Summary
Dieses Protokoll demonstriert den gleichzeitigen Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), lebenden Zellen und abgestorbenen Zellen in lebenden Primärkulturen aus Maus-Augenoberflächenzellen. 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetate, Propidiumiodid und Hoechst-Färbung werden verwendet, um die ROS,, abgestorbene Zellen und lebende Zellen zu bewerten, gefolgt von Bildgebung und Analyse.
Abstract
Die Augenoberfläche ist aufgrund verschiedener Umwelteinflüsse regelmäßig abnutzend. Die Exposition gegenüber UV-C-Strahlung stellt eine Gesundheitsgefährdung am Arbeitsplatz dar. Hier zeigen wir die Exposition von Primärstammzellen von der Maus-Augenoberfläche gegenüber UV-C-Strahlung. Die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) ist die Auslesung des Ausmaßes von oxidativem Stress/Schäden. In einer experimentellen In-vitro-Einstellung ist es auch wichtig, den Prozentsatz der toten Zellen zu bewerten, die durch oxidativen Stress erzeugt werden. In diesem Artikel zeigen wir die 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetate (DCFDA) Färbung von UV-C-exponierten primären Augenoberflächenstammzellen der Maus und deren Quantifizierung auf der Grundlage der fluoreszierenden Bilder der DCFDA-Färbung. DCFDA Färbung entspricht direkt der ROS-Generation. Wir zeigen auch die Quantifizierung von toten und lebenden Zellen durch gleichzeitige Färbung mit Propidiumiodid (PI) bzw. Hoechst 3332 bzw. dem Prozentsatz der DCFDA (ROS-positiven) und PI-positiven Zellen.
Introduction
Die Augenoberfläche (OS) ist eine funktionelle Einheit, die hauptsächlich aus der äußeren Schicht und drüsensen Epithelie von Hornhaut, lachrymaler Drüse, meibomianischer Drüse, Bindehaut, einem Teil der Augenlidränder und Innervationen besteht, die Signale1transduce. Die transparente kuppelförmige Hornhautschicht lenkt das Licht auf die Netzhaut. Dieses avaskuläre Gewebe besteht aus zellulären Komponenten wie Epithelzellen, Keratozyten und Endothelzellen und azellulären Komponenten wie Kollagen und Glycosaminoglycans2. Das Gebiet wird von Tränen entwässert, die auch die meisten Nährstoffe liefern. Die anatomische Position des Betriebssystems zwingt es zu einem direkten Kontakt mit der äußeren Umgebung und setzt es oft verschiedenen harten Komponenten wie hellem Licht, Mikroben, Staubpartikeln und Chemikalien aus. Dieser Faktor prädisponiert das Betriebssystem für körperliche Verletzungen und macht es anfällig für verschiedene Krankheiten.
Oxidativer Stress wird durch das Ungleichgewicht zwischen der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und den endogenen antioxidativen Abwehrmechanismen3verursacht. ROS werden in reaktive Moleküle und freie Radikale eingeteilt, die beide aus molekularem Sauerstoff(O2) durch mitochondriale oxidative Phosphorylierung4abgeleitet werden. Die erste Gruppe besteht aus nicht-radikalen Arten wie Wasserstoffperoxid (H2O2), Singlet-Sauerstoff (1O2) und letztere umfasst Arten wie Superoxid-Anionen(O2-) und Hydroxylradikale (•OH), unter anderem. Diese Moleküle sind Nebenprodukte normaler zellulärer Prozesse und ihre Rolle wurden in wichtige physiologische Funktionen wie Signaltransduktion, Genexpression und Wirtsabwehr5involviert. Eine verbesserte Produktion von ROS ist bekannt, als Reaktion auf Faktoren wie Pathogeninvasion erzeugt werden, Xenobiotika, und Exposition gegenüber ultravioletten (UV) Strahlung4. Diese Überproduktion von ROS führt zu oxidativem Stress, der zur Schädigung von Molekülen wie Nukleinsäuren, Proteinen und Lipiden führt6.
