Summary
血脑屏障完整性对神经系统功能至关重要。在果蝇黑色素仪中，血脑屏障是由胚胎发育晚期的胶质细胞形成的。该协议描述了在D.melanogaster胚胎和第三星幼虫中进行血脑屏障形成和维护的测定方法。
Abstract
适当的神经系统发展包括形成血脑屏障，扩散屏障，严格调节进入神经系统，保护神经组织免受毒素和病原体的侵害。这种屏障形成的缺陷与神经病变有关，在许多神经退行性疾病中观察到这种屏障的分解。因此，确定调节血脑屏障形成和维护的基因以确定潜在的治疗目标至关重要。为了了解这些基因在神经发育中的确切作用，有必要分析改变的基因表达对血脑屏障完整性的影响。许多在建立血脑屏障中发挥作用的分子被发现被保存在真核物种，包括果蝇，果蝇，果蝇黑色素。果蝇已被证明是一个优秀的模型系统，用于检查调节神经系统发育和功能的分子机制。该协议描述了在D.黑色素气症发育的胚胎和幼虫阶段，用于血液脑屏障完整性的分步测定程序。
Introduction
在发育过程中，细胞-细胞的通信和相互作用对组织和器官结构和功能的建立至关重要。在某些情况下，这些细胞-细胞相互作用密封器官从周围环境，以确保适当的器官功能。神经系统就是这种情况，神经系统被血脑屏障（BBB）绝缘。人体BBB功能障碍与包括癫痫在内的神经系统疾病有关，在神经退行性疾病（包括多发性硬化症和肌萎缩性侧索硬化症1）中观察到屏障的分解。在哺乳动物中，BBB是由内皮细胞2、3之间的紧密结形成。其他动物，包括果蝇，果蝇黑色素，有一个由胶质细胞组成的BBB。这些胶质细胞形成选择性渗透屏障，控制营养物质、废物、毒素和大分子进入和流出神经系统的运动4。这允许保持发射作用电位所需的电化学梯度，允许移动和协调4。在D.melanogaster中，胶质保护神经系统免受富含钾的、血样淋巴5的淋巴。
在D.melanogaster的中枢神经系统（CNS）和周围神经系统（PNS）中，两个外层胶质层、下眼胶质和眼质胶质，以及细胞外基质的外网络，神经层状，形成淋巴脑和淋巴神经屏障6，在本文中称为BBB。在发育过程中，亚倍体成为多倍体并扩大以包围神经系统5，6，7，8，9，10，11.亚苯并流感形成分离结，提供淋巴和神经系统5、6、12之间的主要扩散屏障。这些结在分子上类似于脊椎动物在骨髓胶质的副节点处发现的类似分离的结，它们的作用与哺乳动物13、14的BBB中的紧密结相同。15,16,17.环状胶质分裂、生长和包裹在亚佩里尼胶质周围，以调节代谢物和大分子6、10、18、19的扩散。BBB形成在25°C5，8下产卵（AEL）后18.5小时完成。先前的研究已经确定了BBB形成的关键调控基因20，21，22。为了更好地了解这些基因的确切作用，必须研究这些潜在调控器突变对BBB完整性的影响。虽然以前的研究已经概述了在胚胎和幼虫中测定BBB完整性的方法，但是这个测定的综合方案还没有被描述5，7。此分步协议描述了在D.黑色素气芽期和第三星幼虫阶段对BBB完整性进行诊断的方法。
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Protocol
1. 样品收集
- 胚胎收集
- 在每个胚胎收集笼中，使用至少50名处女和20-25名男性进行采集。在开始收集23之前，用玉米粉-琼脂食品（材料表）在瓶子里孵育这些苍蝇1⁄2天。
注：可以使用更多的苍蝇，但雌性与雄性的比例应保持在2：1。 - 预加热苹果汁琼脂板 （表 1） 在 25 °C 过夜.
