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Developmental Biology

Drosophila melanogaster में रक्त मस्तिष्क बैरियर अखंडता के लिए परख

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60233
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Loyola University Chicago

Summary

रक्त मस्तिष्क बाधा अखंडता तंत्रिका तंत्र समारोह के लिए महत्वपूर्ण है. Drosophila मेलेनोगैस्टरमें, रक्त मस्तिष्क बाधा देर भ्रूणजनन के दौरान glial कोशिकाओं द्वारा बनाई गई है। इस प्रोटोकॉल डी मेलेनोगैस्टर भ्रूण और तीसरे instar लार्वा में रक्त मस्तिष्क बाधा गठन और रखरखाव के लिए परख के लिए तरीकों का वर्णन करता है।

Abstract

उचित तंत्रिका तंत्र के विकास में रक्त मस्तिष्क बाधा का गठन, प्रसार बाधा शामिल है जो तंत्रिका तंत्र तक पहुंच को कसकर नियंत्रित करता है और विषाक्त पदार्थों और रोगजनकों से तंत्रिका ऊतक की रक्षा करता है। इस बाधा के गठन में दोष neuropathies के साथ सहसंबद्ध किया गया है, और इस बाधा के टूटने कई neurodegenerative रोगों में देखा गया है. इसलिए, संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए रक्त-मस्तिष्क बाधा के गठन और रखरखाव को विनियमित करने वाले जीनों की पहचान करना महत्वपूर्ण है। आदेश में सटीक भूमिकाओं को समझने के लिए इन जीन तंत्रिका विकास में खेलते हैं, यह रक्त मस्तिष्क बाधा की अखंडता पर बदल जीन अभिव्यक्ति के प्रभाव परख करने के लिए आवश्यक है. रक्त मस्तिष्क बाधा की स्थापना में कार्य करने वाले कई अणुओं को यूकैरियोटिक प्रजातियों में संरक्षित पाया गया है, जिसमें फल मक्खी, ड्रोसोफिला मेलेनोगैस्टरशामिल हैं। फल मक्खियों तंत्रिका तंत्र के विकास और समारोह को विनियमित आणविक तंत्र की जांच के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली साबित हो गया है. इस प्रोटोकॉल डी मेलेनोगैस्टर विकास के भ्रूण और लार्वा चरणों के दौरान रक्त मस्तिष्क बाधा अखंडता के लिए परख के लिए एक कदम दर कदम प्रक्रिया का वर्णन करता है।

Introduction

विकास के दौरान, सेल सेल संचार और बातचीत ऊतक और अंग संरचना और समारोह की स्थापना के लिए महत्वपूर्ण हैं. कुछ मामलों में, इन सेल सेल बातचीत उचित अंग समारोह सुनिश्चित करने के लिए आसपास के वातावरण से अंगों को बंद कर देते हैं। यह तंत्रिका तंत्र के लिए मामला है, जो रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबी) द्वारा अछूता है। मनुष्यों में BBB के रोग मिर्गी सहित तंत्रिका संबंधी विकारों से जोड़ा गया है, और बाधा के टूटने एकाधिक काठिन्य और amyotrophic पार्श्व काठिन्य1सहित neurodegenerative रोगों में मनाया गया है. स्तनधारियों में बीबीबी एंडोथेलियल कोशिकाओं 2,3 के बीच तंग जंक्शनों द्वारा बनाई जातीहै। फल मक्खी, Drosophila मेलेनोगैस्टर सहित अन्य जानवरों, एक BBB glial कोशिकाओं से बना है. ये ग्लिल कोशिकाएं पोषक तत्वों, अपशिष्ट उत्पादों, विषाक्त पदार्थों, और तंत्रिका तंत्र4में और बाहर बड़े अणुओं की आवाजाही को नियंत्रित करने के लिए एक चुनिंदा पारगम्य बाधा बनाती हैं। यह कार्रवाई क्षमता आग करने के लिए आवश्यक विद्युत रासायनिक ढाल के रखरखाव के लिए अनुमति देता है, गतिशीलता और समन्वय के लिए अनुमति देताहै 4. डी मेलेनोगैस्टरमें, ग्लिया पोटेशियम समृद्ध, रक्त की तरह हीमोलिम्फ 5 से तंत्रिका तंत्र की रक्षा करताहै।