Natürliches Sonnenlicht, die vorherrschende Quelle von UV-Strahlung, besteht aus UV-A (400–320 nm), UV-B (320–290 nm) und UV-C (290–200 nm)7. Es wurde eine inverse Korrelation zwischen der Wellenlänge und den Spektralenergien berichtet. Obwohl natürliche UV-C-Strahlung von der Atmosphäre absorbiert wird, emittieren künstliche Quellen wie Quecksilberlampen und Schweißgeräte und stellen daher eine berufliche Gefahr dar. Symptome der Exposition gegenüber Augen sind Photokeratitis und Photokeratokonjunktivitis8. Die Produktion von ROS ist einer der wichtigsten Mechanismen, um UV-induzierten Zellschadenzuzufügen 9. In der aktuellen Studie zeigen wir den Nachweis von ROS mit der 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein-Diacetat (DCFDA)-Färbungsmethode in primären Augenoberflächenzellen/Stammzellen der Maus, die UV-C ausgesetzt sind. Die grüne Fluoreszenz wurde mittels fluoreszierender Mikroskopie erfasst. Die Zellen wurden mit zwei Farbstoffen, Hoechst 33342 und rotem Propidiumjodid, gegengefärbt, um die lebenden bzw. abgestorbenen Zellen zu färben.
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Protocol
Das Experiment wurde an primären Augenzellen/Stammzellen durchgeführt, die vom Schweizer Albino-Mausauge abgeleitet wurden. Die Verwendung von Tieren zur Augenernte für dieses Experiment wurde vom Institutional Animal Ethical Committee, Yenepoya (Considered to be University) genehmigt (IEAC-Zulassungsnummer, 6a/19.10.2016).
1. Zubereitungen von Reagenzien
HINWEIS: Die Ableitung von Primärzellen/Stammzellen von der Augenoberfläche der Maus geht über den Rahmen dieses Protokolls hinaus. Daher zeigen wir die UV-C-Expositionsdosen, reagenzvorbereitung zur Beurteilung von ROS, lebende und abgestorbene Zellen und deren Quantifizierung. Bitte beachten Sie Tabelle 1 für die jeweiligen Vogen der Reagenzien (10% fetales Rinderserum, DCFDA, Hoechst und Propidiumiodid-Lagerlösungen, die zur Erzielung der endgültigen Färbelösung hinzugefügt werden).
- Bereiten Sie eine Lagerlösung von 10 mM DCFDA vor, indem Sie 25 mg DCFDA-Pulver in 5,13 ml DMSO auflösen. Aliquot 250 l in bernsteinfarbenen 1,5 ml-Röhren und bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mg/ml (16,23 mM Lösung) Hoechst 33342 vor, indem Sie den gesamten Inhalt der 25 mg Durchstechflasche in 2,5 ml entionisiertem Wasser auflösen. In bernsteinfarbenen Mikrozentrifugenröhrchen Aliquots von 100 l in bernsteinfarbenen Mikrozentrifugenrohren herstellen und bis zu 6 Monate bei 2-6 °C lagern. Für längerfristige Lagerung bei -20 °C lagern.
- Bereiten Sie eine Lagerlösung von 1 mg/ml Propidiumjodid in entionisiertem Wasser, aliquot 1 ml jeweils in bernsteinfarbenen 1,5 ml-Röhren, und lagern Sie bei 4 °C.
2. Zellbeschichtung und UV-C-Strahlungsbehandlung
- Dissoziieren Sie vor der Beschichtung die in unserem Labor isolierten primären Augenoberflächenzellen der Maus (unveröffentlichte Ergebnisse; solche Zellen sind eine Mischung aus Hornhautepithel, Stromalzellen und Keratozyten) mit einem sanften Zelldissoziationsmittel (Tabelle der Materialien).