注：这是适当分期胚胎所必需的。如果盘子迅速干燥，在培养箱中加一个带水的碗，以增加腔室的湿度。 - 使用 CO2从步骤 1.1.1 对苍蝇进行麻醉，并将苍蝇转移到收集笼。将预加热的苹果汁琼脂盘与酵母膏小涂抹在开放端，用红色袖子固定在笼子上（材料表）。为了清除较老的胚胎，允许苍蝇在25°C下在苹果汁琼脂板上产卵1小时。
- 从培养箱中取出收集保持架。向下反转保持架网格侧，然后点击飞至笼子底部。用一小块酵母膏代替苹果汁琼脂，换上新的预加热苹果汁琼脂板。丢弃第一个板。
- 允许苍蝇在新的苹果汁琼脂盘上产卵1小时，在25°C下。在收集1小时后丢弃这个板，然后继续下一步收集胚胎进行注射。
- 为了收集晚期17个胚胎（20~21 h AEL），允许步骤1.1~1.1.5中所需基因型的苍蝇躺在新的预加热苹果汁琼脂板上，在25°C下涂上少量酵母膏，在25°C培养箱中19小时老化板19小时，所以胚胎在成像时的年龄为20-21小时。
注：对于多轮样品收集、注射和成像，可以根据需要重复此步骤。 - 通过添加含有0.1%非离子表面活性剂（PBTx）的磷酸盐缓冲盐水（PBS），将胚胎从板中收集到具有70μm尼龙网的细胞滤网中。表 1）覆盖板的表面，并用画笔从表面松开胚胎。
- 在细胞滤网中收集的Dechorionate胚胎在50%漂白溶液中（表1）在100毫米培养皿中5分钟，在室温下偶尔搅拌。在培养皿中旋转 PBTx 中的细胞滤网，每次使用一道新鲜的 PBTx，将胚胎冲洗 3 倍。
- 如果所有胚胎都是正确的基因型，则直接执行步骤 1.1.10。如果生成正确基因型的胚胎需要与杂合体苍蝇交叉，则使用是否存在荧光标记平衡染色体来选择正确基因型的胚胎。使用具有荧光功能的立体显微镜进行基因型选择。
注：标有变形-黄色荧光蛋白的平衡染色体;克鲁佩尔-加尔4，UAS绿色荧光蛋白（GFP）;和扭-Gal4，UAS-GFP在晚期胚胎生成的基因型选择（表2）24，25，26中工作良好。 - 使用玻璃移液器，将PBTx中的胚胎转移到2%的甘蔗凝胶板（表1）。用滤纸去除多余的液体。将 +6⁄8 胚胎对齐到 2% 的甘蔗胶板上，后侧朝右和背侧朝上（图 1B）。
注：微皮，精子进入卵子的小孔，位于胚胎的前端。后端更圆。气管呈白色，位于胚胎的背侧，允许区分胚胎的背和腹侧（图1B）。 - 用一块双面胶带准备幻灯片。用力按压胚胎顶部的滑块，将其转移到双面胶带上。
- 通过在室温下孵育25分钟（不使用干燥剂）使胚胎脱除。干燥后，用卤化碳油覆盖胚胎。
注：干燥期可能因室内温度、湿度和通风而异。培养期应用于设置注射装置和成像共聚焦显微镜，如本议定书第2节和第3节所述。
- 在每个胚胎收集笼中，使用至少50名处女和20-25名男性进行采集。在开始收集23之前，用玉米粉-琼脂食品（材料表）在瓶子里孵育这些苍蝇1⁄2天。
- 拉瓦尔收藏
- 建立一个十字架与5+10处女雌苍蝇所需的基因型和一半的男性所需的基因型在小瓶与玉米粉-琼脂食物，并在25°C23孵育。
- 5~7天后，根据基因型，用钳子从小瓶中轻轻收集游荡的第三星幼虫。在 1x PBS 中冲洗幼虫，以去除粘在幼虫上的食物。将幼虫转移到苹果汁琼脂板，以便进行基因分型，如步骤1.1.9中所述（如有必要）。
- 用画笔将幼虫卷在纸巾上，将其干燥。将 6⁄8 幼虫转移到使用钳子用双面胶带准备的幻灯片上。
2. 针头和标本注射的制备
- 在启动此协议之前，在微移液器拉拔器上拉针。根据标准针的形状和D.melanogaster注射参数将毛细管固定到针拉器中并拉拔（表3）27。将针头固定在粘土中，直到用于注射，将针头存放在培养皿中。
- 在胚胎的25分钟干燥期间（步骤1.1.12）或转移后立即使用20μL凝胶加载移液器尖端，将5 μL的10 kDa dextran结合到磺胺101氯化酸（材料表）的针头中装入幼虫到幻灯片（步骤 1.2.3）。
- 将针头装入针架，并置于固定在钢基上的微操作器（材料表）中。
注：针应几乎平行于胚胎注射的显微镜阶段，幼虫注射应稍微向下倾斜。 - 将注射装置（材料表）设置为50 psi，5⁄10 ms，范围为 10。
注：对于所使用的特定注射装置，可能需要更改这些设置。 - 将滑轨放在舞台上，以 45° 角将针的指针边缘刷到双面胶带的边缘，以创建一个倾斜的、破碎的尖端。