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) और परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएनएस) में डी मेलेनोगैस्टर,दो बाहरी ग्लिल परतें, सबपेरिन्यूरियल ग्लिया और पेरिन्यूरियल ग्लिया, साथ ही अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स का बाहरी नेटवर्क, तंत्रिका पटलिका, फार्म हेमोलिम्फ मस्तिष्क और हेमोलिम्फ-नर्व बाधा6, इस लेख में BBB के रूप में संदर्भित. विकास के दौरान उपप्रगुणी ग्लिया बहुगुणित हो जाते हैं और तंत्रिका तंत्र को चारों ओर से घेर ने बढ़ा देते हैं5,6,7,8,9,10,11 . उपपरिप्रज्ञ ााली सेपट संधि है, जो हीमोलिम्फ तथा तंत्रिका तंत्र5,6,12के बीच मुख्य विसरण अवरोध प्रदान करता है. ये संधिएँ कशेरुकियों में मायलिनिंग ग्लिया के पैरानोडों में पाए जाने वाले पट-जैसे संधिओं के समान होती हैं, और वे स्तनधारियों के बीबी बी बी में तंग जंक्शनों के समान ही कार्य करते हैं13,14, 15 , 16 , 17. उप-पर्युदर्या के चारों ओर उप-पर्युदर्या के चारों ओर का विभाजन, वृद्धि और लपेटकर चयापचयों और बडेय अणुओं के प्रसार को विनियमित करने के लिए6,10,18,19. बीबीबी का निर्माण अंडे देने के 18.5 ज के बाद 25 डिग्री सेल्सियस5,8में पूरा हो जाता है । पिछले अध्ययनों में ऐसे जीनों की पहचान की गई है जो बीबीबी निर्माण20,21,22के महत्वपूर्ण विनियामक हैं . बेहतर इन जीनों की सटीक भूमिकाओं को समझने के लिए, यह BBB अखंडता पर इन संभावित नियामकों के उत्परिवर्तन के प्रभाव की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि पिछले अध्ययनों में भ्रूण और लार्वा में बीबीबी अखंडता को शामिल करने के दृष्टिकोण ों की रूपरेखा दी गई है , लेकिन इस परख के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल अभी तक5,7बताया गया है . यह चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल D. मेलेनोगैस्टर भ्रूणीय और तीसरे इनस्टार लार्वा चरणों के दौरान BBB अखंडता पर ाााालाएँ.