- Platte 0,2 x 106 Maus primäre Okuläroberflächenzellen in 35 mm 0,2% Kellermembranmatrix-beschichteten Zellkulturschalen in 2,5 ml Komplettmedien. Über Nacht bei 37 °C in einem 5%CO2 und befeuchteten Inkubator inkubieren.
HINWEIS: Das komplette Medium für die Kultivierung von Primärzellen von der Augenoberfläche der Maus besteht aus DMEM-hochglukosehaltigem Gehalt von 20% FBS, 1% Pen-Strep, 1% Glutamax, 1% nicht-essentieller Aminosäure (NEAA), 1% Natriumpyruvat und 0,1% - Bevor Sie die Zellen verschiedenen Dosen von UV-C aussetzen, verwerfen Sie das maximale Medienvolumen und lassen Sie nur eine dünne Medienschicht (ca. 500 L) in Kontakt mit den Zellen bleiben, gerade genug, um sie abzudecken.
- Nehmen Sie die Gerichte, nacheinander zur UV-C-Quelle/Kammer (die untere Kammer eines Hybridisierungsofens/UV-Kreuzverlinker; Materialtabelle). Legen Sie die Schale in die Kammer und entfernen Sie den Deckel der Schale. Die offene Deckelposition der Schale sorgt dafür, dass die Zellen während der UV-C-Exposition die maximale UV-C-Dosis erhalten.
- Setzen Sie die Zellen verschiedenen Graden/Dosen von UV-C aus: 1 J/m2, 100J/m2, 1.000 J/m2 und 10.000 J/m2.
- Nach der UV-C-Belichtung den Deckel jedes Geschirrs sofort austauschen und aus der UV-C-Quellkammer entfernen.
- Bringen Sie jedes der Gerichte auf die laminare Luftstromhaube und füllen Sie jedes der Gerichte mit 2 ml frischen Komplettmedien auf.
- Inkubieren Sie die Zellen für 3 h in einem 37 °C CO2-Inkubator. Drei Stunden Inkubation nach UV-C-Exposition sind optimal, um die frühen Effekte zu visualisieren und zu quantifizieren.
3. Vorbereitung von Live-Zell-Färbemedien
- Bereiten Sie die Färbemittel während der letzten 15 min der 3 h Zellinkubation nach UV-C-Exposition frisch vor.
- Vorwarm 10 ml der Färbemedien mit 10% FBS-DMEM ergänzt durch 1% Pen-Strep bis 37 °C.
- Fügen Sie 5 l von 10 mM DCFDA hinzu; 5 l von 10 mg/ml Hoechst-Lösung und 200 l mit 1 mg/ml Propidiumjodid. Die Endkonzentrationen von DCFDA, Hoechst und PI liegen in den 10 ml DerFärdenmedien bei 5 m, 5 g/ml bzw. 20 g/ml.
4. DCFDA Färbung von UV-C exponierten Maus primären Augenzellen
- Nach 3 h Inkubation von UV-C exponierten Maus primärer Augenzellen in verschiedenen Dosen, aspirieren Sie die Medien aus den 35 mm Geschirr.
- Mit 2 ml frisch zubereiteten DCFDA-Färbemedien an jedes der Gerichte von den Seiten sanft auffüllen.
- Inkubieren Sie die Zellen mit den Färbemedien 15 min im Dunkeln in einem 37 °C CO2-Inkubator zur Färbung von Lebendenzellen.
5. Betrachtung von DCFDA (ROS), Hoechst und PI gebeizten Zellen
- Nach Abschluss der Inkubation die Färbemedien entsorgen.
- Fügen Sie den Zellen frische serfüllende Medien hinzu und beobachten Sie die Zellen unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop/Zellbilder (Tabelle der Materialien). Fotografieren Sie die gewünschten Felder: Hellfeld, blaue Fluoreszenz, rote Fluoreszenz, grüne Fluoreszenz.
