore qui est une forme chimiquement réduite de fluorescéine utilisée comme indicateur pour détecter le ROS dans les cellules. Ce colorant est emprisonné à l’intérieur des cellules et est facilement oxydé à la dichlorodihydrofluescein fluorescent (DCF), qui émet une fluorescence verte. Cette fluorescence peut être détectée à l’aide d’une microscopie fluorescente. Les cellules peuvent être visualisées et corrélées avec l’accumulation de ROS comme suit : (i) les cellules vivantes sans ROS émettent la fluorescence bleue élevée ; (ii) les cellules vivantes avec l’accumulation de ROS émettent une fluorescence bleue élevée avec une faible fluorescence verte; et (iii) les cellules mortes avec l’accumulation de ROS émettent la fluorescence bleue basse avec la fluorescence rouge et verte élevée.

Les cellules témoins et les cellules exposées à 1 J/m² d’UV-C n’ont pas montré de cellules positives DCFDA/ROS et PI. Le contrôle non exposé UV-C n’a montré la coloration nucléaire que comme indiqué par la coloration Hoechst (Figure 1). Cependant, aucune cellule positive DE PI ou de DCFDA n’a été observée dans les cellules témoins non exposées aux UV-C (figure 1).

Les cellules exposées à 100 J/m² d’UV-C présentaient de faibles cellules positives ROS et PI. Les cellules primaires de la surface oculaire de la souris lors de l’exposition aux UV-C à une dose de 100 J/m² ont montré environ 5% de co-coloration de DCFDA et PI, ce qui indique la formation de ROS et la mort cellulaire dans 5% des cellules (Figure 1).

Les cellules exposées à 1 000 J/m² d’UV-C présentaient des cellules positives ROS et IP de 60 % à 70 %. Les cellules primaires de la surface oculaire de la souris lors de l’exposition aux UV-C à une dose de 1 000 J/m² ont montré environ 70 % de co-coloration de DCFDA et d’IP, ce qui indique la formation de ROS et la mort cellulaire dans 70 % des cellules(figure 1).

Les cellules exposées à 10 000 J/m² d’UV-C présentaient 100 % de cellules positives ROS et 100 % de mort cellulaire. La dose d’UV-C la plus élevée (10 000 J/m²) lorsqu’elle a été exposée aux cellules primaires oculaires de la souris a entraîné une mort cellulaire à 100 % (cellules positives de l’IP) et une formation de ROS (coloration DCFDA), ce qui indique la plus grande létalité de cette dose particulière d’UV-C (figure 1).

Les cellules traitées avec 1 J/m² de rayonnement UV-C n’ont montré aucune accumulation de ROS et le pourcentage de cellules vivantes dans cette dose était comparable à celui des cellules témoins. Les cellules ont démontré une quantité significative de mort cellulaire et d’accumulation de ROS à 100 J/m^2. La plus grande quantité d’accumulation de ROS et de mort cellulaire a été observée dans les cellules traitées avec 10 000 J/m² de rayonnement UV-C.

Les résultats quantifiés (pourcentage de la génération de ROS et pourcentage de décès cellulaire selon les formules données en vertu de l’article 6.3) ont été tracés sous la forme d’un graphique à barres (figure 2). L’axe X représente les doses d’UV-C tandis que l’axe Y représente le pourcentage de cellules. La barre verte représente le pourcentage de ROS, et les barres rouges représentent la mort cellulaire à différentes doses de rayonnement UV-C (figure 2). Le pourcentage de ROS et de cellules mortes était de l’ordre de 0%, 0%, 10%, 70% et 100% aux doses UV-C: contrôle non exposé, 1 J/m², 100 J/m², 1 000 J/m² et 10 000 J/m², respectivement (Figure 2).

Figure 1 : Images composites de cellules vivantes des cellules primaires de surface oculaire de la souris exposées à diverses doses d’UV-C (contrôle non exposé, 1, 100, 1 000, 10 000 J/m²). Ces images ont été capturées sous différents filtres : champ lumineux (pour la morphologie cellulaire), bleu (tache nucléaire de Hoechst), vert (génération ROS) et rouge (propidium iodide taché de cellules mortes). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Graphiques à barres montrant les résultats de quantification obtenus après calcul du pourcentage de production de ROS et du pourcentage de cellules mortes lors de l’exposition des cellules de surface oculaires primaires de la souris à diverses doses de rayonnement UV-C. L’axe X représente les doses D’UV-C, tandis que l’axe Y représente le pourcentage de cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Composant	Volume
Sérum bovin fœtal à 10% contenant du DMEM	9790 l
Solution d’actions DCFDA	5 ll
Hoechst 33342 solution d’actions	5 ll
Solution de stock d’iodure de Propidium	200 l

Tableau 1 : Réactifs requis pour la préparation de la solution de coloration.

Problème	Raisons probables	Dépannage	Commentaires
Aucune ou très peu de cellules positives ROS ou PI sont tachées lorsque les cellules ont été traitées avec une dose UV élevée à la plus élevée	i. Utilisation d’une vieille solution de coloration.	i. Utilisez une solution de coloration fraîchement préparée.	i. Une solution de coloration préparée antérieurement conduit à une mauvaise coloration des cellules.
	ii. Plat de culture overconfluent ayant pour résultat la récupération des dommages UVC par les cellules.	ii. Fixez seulement 0,2 million de cellules dans chaque plat de culture cellulaire de 35 mm et ne laissez jamais les cellules se développer pendant plus de 12 h avant de les exposer à des doses d’UVC.	ii. Les cellules surconfluentes peuvent récupérer des dommages UVC, et donc aucune ou peu de cellules positives de ROS et d’IP seront visualisées.