注：对于胚胎，只需要打破尖端足以允许10 kDa dextran的流动。完美的针头有一个略角的尖端，每次注射时只有一小滴染料。对于幼虫，有必要打破尖端更多，但与角尖渗透幼虫身体壁。一滴更大的染料会出来。 - 泵脚踏板，直到染料位于针尖。
- 将针头对齐，使其与胚胎平行或向幼虫稍微向下倾斜。
- 移动针头刺穿试样后端，然后通过泵送脚踏板注射试样。将±2 nL的染料注入胚胎，向幼虫注射220 nL的染料。
注：如果注射成功，胚胎或幼虫应大量使用染料。 - 注意为孵育目的注射的时间。在室温下孵育胚胎10分钟。在室温下孵育幼虫30分钟。
- 继续沿着幻灯片注入其他试样，注意每个试样的注射时间。
注：根据后续解剖和成像步骤的速度，一次可注射 4~8 个试样。
3. 成像样品的制备
-
胚胎成像
- 注射后，准备胚胎进行成像。在滑轨的左右两侧涂抹带有棉布施用器的石油果冻作为垫片，以防止在放置盖玻片时损坏胚胎。
- 在胚胎深度使用共聚焦显微镜，具有20倍物镜的图像样本。使用以下公式计算在腹腔神经线 （VNC） 中观察到的染料总样本的百分比：BBB受损的样本百分比 = VNC 中染料累积的样本数/检测样本总数。
-
幼虫的解剖和成像
- 提前准备幼虫样本的幻灯片。安装两个盖玻片，间隔约0.5厘米的幻灯片与指甲油。
注：盖玻片作为大脑的垫片，因此在安装过程中不会损坏。 - 在30分钟的孵育之后，直接在用于成像的幻灯片上解剖1x PBS中的幼虫。首先，使用一对钳子抓住幼虫的中途，并使用第二对钳子分离幼虫的前半部分和后半部分。
- 接下来，使用一对钳子抓住嘴钩的前部区域，并使用第二对钳子将身体壁倒置到抓住嘴钩的钳尖上。大脑和VNC将暴露。
- 通过切断神经将大脑和VNC从身体壁中分离出来，并从幻灯片上去除身体壁（图1C，D）。如果需要，取出想象光盘。
- 用 10 μL 的 80% 甘油覆盖样品，并在样品顶部放置一个盖玻片进行成像。
- 使用 20x 目标通过神经系统组织的深度进行图像。计算在 VNC 中观察到的染料的总样本的百分比。
- 提前准备幼虫样本的幻灯片。安装两个盖玻片，间隔约0.5厘米的幻灯片与指甲油。
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Representative Results
此处描述的方法允许在D.黑色素气素胚胎和幼虫中在整个CNS中实现BBB完整性的可视化（图1）。在胚胎发育晚期完成BBB形成后，BBB功能从大脑中排除大分子和VNC5。该协议利用此功能来测定BBB的形成。当野生型（俄勒冈R）后期17（20⁄21 h老）胚胎被注射10kDa dextran结合成磺胺101氯化氯化荧光染料时，大dextran分子被排除在VNC中，如预期（图2A）。为了证明基因突变对BBB完整性的影响，利用了原始基因突变的胚胎。此前，该原始基因已被证明在胚胎生成过程中调节生殖带回缩，最近还被证明在胶质中起作用，以调节发育过程中VNC的形态变化。异体原1突变胚胎表现出完整的BBB，类似于在野生型对照胚胎中观察到的结果（图2B）。相比之下，同源原1突变胚胎表现出BBB完整性的缺陷，10 kDa dextran染料涌入VNC，表明BBB未能形成（图2C）。这些结果证明了该技术在胚胎阶段检测BBB形成的能力。
先前的研究表明，在亚皮内胶质多倍体化的缺陷导致BBB的中断，可以观察到在第三星幼虫阶段7，9。因此，BBB 形成和/或维护的缺陷可能导致 BBB 在后期开发阶段受损，因此在第三个星幼虫阶段对屏障的完整性进行测定是可取的。因此，用于在胚胎阶段对BBB完整性进行分析的协议也进行了优化，用于幼虫。在俄勒冈州R控制样本中，10 kDa dextran无法穿透BBB，并且被排除在大脑和VNC之外（图2D，E）。染料在BBB外围积聚。