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Protocol

1. नमूनों का संग्रह

  1. भ्रूण संग्रह
    1. प्रत्येक भ्रूण संग्रह पिंजरे में, संग्रह के लिए 20 डिग्री 25 पुरुषों के साथ 50 कुंवारी महिलाओं की एक न्यूनतम का उपयोग करें. इन मक्खियों को एक बोतल में कॉर्नमील-आगर खाद्य (सामग्री की तालिका) के साथ एक बोतल में 1 डिग्री 2 दिनों के लिए संग्रह शुरू करने से पहले23.
      नोट: अधिक मक्खियों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन महिला-से-पुरुष अनुपात 2:1 पर रखा जाना चाहिए।
    2. पूर्व गर्म सेब का रस आगर प्लेटें (तालिका 1) रात भर 25 डिग्री सेल्सियस पर।
      नोट: यह भ्रूण के उचित मंचन के लिए आवश्यक है। यदि प्लेटें जल्दी से सूख रही हैं, तो कक्ष की आर्द्रता बढ़ाने के लिए इनक्यूबेटर में पानी के साथ एक कटोरा जोड़ें।
    3. सीओ2 के साथ कदम 1.1.1 से मक्खियों Anesthetize और एक संग्रह पिंजरे में मक्खियों हस्तांतरण। खुले छोर पर खमीर पेस्ट का एक छोटा सा धब्बा के साथ एक पूर्व गर्म सेब का रस agar प्लेट प्लेस और लाल आस्तीन के साथ पिंजरे के लिए सुरक्षित (सामग्री की तालिका). पुराने भ्रूणों को साफ करने के लिए, मक्खियों को सेब के रस की आगर प्लेट पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए भ्रूण/eggs रखने की अनुमति दें।
    4. इनक्यूबेटर से संग्रह पिंजरे निकालें। पिंजरे जाल पक्ष नीचे उलटा और पिंजरे के नीचे करने के लिए नीचे मक्खियों नल। सेब का रस एक नया पूर्व गर्म सेब का रस आगर प्लेट खमीर पेस्ट का एक छोटा सा धब्बा के साथ के साथ बदलें। पहली प्लेट को छोड़ दें।
    5. मक्खियों को 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए नए सेब के रस आगर प्लेट पर भ्रूण/eggs बिछाने की अनुमति दें। 1 ज संग्रह के बाद इस प्लेट को छोड़ दें और इंजेक्शन के लिए भ्रूण इकट्ठा करने के लिए अगले चरण पर जाएं।
    6. देर से चरण 17 भ्रूण (20 डिग्री 21 एच AEL) इकट्ठा करने के लिए, कदम से वांछित जीनोटाइप की मक्खियों की अनुमति 1.1.1$1.5 एक नया पूर्व गर्म सेब का रस agar प्लेटों पर खमीर पेस्ट का एक छोटा सा धब्बा के साथ पर रखना करने के लिए 25 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 एच के लिए आयु प्लेट एक 25 डिग्री इनक्यूबेटर में 19 एच के लिए आयु प्लेट , तो भ्रूण इमेजिंग के समय की उम्र के 20 डिग्री 21 एच हो जाएगा.
      नोट: यह कदम नमूना संग्रह, इंजेक्शन, और इमेजिंग के कई दौर के लिए वांछित के रूप में दोहराया जा सकता है.
    7. प्लेटों से भ्रूण ों को एक सेल छलनी में ले लीजिए 70 डिग्री m नायलॉन जाल के साथ फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) को 0.1% nonionic surfactant (PBTx) के साथ जोड़कर; तालिका 1) प्लेट की सतह को कवर करने और एक तूलिका का उपयोग कर सतह से भ्रूण ढीला करने के लिए।
    8. कक्ष के ताप पर कभी-कभी आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए 100 मिमी पेट्री डिश में 50% ब्लीच घोलमेंसेल छलनी में एकत्र किए गए भ्रूणों को डिकोरियोनेट करें . एक पेट्री डिश में PBTx में सेल छलनी घूमता द्वारा कुल्ला भ्रूण 3x, PBTx के एक ताजा पकवान का उपयोग कर हर बार.
    9. यदि सभी भ्रूण सही जीनोटाइप के हैं, तो सीधे 1.1.10 कदम पर आगे बढ़ें। यदि सही जीनोटाइप के भ्रूणों की पीढ़ी को विषमयुग्मज मक्खियों के साथ एक क्रॉस की आवश्यकता होती है, तो फ्लोरोसेंट रूप से चिह्नित बैलेंसर गुणसूत्रों की उपस्थिति या अनुपस्थिति का उपयोग करके सही जीनोटाइप के भ्रूणों का चयन करें। जीनोटाइप चयन के लिए फ्लोरोसेंट क्षमताओं के साथ एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का प्रयोग करें।
      नोट: विकृत-पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ चिह्नित बैलेंसर गुणसूत्र; Kruppel-Gal4, UAS-हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP); और मोड़-Gal4 , UAS-GFP देर भ्रूणजनन में जीनोटाइप चयन के लिए अच्छी तरह से काम (तालिका 2)24,25,26.
    10. एक गिलास पिपेट का उपयोग करके, PBTx में भ्रूण को 2% अगारोस जेल स्लैब में स्थानांतरित करें (सारणी 1)। फिल्टर पेपर के साथ अतिरिक्त तरल निकालें। [6]8 भ्रूणों को 2% अगारोस जेल स्लैब पर दाईं ओर पीछे और पृष्ठीय पक्ष के साथ संरेखित करें (चित्र 1ख)।
      नोट: माइक्रोपाइल, छोटा छेद जिसके माध्यम से शुक्राणुजोआ अंडे में प्रवेश करता है, भ्रूण के पूर्ववर्ती छोर पर स्थित होता है। पश् च अंत अधिक गोल होता है। श् वासनली सफेद दिखाई देती है और भ्रूण में डोर्सली स्थित होती है, जिससे भ्रूण के पृष्ठीय तथा अधर पक्षों का भेद होता है (चित्र 1ख)।
    11. दो तरफा टेप के एक टुकड़े के साथ एक स्लाइड तैयार करें। भ्रूण के शीर्ष पर स्लाइड को डबल साइड टेप में स्थानांतरित करने के लिए दृढ़ता से दबाएं।
    12. $ 25 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन द्वारा भ्रूण को निष्क्रिय करना (कोई desicant प्रयोग किया जाता है)। शुष्कता के बाद, हैलोकार्बन तेल के साथ भ्रूण को कवर करें।
      नोट: तापमान, आर्द्रता, और कमरे में वेंटिलेशन के आधार पर निराशा अवधि भिन्न हो सकती है। ऊष्मायन अवधि का उपयोग इंजेक्शन के लिए उपकरण और इमेजिंग के लिए confocal माइक्रोस्कोप स्थापित करने के लिए किया जाना चाहिए, जैसा कि इस प्रोटोकॉल के अनुभाग 2 और 3 में वर्णित है।
  2. लार्वा संग्रह
    1. वांछित जीनोटाइप के 5 डिग्री 10 कुंवारी मादा मक्खियों के साथ एक क्रॉस सेट करें और वांछित जीनोटाइप के आधे पुरुषों को एक शीशी में कॉर्नमील-आगर भोजन और 25 डिग्री सेल्सियस23पर इनक्यूबेट के साथ स्थापित करें।
    2. 5 "7 दिनों के बाद, जीनोटाइप के आधार पर, शीशी से तीसरे इनस्टार लार्वा को धीरे से संदगते हुए इकट्ठा करें। लार्वा से अटके भोजन को हटाने के लिए 1x पीबीएस में लार्वा कुल्ला करें। यदि आवश्यक हो तो चरण 1.1.9 में वर्णित जीनोटाइपिंग के लिए सेब के रस आगर प्लेट में लार्वा स्थानांतरित करें।
    3. उन्हें सुखाने के लिए तूलिका का उपयोग करके ऊतक पर लार्वा रोल करें। संदंका का उपयोग कर दो तरफा टेप के साथ तैयार एक स्लाइड करने के लिए 6 "8 लार्वा स्थानांतरण।