Tableau 2 : Dépannage.

Discussion

La méthode de coloration DCFDA décrite ici permet la visualisation de ROS dans les cellules vivantes oculaires primaires de souris traitées avec le rayonnement UV-C. Un avantage de cette méthode de coloration est qu’elle permet également aux chercheurs d’étudier les effets immédiats des UV-C (3 heures après l’exposition aux UVC) sur les cellules vivantes et leur énumération simultanée pour le pourcentage de ROS positif, ainsi que, les cellules mortes. En outre, comme la méthode de coloration est utilisée sur les cellules vivantes, les cellules peuvent être incubées dans le même support pendant une plus longue période (plusieurs jours) pour l’étude des effets retardés du rayonnement UV-C. Par conséquent, cette méthode de coloration permet de visualiser la génération ROS (vert) et de distinguer simultanément les populations vivantes, apoptotiques et mortes dans les cellules vivantes sous un microscope à fluorescence inversée. Cependant, dans certaines circonstances, en dépit de l’anticipation d’obtenir des cellules positives DE ROS et d’IP, la visualisation peut échouer. Dans de tels cas, le dépannage est suggéré (tableau 2).

Ce protocole doit être réalisé avec précision pour obtenir des résultats optimaux. Les résultats optimaux indiquent une corrélation du signal fluorescent vert émis/ROS généré comme une lecture précise de la dose spécifique UV-C induit des dommages à l’ADN. En d’autres termes, pour effectuer cette étape, le volume de médias qui est en contact avec les cellules pendant l’exposition AUX UV-C ne devrait pas être tant ainsi que la dose d’UV-C ne parvient pas à obtenir les dommages requis. Par conséquent, il est essentiel de garder un volume minimal de médias, par exemple 500 L par plat de 35 mm, juste assez pour couvrir les cellules pendant l’exposition UV-C à toutes les doses spécifiées. Deuxièmement, le volume des médias ne devrait pas être si faible que les cellules se dessèchent pendant l’exposition aux UV-C. Enfin, immédiatement après l’exposition des cellules aux UV-C, les cellules doivent être rechargées avec des supports frais au volume optimal (disons 2 mL), afin d’éviter davantage les dommages et la génération ROS.

Une limitation de cette technique est le type de ROS généré. D’autres essais supplémentaires doivent être effectués pour détecter le type spécifique de ROS en réponse aux gammes de dose UV-C. Ces essais incluent l’évaluation du radical hydroxyle intracellulaire^(OH),des radicaux intracellulaires de superoxyde, des espèces d’azote réactiveintracellulaire, des radicaux hydroxyles mitochondriaux, des superoxydes mitochondriaux, et du peroxyde d’hydrogène dans les cellules vivantes utilisant des kits commercialement disponibles. Une autre limitation de cette technique est la détectabilité du pourcentage de génération ROS à des doses inférieures à 10 J/m² et supérieures à 10 000 J/m². Apparemment, aucune cellule positive ROS n’était visible lorsque les cellules primaires/cellules souches de la surface oculaire de la souris ont été exposées à des doses d’UV-C inférieures à 10 J/m^2. Au contraire, les cellules positives 100% ROS étaient visibles lorsque les cellules étaient exposées à une dose d’UV-C supérieure à 10 000 J/m². Par conséquent, d’autres essais (p. ex., l’analyse enzymatique, la mesure des marqueurs de stress oxydatifs tels que 8-hydroxydeoxyguaine (8-OHdG) (marqueur de dommages à l’ADN) et l’analyse occidentale des protéines de dommages à l’ADN à diverses doses) pourraient être utiles pour comprendre l’étendue/type de dommages cellulaires/moléculaires à divers niveaux. Une troisième limitation de cette technique est la corrélation des doses UV-C au ROS générée s’étendant sur différents types de cellules. Cela doit être validé.

Actuellement, les kits DCFDA sont disponibles dans le commerce pour la détection ROS soit en utilisant la microscopie ou la cytométrie de flux^10,11. Cependant, ces kits sont coûteux et ne peuvent pas être offerts par les laboratoires de recherche dans les pays à ressources limitées. Par conséquent, ce protocole est très utile avec une efficacité semblable aux méthodes vendues commercialement. Deuxièmement, nous avons incorporé la tache de cellule morte d’iodide de propidium avec la génération dCFDA/ROS. Par conséquent, la surveillance des cellules vivantes des cellules positives et mortes ROS peut être effectuée simultanément en utilisant cette méthode.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA)	Sigma	D6883	2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species.
Cell culture dish (35 mm)	Eppendorf	SA 003700112	Sterile dishes for culturing the cells.
DMEM High Glucose	HiMedia	AT007	Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose.
Fetal Bovine Serum, EU Origin	HiMedia	RM99955	One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements.
GlutMax	Gibco, Thermo Fisher Scientific	35050061	Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth.
HL-2000 Hybrilinker	UVP		Hybridization oven/UV cross linker
Hoechst 33342	Sigma	B2261	Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive.
Matrigel	Corning		Basement membrane matrix
MEM Non-Essential Amino Acids (100X)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	11140050	Used as a supplement to increase the cell growth and viability.
Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	15140122	Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture.
Propidium Iodide	Sigma	P4170	Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells.
TryplE Express	Thermo Fisher Scientific		Gentle cell dissociation agent
ZOE Fluorescent Cell Imager	Bio-rad