图1：阶段17胚胎和第三星幼虫的神经系统。（A） 阶段 17 胚胎中枢神经系统 （CNS） 的心室视图图。CNS由大脑（Br）和腹腔神经线（VNC）组成，后者具有多孔氏通道（ch）。前端的微尖（mp;箭头）可用于定向胚胎。右边的后。（B） 步骤1.1.10中建议，第17阶段胚胎以背侧朝上和后方朝右。箭指向气管。箭头表示 mp。右边的后。（C） 第三星幼虫的神经系统图解.大脑 （Br） 和 VNC 组成 CNS，而从 VNC 突触延伸到身体壁肌肉的神经是 PNS 的一部分。右边的后。（D） 解剖第三星幼虫脑和VNC.右边的后。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：血脑屏障（BBB）形成测定。（A-C）晚期17胚胎（20⁄21小时）后注入10kDa磺胺101酸氯化物。后往下。刻度条 = 20 μm。在控制中看到的点是跨越腹腔神经线 （VNC） 的多索孔拉通道。（A） 俄勒冈州 R 控制.染料在6.25%的样品中接受，n = 16。（B）原始1/+同级控制。染料在6.67%的样品中接受，n = 15。（C） 同源原1/1突变。 染料在100%的样品中接受，n = 22。（D） 俄勒冈R控制第三星幼虫脑.染料在BBB处积累，但不渗透到CNS，n = 7。刻度条 = 50 μm。（E） 俄勒冈州 R 控制第三星幼虫 VNC.染料在BBB处积累，但不渗透到CNS，n = 11。虚线勾勒出 VNC。刻度条 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：胚胎发育晚期的中古形态学。第13-17阶段胚胎的透射光图像允许肠道形态的可视化（胚胎后半部分的深灰色区域）。中古形态可用于确定胚胎发育阶段，这有助于确定胚胎是否适合注射老化。刻度条 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
| 解决 方案 | 食谱 |
| 2% 阿加玫瑰凝胶 | 在Erlenmeyer烧瓶和微波炉中加入0.8克琼脂醇至40mL的双蒸馏H2O（ddH2O）中溶解琼脂。倒入凝胶铸造托盘，让凝胶在室温下凝固30分钟。 |
| 苹果果汁琼脂板 | 将 45 克琼脂和 1.5 升 ddH2O 测量到 4 L 烧瓶中。高压灭菌器在121°C下工作40-45分钟。将 50 克糖和 0.5 升苹果汁放入 1 L 烧杯中，在低热（设置 3）上搅拌以溶解糖，注意不要燃烧。在高压灭菌后，将预热的糖和苹果汁加入琼脂和水。在关闭热量后低搅拌，以便冷却，直到您可以触摸它。加入15 mL的70%的三分，搅拌以分散。倒入 0.5 L 烧杯。用乙醇喷洒，用Bunsen燃烧器去除气泡或火焰。倒入 60 mm 培养皿中。允许设置至少 24 小时，或直到培养皿盖上有最小冷凝，并储存在 4°C。 |
| 50% 漂白剂 | 将 15 mL 的 ddH2O 和 15 mL 家用漂白剂加入锥形管中。 |
| 80% 甘油 | 对于 10 mL，在 15 mL 锥形管中加入 8 mL 的高压 ddH2O 和 2 mL 甘油。在摇杆上孵育，直到溶液均匀。 |
| 1x PBS | 对于 1 L，在 900 mL 的 ddH2O 中稀释 100 mL 的 10x PBS。 |
| 10x PBS | 对于 2 L，在 1，600 mL ddH2O： 160 g NaCl、 4 g KCl、28.8 g Na2HPO4和 4.8 g KH2PO4中溶解以下。使用 HCl 将 pHH 调整为 7.5。 |
| PBTx（PBS = 0.1% 非离子表面活性剂） | 对于 1 L，结合 100 mL 的 10x PBS、10 mL 的 10% 非离子表面活性剂和 890 mL 的 ddH2O。 |
| 70% 特戈塞普 | 每10mL100%乙醇混合1克p-羟基苯甲酸、甲基酯。储存在-20°C。 |
| 10% 非离子表面活性剂 | 对于 50 mL，将 45 mL 的灭武 ddH2O 和 5 mL 的非离子表面活性剂添加到圆锥管中。在摇臂上旋转，直到溶液均匀。 |
| 酵母膏 | 在 50 mL 塑料烧杯中将干活性酵母与 ddH2O 混合，直到光滑。 |
表1：在整个协议中使用的试剂和缓冲器。
| 基因 | 股票 |
| w[1118];ln（2LR）格拉，wg_Gla-1\/CyO，P_w_mC_GAL4-twi.G_2.2，P_w_mC__UAS-2xEGFP_AH2.2 | 布卢明顿#6662 |
| w_;斯纳[斯科]/CyO，P_w_mC_Dfd-EYFP_2 | 布卢明顿#8578 |
| w_;L[2] 引脚[1]/CyO，P_w_mC_GAL4-Kr.C_DC3，P_w_mC_UAS_GFP。S65T_DC7 | 布卢明顿#5194 |
| Df（1）JA27/FM7c，P_w_mC_GAL4-Kr.C_DC1，P_w_mC_UAS-GFP。S65T_DC5， sn_ | 布卢明顿#5193 |