2. सुई और चश्मा इंजेक्शन की तैयारी

  1. इस प्रोटोकॉल की शुरुआत से पहले एक माइक्रोपिपेट खींचने पर सुई खींचो. सुई खींचने में सुरक्षित केशिका ट्यूब और मानक सुई के आकार और डी मेलेनोगैस्टर इंजेक्शन के लिए मानकों के अनुसार खींच (तालिका 3)27. इंजेक्शन के लिए उपयोग करने तक मिट्टी में लंगर द्वारा एक पेट्री डिश में सुई स्टोर.
  2. भ्रूण के लिए 25-मिनट की शुष्कता अवधि के दौरान 20 डिग्री जेल-लोडिंग पिपेट टिप का उपयोग करके सल्फोहोडामाइन 101 एसिड क्लोराइड (सामग्री की तालिका) के 5 डिग्री एल के साथ सुई लोड करें (चरण 1.1.12), या तुरंत हस्तांतरण के बाद स्लाइड करने के लिए लार्वा (चरण 1.2.3)।
  3. सुई को सुई धारक में लोड करें तथा एक सूक्ष्म तापकता में स्थिति को इस्पात आधार (सामग्री की सारणी) केलिए सुरक्षित किया जाता है।
    नोट: सुई भ्रूण इंजेक्शन के लिए माइक्रोस्कोप चरण के लगभग समानांतर होनी चाहिए और लार्वा इंजेक्शन के लिए थोड़ा नीचे कोण।
  4. इंजेक्शन उपकरण सेट (सामग्री की तालिका) 50 साई, 10 की एक सीमा के साथ 5 डिग्री 10 एमएस के लिए।
    नोट: यह विशेष रूप से इस्तेमाल किया जा रहा इंजेक्शन उपकरण के लिए इन सेटिंग्स को बदलने के लिए आवश्यक हो सकता है.
  5. एक angled, टूटी हुई टिप बनाने के लिए एक 45 डिग्री कोण पर डबल पक्षीय टेप के किनारे के खिलाफ सुई के मंच और ब्रश किनारे पर स्लाइड रखें।
    नोट: भ्रूण के लिए यह केवल टिप तोड़ने के लिए पर्याप्त 10 kDa dextran के प्रवाह के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है. एक सही सुई एक थोड़ा angled टिप है और डाई का केवल एक छोटा सा बूंद प्रत्येक इंजेक्शन के साथ बाहर आ जाएगा. लार्वा के लिए, टिप को अधिक तोड़ने के लिए आवश्यक है, लेकिन लार्वा शरीर की दीवार में प्रवेश करने के लिए कोण वाले टिप के साथ। डाई का एक बड़ा बूंद बाहर आ जाएगा.
  6. पम्प पैर पेडल जब तक डाई सुई की नोक पर है.
  7. सुई को संरेखित करें ताकि यह भ्रूण के साथ समानांतर हो या लार्वा की ओर थोड़ा नीचे की ओर कोण हो।
  8. नमूना के पीछे के छोर पंचर और पैर पेडल पंप द्वारा नमूना इंजेक्ट करने के लिए सुई ले जाएँ। भ्रूण में डाई की $2 एनएल, और $ 220 एनएल डाई को लार्वा में इंजेक्ट करें।
    नोट: यदि इंजेक्शन सफल होता है तो भ्रूण या लार्वा को डाई के साथ भर देना चाहिए।
  9. ऊष्मायन उद्देश्यों के लिए इंजेक्शन के समय को नोट करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट भ्रूण। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट लार्वा।
  10. अतिरिक्त नमूनों इंजेक्ट करने के लिए स्लाइड नीचे जारी रखें, प्रत्येक नमूने के लिए इंजेक्शन के समय टिप्पण.
    नोट: जिस गति के साथ बाद में विच्छेदन और इमेजिंग कदम किया जा सकता है के आधार पर, 4 "8 नमूनों एक समय में इंजेक्शन किया जा सकता है.