HINWEIS: Die blauen fluoreszierend gefärbten Zellen sind die Kerne, die grüne Fluoreszenz ist für ROS-erzeugungende Zellen und die rote Fluoreszenz zeigt die PI-positiven abgestorbenen Zellen an.
6. Quantifizierung von gebeizten Zellen (Hoechst-Blue, PI-Dead und Green-ROS) mit bildgebenden Verfahren
- Exportieren Sie die unter dem invertierten Fluoreszenzmikroskop/Zellbilder aufgenommenen Bilder zur Quantifizierung nach ImageJ.
- Öffnen Sie jedes der Bilder nacheinander, indem Sie jeden Kanal (d. h. blau (Nuclei/Hoechst), grün (ROS), rot (Dead/PI positiv)) sequenziell zum Zählen verwenden. Beginnen Sie mit dem nicht belichteten Steuerelement und bewegen Sie sich sequenziell zu 1, 100, 1.000 und 10.000 J/m-2.
- Zählen Sie die Zellen mit dem Zellenzählwerkzeug, das als Kreuz im Softwaremenü markiert ist, für jedes der Felder [blau positiv (Hoechst positiv; Kerne), rot positiv (PI-positiv; tote Zellen); grün positiv (ROS)] in jedem der Bilder, die jedem der Behandlungen.
- Zählen Sie, indem Sie auf jedes der spezifischen Signale in jedem der Felder klicken. Wenn Sie beispielsweise auf die blau/Hoechst-Gebeikerne klicken, wird die Gesamtzahl der Kerne in einem bestimmten Feld angezeigt.
- Berechnen Sie die Ergebnisse als Prozentsatz des Zelltodes durch UV-Schäden (Anzahl der PI-positiven Zellen x 100 geteilt durch die Anzahl der Hoechst-positiven Zellen) und den Prozentsatz der ROS-Produktion durch UV-Schäden (Anzahl der DCFDA-positiven Zellen x 100 geteilt durch die Anzahl der Hoechst-positiven Zellen).
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Representative Results
DCFDA ist ein farbloser Farbstoff, der eine chemisch reduzierte Form von Fluorescein ist, die als Indikator für den Nachweis von ROS in Zellen verwendet wird. Dieser Farbstoff wird in Zellen eingeschlossen und leicht zu fluoreszierendem Dichlordihydrofluorescein (DCF) oxidiert, das eine grüne Fluoreszenz aussendet. Diese Fluoreszenz kann mit fluoreszierender Mikroskopie nachgewiesen werden. Die Zellen können visualisiert und mit der ROS-Akkumulation wie folgt korreliert werden: (i) lebende Zellen ohne ROS emittieren hohe blaue Fluoreszenz; ii) lebende Zellen mit ROS-Akkumulation emittieren hohe blaue Fluoreszenz mit niedriger grüner Fluoreszenz; und (iii) abgestorbene Zellen mit ROS-Akkumulation emittieren eine niedrige blaue Fluoreszenz mit hoher roter und hoher grüner Fluoreszenz.
Kontrollzellen und Zellen, die 1 J/m2 UV-C ausgesetzt waren, zeigten keine DCFDA/ROS- und PI-positiven Zellen. Die UV-C-unbelichtete Kontrolle zeigte nur die kerntechnische Färbung, wie durch die Hoechst-Färbung angegeben (Abbildung 1). In den UV-C-nicht exponierten Kontrollzellen wurden jedoch keine PI- oder DCFDA-positiven Zellen beobachtet (Abbildung 1).
Zellen, die 100J/m2 UV-C ausgesetzt waren, wiesen niedrige ROS- und PI-positive Zellen auf. Primärzellen von der Maus-Augenoberfläche bei Uv-C-Exposition in einer Dosis von 100 J/m2 zeigten etwa 5% Co-Färbung von DCFDA und PI, was auf die Bildung von ROS und Zelltod in 5% der Zellen hindeutet (Abbildung 1).