| w_;ry[506] 博士[1]/TM6B， P_w_mc_dfd-EYFP_3， Sb[1] Tb_1_ ca{1} | 布卢明顿#8704 |
| y{1} w__;D= gl_3_/TM3，P_w_mC_GAL4-Kr.C_DC2，P_w_mC_UAS-GFP。S65T_DC10， Sb[1] | 布卢明顿#5195 |
| 俄勒冈州 R | 提供多种菌株 |
| 原始 [1] cn{1} bw {1} sp{1}/CyO | 布卢明顿#2749 |
| P_w_mW.hs_GawB_elav_C155] | 布卢明顿#458 |
| w[1118];P_w_m_GAL4_repo/TM3， Sb[1] | 布卢明顿#7415 |
| P_UAS-GFP} | 提供多种菌株 |
表2：飞行菌株。在整个协议中讨论的苍蝇菌株。在适用的情况下提供布卢明顿果蝇中心股票编号。
| 周期 | 热 | 拉 | 速度 | 时间 | 压力 | 斜坡 |
| 1 | 590 | 115 | 15 | 250 | 600 | Ⅹ |
| 2 | 575 | 130 | 60 | 250 | 600 | Ⅹ |
表3：微移液器拉拔器设置。用于生成此协议中用于注射的针头的微移液器拉拔器设置。
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Discussion
该协议全面描述了在D.melanogaster发育的晚期和第三星幼虫阶段，分析BBB完整性所需的步骤。其他地方也曾描述过类似的方法，以在发展期间以及成人阶段5、7、29、30中，分析BBB的完整性。但是，材料和方法部分中对程序的描述通常很广泛，缺乏足够的细节，便于实施，因此需要代表研究人员进行重要的故障排除。该协议全面描述了在胚胎和幼虫阶段分析BBB完整性所需的步骤。在每个阶段，需要遵循一些关键步骤，以确保检查正确的发育阶段，并且组织架构不会中断，这可能会危及 BBB。为了在这些方法中取得成功，有必要对协议的多个步骤进行故障排除，以便产生准确的结果。胚胎和幼虫协议中的关键步骤如下所述。
先前的研究曾报道，BBB的建立在18.5 h AEL5。为了确保准确的发育时间，在老化期间将样品保持在恒定温度非常重要。采集胚胎时，苹果汁琼脂板在采集前应带至25°C。使用未预加热的苹果汁板会导致发育缓慢，并会产生尚未建立BBB的样品，因此在神经系统中表现出10 kDa dextran的积累。因此，重要的是要确保注射的样本超过18.5小时。 此外，在胚胎中进行这些实验时，有必要考虑发育迟缓的可能性，因为这种延迟可能只是导致BBB的后期成立。为了解释任何潜在的发育延迟，样品在20~21 h AEL处进行检测，略低于报告BBB的形成。使用其他组织的形态，特别是发育中的中肠，可以帮助确定被测定的胚胎的正确发育阶段（图3）。相反，不适当的实验时间可能导致样品已经活动，并开始孵化过程。为了减少已经开始孵化的幼虫数量，在收集胚胎进行注射之前，至少进行两次1小时采集，以清除雌性胚胎。如果需要对第一星幼虫的BBB进行分析，在冰上的9孔盘中，在1x PBS中短暂孵育幼虫，可用于降低注射前的活力。在注射过程中，滑动也可以保存在冰袋上，以减少运动性。
为了确保在胚胎中建立BBB的高质量图像和准确结果，在整个过程中必须小心遵循其他步骤。当在琼脂板上排列胚胎时，气管应该朝上，因为这是胚胎的背侧（图1B）。当胚胎用双面胶带转移到幻灯片时，胚胎的腹腔侧将朝上，从而在协议后期的共聚焦成像期间实现神经线的最佳可视化。胚胎还必须牢固地粘附在双面胶带上，以抑制注射过程中的移动。使用扁平的 2% agarose 垫，研究人员可以在移植过程中用双面胶带将滑轨牢固地推到胚胎上，而不会损坏胚胎。移植到幻灯片后，干燥是必要的，以防止胚胎在染料注射时破裂。注射过多的染料也会导致胚胎破裂。重要的是，只有将针头插入胚胎，足以注入染料，但不要太多，针可能刺穿神经系统，这将给出一个假阳性的结果。太大的穿刺伤口也会导致淋巴和染料从胚胎中流出，导致实验失败。考虑到这些潜在的陷阱，注射是最成功的，与尖端有轻微角度的针头，这样有一个小点，仔细刺穿胚胎。