3. इमेजिंग के लिए नमूने की तैयारी

  1. भ्रूण की इमेजिंग
    1. इंजेक्शन के बाद, इमेजिंग के लिए भ्रूण तैयार करते हैं। कवरस्लिप की नियुक्ति पर भ्रूण को नुकसान को रोकने के लिए स्लाइड पर नमूनों के दाईं और बाईं ओर एक कपास से पटे applicator के साथ पेट्रोलियम जेली लागू करें।
    2. एक 20x उद्देश्य के साथ भ्रूण की गहराई भर में एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि के नमूने. निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करते हुए अधर तंत्रिका कॉर्ड (VNC) में पाए गए डाई के साथ कुल नमूनों के प्रतिशत की गणना करें: समझौता BBB के साथ नमूनों का % - VNC में डाई संचय के साथ नमूनों की संख्या /
  2. लार्वा का विच्छेदन और इमेजिंग
    1. समय से आगे लार्वा के नमूनों के लिए स्लाइड तैयार करें। माउंट दो coverss लगभग 0.5 सेमी के अलावा नेल पॉलिश के साथ स्लाइड करने के लिए जगह.
      नोट: मस्तिष्क के लिए स्पेसर्स के रूप में कवरलिप कार्य करते हैं, इसलिए बढ़ते प्रक्रिया के दौरान यह क्षतिग्रस्त नहीं होता है।
    2. 30 मिनट ऊष्मायन के बाद, इमेजिंग में इस्तेमाल किया जाएगा कि स्लाइड पर सीधे 1x PBS में लार्वा विच्छेदन। सबसे पहले, लार्वा शरीर के आधे रास्ते में लार्वा को पकड़ने के लिए एक जोड़ी बलप्स का उपयोग करें, और लार्वा के पूर्वकाल और पीछे के हिस्सों को अलग करने के लिए बलप्स की दूसरी जोड़ी का उपयोग करें।
    3. इसके बाद, मुंह के हुक पर पूर्वकाल क्षेत्र को पकड़ने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें, और मुंह के हुक को पकड़ने वाले बल की नोक पर शरीर की दीवार को उलटने के लिए बल की दूसरी जोड़ी का उपयोग करें। मस्तिष्क और VNC उजागर किया जाएगा.
    4. तंत्रिकाओं को तोड़कर मस्तिष्क और VNC को शरीर की दीवार से अलग करें, और स्लाइड से शरीर की दीवार को हटा दें (चित्र 1ब्, D)। यदि वांछित हो तो कल्पना डिस्क निकालें.
    5. 80% ग्लिसरोल के 10 डिग्री एल के साथ नमूना कवर और इमेजिंग के लिए नमूने के शीर्ष पर एक कवरस्लिप जगह है।
    6. एक 20x उद्देश्य का उपयोग तंत्रिका तंत्र के ऊतकों की गहराई के माध्यम से छवि. VNC में मनाया डाई के साथ कुल नमूनों के प्रतिशत की गणना.