Zellen, die 1.000J/m2 UV-C ausgesetzt waren, zeigten 60%–70% ROS- und PI-positive Zellen. Primärzellen von der Augenoberfläche der Maus bei Uv-C-Exposition in einer Dosis von 1.000 J/m2 zeigten etwa 70% Co-Färbung von DCFDA und PI, was auf die Bildung von ROS und Zelltod in 70% der Zellen hindeutet (Abbildung 1).
Zellen, die 10.000J/m2 UV-C ausgesetzt waren, zeigten 100% ROS-positive Zellen und 100% Zelltod. Die höchste UV-C-Dosis (10.000 J/m2 ), wenn sie der Maus okulären Primärzellen ausgesetzt wurde, führte zu 100% Zelltod (PI-positive Zellen) und ROS-Bildung (DCFDA-Färbung), wodurch die höchste Letalität dieser speziellen UV-C-Dosis angezeigt wurde (Abbildung 1).
Zellen, die mit 1 J/m2 UV-C-Strahlung behandelt wurden, zeigten keine Ansammlung von ROS und der Prozentsatz der lebenden Zellen in dieser Dosis war mit dem der Kontrollzellen vergleichbar. Die Zellen zeigten eine signifikante Menge an Zelltodund ROS-Akkumulation bei 100 J/m2 . Die höchste Menge an ROS-Akkumulation und Zelltod wurde in Zellen beobachtet, die mit 10.000 J/m2 UV-C-Strahlung behandelt wurden.
Die quantifizierten Ergebnisse (Prozentsatz der ROS-Generierung und Prozentsatz des Zelltodes gemäß den in Abschnitt 6.3 angegebenen Formeln) wurden in Form eines Balkendiagramms dargestellt (Abbildung 2). Die X-Achse stellt die UV-C-Dosen dar, während die Y-Achse den Prozentsatz der Zellen darstellt. Der grüne Balken stellt den Prozentsatz von ROS dar, und die roten Balken stellen den Zelltod bei verschiedenen Dosen von UV-C-Strahlung dar (Abbildung 2). Der Anteil der ROS- und abgestorbenen Zellen lag bei den UV-C-Dosen bei 0%, 0%, 10%, 70% und 100% bei den UV-C-Dosen: unbelichtete Kontrolle, 1 J/m2, 100 J/m2, 1.000 J/m2 bzw. 10.000 J/m2 (Abbildung 2).
Abbildung 1: Zusammengesetzte Live-Zell-Bilder der Maus-Augenoberflächen-Primärzellen, die verschiedenen Dosen von UV-C ausgesetzt sind (Unexponierte Kontrolle, 1, 100, 1.000, 10.000 J/m2). Diese Bilder wurden unter verschiedenen Filtern aufgenommen: Hellfeld (für Zellmorphologie), blau (Hoechst Kernfleck), grün (ROS-Generation) und rot (Propidiumiodid gebeizte tote Zellen). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Balkendiagramme, die die Quantifizierungsergebnisse zeigen, die nach der Berechnung des Prozentsatzes der ROS-Erzeugung und des Prozentsatzes der abgestorbenen Zellen bei Exposition von primären Maus-Augenoberflächenzellen bei verschiedenen Dosen von UV-C-Strahlung erzielt wurden. Die X-Achse stellt die UV-C-Dosen dar, während die Y-Achse den Prozentsatz der Zellen darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Komponente | Volumen |
| 10% Fetales Rinderserum mit DMEM | 9790 'L |
| DCFDA-Lagerlösung | 5 l |
| Hoechst 33342 Lagerlösung | 5 l |
| Propidium iodid-Lagerlösung | 200 l |
Tabelle 1: Reagenzien, die für die Herstellung einer Färbelösung erforderlich sind.