在检测幼虫以实现BBB完整性的情况下，由于样品的动能，可能会出现挑战。使用高质量的双面胶带至关重要，因为它应该能有效地固定幼虫注射。如果幼虫确实变得不粘，它可以回滚在磁带上，轻轻推下来，以重新固定它。当运输幼虫注射时，在培养皿中携带滑轨是有帮助的，以防幼虫变得不粘。注射后的步骤需要最小心，以避免BBB中断。为了尽量减少对样品的潜在损坏，最简单的方法是直接在用于成像的幻灯片上解剖样品。如果在转移样品进行解剖时，幼虫牢固地粘附在胶带上，则可以向胶带中添加 1x PBS 的一滴，以松开粘附，并允许转移到幻灯片进行解剖。解剖后，必须充分拼合样本以避免误报结果，但不要过多地损害样本完整性。使用额外的盖玻片在盖玻片和滑轨之间夹住幼虫，因为垫片可防止大脑受损，但会固定样本以进行有效的成像。
为了成功使用胚胎和幼虫的协议，在样品处理开始之前确保注射装置和共聚焦显微镜的建立至关重要。这允许在样品成像中精确计时，这是样品比较所必需的。其他方法也采用了更先进的注射设置，需要为胚胎注射设置倒置显微镜。该协议采用标准解剖显微镜和带压力调节器的微操作器。在这种情况下，斑马鱼注射设置只是适应注射苍蝇胚胎和幼虫。该协议可以进一步简化，以利用带有注射器的显微操作器进行注射。其中许多工具在生物系中随处可见，甚至可能在教室实验室环境中提供，从而最大限度地简化协议实施。
在成像过程中，标记神经系统的细胞以更容易地识别成像所需的区域会很有帮助。具体来说，可以使用GAL4/UAS系统在神经元或胶质体中表达GFP，分别使用elav-Gal4或repo-Gal4菌株（表2）31、32、33。这种标签将提供与磺胺101酸氯化物的对比，以可视化神经系统的完整性。
虽然这种方法的重点是在D.melanogaster开发过程中检测BBB的完整性，但这种方法可以加以调整，以检查各种生物体和组织的其他屏障的完整性。例如，类似的协议已经发布，用于在小鼠34中对BBB进行分制药。此外，在D.melanogaster的精子发生过程中，血眼屏障的渗透性和生殖细胞周围的体质屏障也采用了类似的方法29，35。该协议也可以适应在其他组织中，以测试渗透性，包括肠道。当调整该协议用于其他组织或物种时，有必要考虑可以穿透屏障的分子的大小，因为10 kDa dextran可能足够小，可以穿透某些屏障。总体而言，该协议提供了一个分步过程，用于在D.melanogaster开发期间对BBB完整性进行分步分析，该过程可轻松适应其他设置。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢F·布赖恩·皮克特博士和罗德尼·戴尔博士使用注射设备。这项工作由芝加哥洛约拉大学向法学博士学位、D.T.和J.J.的研究资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran | ThermoFisher Scientific | D1863 | Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL. |
| 20 μL Gel-Loading Pipette Tips | Eppendorf | 22351656 | |
| 100% Ethanol (200 proof) | Pharmco-Aaper | 11000200 | |
| Active Dry Yeast | Red Star | ||
| Agar | Fisher Scientific | BP1423 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Air Compressor | DeWalt | D55140 | |
| Apple Juice | Mott's Natural Apple Juice | ||
| Bleach | Household Bleach | 1-5% Hypochlorite | |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Bottle Plugs | Fisher Scientific | AS-277 | |
| Cell Strainers | BD Falcon | 352350 | |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75) |