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Representative Results

यहाँ वर्णित विधियों डी मेलेनोगैस्टर भ्रूण और लार्वा में सीएनएस भर में BBB की अखंडता के दृश्य के लिए अनुमतिदेतेहैं ( चित्र 1 ) . देर से भ्रूणजनन में BBB गठन के पूरा होने पर, BBB मस्तिष्क और VNC5से बड़े अणुओं को बाहर करने के लिए कार्य करता है. इस प्रोटोकॉल BBB गठन परख करने के लिए इस समारोह का लाभ लेता है. जब जंगली प्रकार (ओरेगॉन आर) देर चरण 17 (20 डिग्री 21 एच पुराने) भ्रूण के साथ इंजेक्शन थे 10 kDa dextran संयुग्मी sulforhodamine 101 एसिड क्लोराइड फ्लोरोसेंट डाई करने के लिए, बड़े डेक्सट्रान अणु VNC से बाहर रखा गया था, के रूप में अपेक्षित(चित्र 2ए). आदेश में BBB अखंडता पर आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए, कच्चे जीन में उत्परिवर्तन के साथ भ्रूण का उपयोग किया गया. पहले, रॉ जीन भ्रूणजनन के दौरान रोगाणु बैंड प्रत्याकर्षण को विनियमित करने के लिए प्रदर्शन किया गया है, और हाल ही में विकास के दौरान VNC में आकृतिगत परिवर्तन को विनियमित करने के लिए glia में कार्य करने के लिए दिखाया गया है28. हेटरोजोजिक कच्चे1 उत्परिवर्ती भ्रूण एक बरकरार BBB का प्रदर्शन किया, जंगली प्रकार नियंत्रण भ्रूण में मनाया परिणामों के समान (चित्र 2बी). इसके विपरीत, समयुग्मज कच्चे1 उत्परिवर्ती भ्रूण BBB की अखंडता में दोष का प्रदर्शन किया, VNC में 10 kDa dextran डाई बाढ़ के साथ, यह दर्शाता है कि BBB बनाने में विफल (चित्र 2ब्) . इन परिणामों भ्रूण चरणों के दौरान BBB गठन परख करने के लिए इस तकनीक की क्षमता का प्रदर्शन.

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि उपपरिनिक्षिप्य ग्लिया बहुगुणितीकरण में दोष बीबीबी के विघटन का परिणाम है जिसे तीसरे इनस्टार लार्वा चरणोंमेंदेखा जा सकता है7 ,9. इस प्रकार, BBB गठन और/या रखरखाव में दोष विकास के बाद के चरणों के दौरान एक समझौता BBB में परिणाम हो सकता है, यह तीसरे instar लार्वा चरण में बाधा की अखंडता परख करने के लिए वांछनीय बना. इसलिए, भ्रूण चरणों में BBB अखंडता पराकाश्त के लिए उपयोग प्रोटोकॉल भी लार्वा में उपयोग के लिए अनुकूलित किया गया है. ओरेगन आर नियंत्रण नमूने में, 10 kDa dextran BBB घुसना करने में विफल रहता है और मस्तिष्क और VNC से बाहर रखा गया है (चित्र 2डी, ई). डाई BBB की परिधि में जमा हो जाता है.