| Problem | Wahrscheinliche Gründe | Problembehandlung | Kommentare |
| Keine oder sehr wenig ROS- oder PI-positive Zellen werden gefärbt, wenn die Zellen mit hoher bis hoher UV-Dosis behandelt wurden | i. Verwendung einer alten Färbelösung. | i. Verwenden Sie frisch zubereitete Färbelösung. | i. Früher vorbereitete Färbelösung führt zu unsachgemäßer Färbung der Zellen. |
| ii. Überflusskulturschale, die zur Bergung von UVC-Schäden durch die Zellen führt. | ii. Nur 0,2 Millionen Zellen in jeder 35 mm Zellkulturschale veranlassen und die Zellen nie länger als 12 h wachsen lassen, bevor sie UVC-Dosen aussetzen. | ii. Überkonfluente Zellen können UVC-Schäden bergen, und daher werden keine oder nur wenige ROS- und PI-positive Zellen visualisiert. |
Tabelle 2: Fehlerbehebung.
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Discussion
Die hier beschriebene DCFDA-Färbemethode ermöglicht die Visualisierung von ROS in primären augenförmigen, mit UV-C-Strahlung behandelten primären okulären Lebendenzellen der Maus. Ein Vorteil dieser Färbemethode ist, dass sie es den Forschern auch ermöglicht, die unmittelbaren Auswirkungen von UV-C (3 Stunden nach UVC-Exposition) auf die lebenden Zellen und deren gleichzeitige Aufzählung für den Prozentsatz von ROS-positiven sowie abgestorbenen Zellen zu untersuchen. Darüber hinaus können die Zellen, da die Färbemethode auf den lebenden Zellen angewendet wird, für längere Zeit (mehrere Tage) in demselben Medium weiter inkubiert werden, um die verzögerte Wirkung der UV-C-Strahlung zu untersuchen. Diese Färbemethode ermöglicht es daher, die ROS-Generation (grün) zu visualisieren und gleichzeitig die lebenden, apoptotischen und toten Zellpopulationen in lebenden Zellen unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop zu unterscheiden. Unter bestimmten Umständen kann die Visualisierung jedoch trotz der Erwartung, ROS-positive und PI-positive Zellen zu erhalten, fehlschlagen. Für solche Fälle wird die Fehlerbehebung vorgeschlagen (Tabelle 2).
Dieses Protokoll muss genau durchgeführt werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Optimale Ergebnisse deuten auf eine Korrelation des grünen Fluoreszenzsignals hin, das als genaue Auslesung der spezifischen UV-C-Dosis induzierten DNA-Schäden erzeugt wird. Mit anderen Worten, für die Durchführung dieses Schritts sollte das Volumen der Medien, die während der UV-C-Exposition mit den Zellen in Berührung kommt, nicht so sehr sein, dass die UV-C-Dosis nicht die erforderliche Schädigung verursacht. Daher ist es wichtig, ein minimales Volumen an Medien, sagen wir 500 l pro 35 mm Schale, gerade genug zu halten, um die Zellen während der UV-C-Exposition bei allen angegebenen Dosen zu decken. Zweitens sollte das Medienvolumen nicht so gering sein, dass die Zellen während der UV-C-Exposition austrocknen. Schließlich sollten die Zellen unmittelbar nach der Exposition der Zellen gegenüber dem UV-C mit frischen Medien auf das optimale Volumen (z.B. 2 ml) aufgefüllt werden, um Schäden und ROS-Generierung weiter zu vermeiden.