| Cotton-Tipped Applicator | Puritan | 19-062614 | |
| Double-Sided Tape 1/2" | Scotch | ||
| Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip | Roboz | RS-5015 | |
| Fly Food Bottles | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Food Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Foot Pedal | Treadlite II | T-91-S | |
| Gel Caster | Bio-Rad | 1704422 | |
| Gel Tray | Bio-Rad | 1704436 | |
| Glass Pipette | VWR | 14673-010 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Granulated sugar | Purchased from grocery store. | ||
| Halocarbon Oil | Lab Scientific, Inc. | FLY-7000 | |
| Light Source | Schott | Ace I | |
| Manipulator Stand | World Precision Instruments | M10 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-R | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | MPH310 | |
| Nightsea Filter Sets | Electron Microscopy Science | SFA-LFS-CY | For visualization of YFP |
| Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head | Electron Microscopy Science | SFA-RB | For visualization of GFP |
| Paintbrush | Simply Simmons | Chisel Blender #6 | |
| Pipetter | Fisher Scientific | 13-683C | |
| Pneumatic Pump | World Precision Instruments | PV830 | This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative. |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Small Embryo Collection Cages | Genesee Scientific | 59-100 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Steel Base Plate | World Precision Instruments | 5052 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | Used for tissue dissection. |
| Stereomicroscope with transmitted light source | Baytronix | Used for injection. | |
| Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | Nonionic surfactant |
| Vial Plugs | Fisher Scientific | AS-273 |
References
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