Figure 1
चित्र 1: चरण 17 भ्रूण और तीसरा इनस्टार लार्वा का तंत्रिका तंत्र। (ए) एक चरण 17 भ्रूणीय केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के एक अधर दृश्य का योजनाबद्ध। सीएनएस मस्तिष्क (बीआर) और अधर तंत्रिका कॉर्ड (VNC), जो dorsoventral चैनल (च) है के होते हैं। अग्रअंत में माइक्रोपाइल (मप; ऐरोहेड) का उपयोग भ्रूण को उन्मुख करने के लिए किया जा सकता है। दाईं ओर पश् चता। (ख) चरण 17 भ्रूण जो पृष्ठीय पक्ष के साथ उन्मुख होता है और दाईं ओर पीछे की ओर, जैसा कि चरण 1.1.10 में सिफारिश की गई है। तीर श्वासनली की ओर इशारा कर रहे हैं। एरोहेड एमपी को इंगित करता है। दाईं ओर पश् चता। (सी) तीसरे इनस्टार लार्वा में तंत्रिका तंत्र का स्केमेटिक। मस्तिष्क (Br) और VNC सीएनएस रचना, जबकि नसों शरीर की दीवार की मांसपेशियों पर VNC synapse से विस्तार और पीएनएस का हिस्सा हैं. दाईं ओर पश् चता। (घ)तृतीय इनस्टार लार्वा मस्तिष्क तथा वीएनसी का विनिरित। दाईं ओर पश् चता। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) गठन के लिए परख. (ए-सी) देर से चरण 17 भ्रूण (20 डिग्री 21 एच पुराने) 10 kDa sulforhodamine 101 एसिड क्लोराइड dextran के साथ पीछे इंजेक्शन. पीछे नीचे. स्केल बार $ 20 डिग्री मी. नियंत्रण में देखा डॉट्स डोर्सोवेन्ट्रल चैनल है कि अधर तंत्रिका कॉर्ड (VNC) अवधि रहे हैं. (ए) ओरेगन आर नियंत्रण. 6.25% नमूनों में डाई तेज, n $ 16. (बी) कच्चे1/+ भाई नियंत्रण. 6.67% नमूनों में डाई तेज, n $ 15. (ग)होमोयुग्मज कच्चा1/ 100% नमूनों में डाई तेज, n $ 22. (डी)ओरेगन आर नियंत्रण तीसरे इनस्टार लार्वा मस्तिष्क. डाई BBB पर जमा है, लेकिन सीएनएस में प्रवेश नहीं करता है, n - 7. स्केल बार $ 50 डिग्री मी. (ई) ओरेगन आर नियंत्रण तीसरे इनस्टार लार्वा वीएनसी। डाई BBB पर जमा है, लेकिन सीएनएस में प्रवेश नहीं करता है, n $ 11. डैश्ड लाइन VNC रूपरेखा. स्केल बार $ 50 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: देर से भ्रूण के विकास में मिडगुट आकारिकी। चरण 13-17 भ्रूण के संचारित प्रकाश छवियों आंत आकृति विज्ञान के दृश्य के लिए अनुमति देते हैं (भ्रूण के पीछे आधा में काले भूरे क्षेत्रों). मिडगट आकारिकी का उपयोग भ्रूण विकास की अवस्था को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, जो यह निर्धारित करने में सहायक होता है कि भ्रूण इंजेक्शन के लिए उचित रूप से आयु वर्ग के हैं या नहीं। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समाधान नुस्खा
2% अगारोस जेल 0.8 ग्राम आगारो को 40 एमएल डबल-डिस्टिल्ड एच 2ओ (डीडीएच2ओ) में एक एरलेनमी फ्लास्क में जोड़ें और माइक्रोवेव को एगार को भंग करने के लिए। एक जेल कास्टिंग ट्रे में डालो और जेल कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ठोस करने के लिए अनुमति देते हैं।
सेब का रस ऐगार प्लेट्स एक 4 L फ्लास्क में 45 ग्राम आगर और 1.5 एल ddH2O के उपाय। 121 डिग्री सेल्सियस पर 40 डिग्री 45 मिनट के लिए ऑटोक्लेव। एक 1 एल बीकर में चीनी और 0.5 एल सेब का रस के 50 ग्राम उपाय और कम गर्मी पर हलचल (सेटिंग 3) चीनी भंग करने के लिए, ध्यान रखने के लिए इसे जला नहीं. ऑटोक्लेविंग के बाद, आगर और पानी में पहले से गरम चीनी और सेब का रस जोड़ें। गर्मी के साथ कम पर हिलाओ बंद करने के लिए शांत जब तक आप इसे छू सकता है अनुमति देते हैं. 70% tegosept के 15 एमएल जोड़ें और फैलाने के लिए हलचल. एक 0.5 एल बीकर में डालो. एक Bunsen बर्नर के साथ बुलबुले या लौ को दूर करने के लिए इथेनॉल के साथ स्प्रे. 60 मिमी पेट्री व्यंजन में डालो. कम से कम 24 एच के लिए सेट करने की अनुमति दें, या जब तक पेट्री व्यंजन के ढक्कन पर कम से कम संघनन न हो और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर न हो जाए।
50% ब्लीच एक शंकु नली में 15 एमएल डीडीएच2हे और घरेलू ब्लीच के 15 एमएल जोड़ें।
80% ग्लिसरोल 10 एमएल के लिए, एक 15 एमएल शंकु ट्यूब में 8 एमएल ऑटोक्लेव डीएच2तथा ग्लिसरॉल के 2 एमएल जोड़ें। एक रॉकर पर इनक्यूबेट जब तक समाधान सजातीय है.
1x पीबीएस 1 L के लिए, 10x पीबीएस के 100 एमएल को 900 एमएल डीडीएच2हे में पतला करें।
10x पीबीएस 2 ल के लिए, निम्नलिखित को 1600 एमएल डीडीएच2हे में भंग करें: 160 ग्राम नाक्कर, 4 ग्राम केसीएल, 28.8 ग्राम ना2एचपीओ4और 4.8 ग्राम KH2पीओ4। एचसीएल के साथ 7.5 करने के लिए पीएच समायोजित करें।
पीबीटीएक्स (पीबीएस + 0.1% nonionic surfactant) 1 L के लिए, 10x पीबीएस के 100 एमएल, 10 एमएल 10% nonionic सर्फैक्टेंट, और 890 एमएल डीडीएच2हे के गठबंधन।
70% टेगोसेप्ट 100% इथेनॉल के हर 10 एमएल के लिए 1 ग्राम पी-हाइड्रॉक्सीबेन्जोइक एसिड, मिथाइल एस्टर मिलाएं। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
10% Nonionic सर्फैक्टेंट 50 एमएल के लिए, एक शंकु नली में 45 एमएल ऑटोक्लेव डीएच2तथा 5 एमएल nonionic सर्फैक्टेंट जोड़ें। रॉकर पर घुमाएँ जब तक समाधान सजातीय है.
खमीर पेस्ट चिकनी जब तक एक 50 एमएल प्लास्टिक बीकर में डीडीएच2हे के साथ सूखी सक्रिय खमीर मिक्स।