Eine Einschränkung dieser Technik ist die Art von ROS erzeugt. Weitere zusätzliche Tests müssen durchgeführt werden, um den spezifischen ROS-Typ als Reaktion auf die UV-C-Dosisbereiche zu erkennen. Dazu gehören die Bewertung des intrazellulären Hydroxylradikals(•OH), intrazellulärer Superoxid-Radikale, intrazellulärer reaktiver Stickstoffarten, mitochondrialer Hydroxylradikale, mitochondrialer Superoxide und Wasserstoffperoxid in lebenden Zellen mit kommerziell erhältlichen Kits. Eine weitere Einschränkung dieser Technik ist die Nachweisbarkeit der prozentualen ROS-Erzeugung bei Dosen unter 10J/m2 und über 10.000 J/m2 . Anscheinend waren keine ROS-positiven Zellen sichtbar, wenn die Primärzellen/Stammzellen von der Maus-Augenoberfläche UV-C-Dosen von weniger als 10J/m2ausgesetzt waren. Im Gegenteil, 100% ROS-positive Zellen waren sichtbar, wenn die Zellen einer UV-C-Dosis über 10.000J/m2ausgesetzt waren. Daher könnten andere Assays (z. B. Enzymanalyse, Messung von oxidativen Stressmarkern wie 8-Hydroxydeoxyguanosin (8-OHdG) (DNA-Schadensmarker) und Western-Blot-Analyse von DNA-Schadensproteinen in verschiedenen Dosen nützlich sein, um das Ausmaß/die Art der zellulären/molekularen Schäden auf verschiedenen Ebenen zu verstehen. Eine dritte Einschränkung dieser Technik ist die Korrelation der UV-C-Dosen mit dem ROS, das über verschiedene Zelltypen erzeugt wird. Dies muss validiert werden.
Derzeit sind DCFDA-Kits für die ROS-Erkennung entweder mit Mikroskopie oder Durchflusszytometrie10,11erhältlich. Solche Kits sind jedoch teuer und können von Forschungslaboratorien in ländern mit eingeschränkter Ressourcenbeschränkung nicht bereitgestellt werden. Daher ist dieses Protokoll sehr nützlich mit einer Effizienz ähnlich den kommerziell verkauften Methoden. Zweitens haben wir den Propidium-Iodid-Totzellfleck zusammen mit der DCFDA/ROS-Generation integriert. Daher kann die Überwachung von ROS-positiven und abgestorbenen Zellen gleichzeitig mit dieser Methode durchgeführt werden.
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Disclosures
Die Autoren erhielten finanzielle Unterstützung von Bio-Rad Laboratories India Private Limited für die Förderung des Artikels.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen die Unterstützung des Yenepoya Research Centre, Yenepoya (Als Universität) für die Infrastruktureinrichtungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFDA) | Sigma | D6883 | 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate is fluorogenic probe and is permeable to cells. It is used for quantification of reactive oxygen species. |
| Cell culture dish (35 mm) | Eppendorf | SA 003700112 | Sterile dishes for culturing the cells. |
| DMEM High Glucose | HiMedia | AT007 | Most widely used cell culture media, contains 4500 mg/L of glucose. |
| Fetal Bovine Serum, EU Origin | HiMedia | RM99955 | One of the most important components of cell culture media. It provides growth factors, amino acids, proteins, fat-soluble vitamins such as A, D, E, and K, carbohydrates, lipids, hormones, minerals, and trace elements. |
| GlutMax | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used as a supplement and an alternative to L-glutamine. It helps in improving cell viability and growth. |
| HL-2000 Hybrilinker | UVP | Hybridization oven/UV cross linker | |
| Hoechst 33342 | Sigma | B2261 | Hoechst stain is permeable to both live and dead cells. It binds to double starnded DNA irrespective of wether the cell is dead or alive. |
| Matrigel | Corning | Basement membrane matrix | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used as a supplement to increase the cell growth and viability. |
| Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Penicillin and streptomycin is used to prevent the bacterial contamination in culture. |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170 | Fluorescent dye which is only permeable to dead cells. It binds with DNA and helps in distinguishing between live and dead cells. |
| TryplE Express | Thermo Fisher Scientific | Gentle cell dissociation agent | |
| ZOE Fluorescent Cell Imager | Bio-rad |
References
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