तालिका 1: अभिकर्मकों और बफ़र्स इस प्रोटोकॉल के दौरान उपयोग किया जाता है।

जीनोटाइप भंडार
w[1118]; ln(2LR)Gla, wg[Gla-1]/CyO, P[w]+mC]GAL4-twi.G]2.2, P[w]+mC]UAS-2xEGFP]AH2.2 ब्लूमिंगटन #6662
w[*]; sna[Sco]/CyO, P[w]+mC]Dfd-EYFP]2 ब्लूमिंगटन #8578
w[*]; L[2] Pin[1]/CyO, P[w]+mC]GAL4-Kr.C$DC3, P]w[+mC]UAS]GFP. S65T]डीसी7 ब्लूमिंगटन #5194
Df(1)JA27/FM7c, P[w]+mC]GAL4-Kr.C$DC1, P]w[+mC]UAS-GFP. S65T]DC5, sn[+] ब्लूमिंगटन #5193
w[*]; ry[506] Dr[1]/TM6B, P[w]+mc[Dfd-EYFP]3, Sb[1] Tb[1] ca[1] ब्लूमिंगटन #8704
y[1] w[*]; D[*] gl[3]/TM3, P[w]+mC]GAL4-Kr.C$DC2, P]w[+mC][UAS-GFP. ] S65T]DC10, Sb[1] ब्लूमिंगटन #5195
ओरेगन आर एकाधिक तनाव उपलब्ध
कच्चे [1] cn[1] bw[1] sp[1]/CyO ब्लूमिंगटन #2749
P[w]+mW.hs[GawB]elav[C155] ब्लूमिंगटन #458
w[1118]; P]w[+m*]GAL4]रीपो/TM3, Sb[1] ब्लूमिंगटन #7415
P]UAS-GFP] एकाधिक उपभेदों उपलब्ध

तालिका 2: उपभेदों उड़ना. फ्लाई उपभेदों इस प्रोटोकॉल भर में चर्चा की. ब्लूमिंगटन Drosophila स्टॉक सेंटर स्टॉक नंबर जहां लागू प्रदान की जाती है.

चक्र गर्मी खींचना वेग समय दबाव रैंप
1 590 115 15 250 600 एक्स
2 575 130 60 250 600 एक्स

तालिका 3: Micropipette खींचने सेटिंग्स. माइक्रोपिपेट खींचने वाली सेटिंग्स जिसका उपयोग इस प्रोटोकॉल में इंजेक्शन के लिए सुई उत्पन्न करने के लिए किया जाता है।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल डी मेलेनोगैस्टर विकास के देर से भ्रूण और तीसरे instar लार्वा चरणों के दौरान BBB अखंडता के लिए परख के लिए आवश्यक कदम का एक व्यापक विवरण प्रदान करता है. इसी तरह के दृष्टिकोणों का वर्णन विकास के दौरान बीबीबी की अखंडता परख करने के साथ - साथ वयस्क अवस्थाओंमें 5,7,29,30के रूप में वर्णित किया गया है . हालांकि, सामग्री और तरीकों वर्गों में प्रक्रियाओं के विवरण अक्सर प्रकृति में व्यापक हैं और आसान कार्यान्वयन के लिए पर्याप्त विस्तार की कमी है, शोधकर्ता की ओर से महत्वपूर्ण समस्या निवारण की आवश्यकता. इस प्रोटोकॉल भ्रूण और लार्वा चरणों के दौरान BBB अखंडता के लिए परख के लिए आवश्यक कदम का एक व्यापक विवरण प्रदान करता है. प्रत्येक चरण में, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम उठाए जाने चाहिए कि विकास के सही चरण की जांच की जा रही है और ऊतक वास्तुकला बाधित नहीं है, जो बीबीबी से समझौता कर सकता है। इन दृष्टिकोणों में सफलता प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल के एक से अधिक चरणों का निवारण करना आवश्यक था ताकि सटीक परिणाम प्राप्त किए जा सकें. भ्रूणीय और लार्वा प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन नीचे किया गया है।

पिछले अध्ययनों से 18.5 एच एईएल5द्वारा BBB की स्थापना की सूचना दी है . सटीक विकास समय सुनिश्चित करने के लिए, यह उम्र बढ़ने के दौरान एक निरंतर तापमान पर नमूने बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। भ्रूण इकट्ठा करते समय, सेब का रस आगर प्लेटों को संग्रह के लिए उपयोग करने से पहले 25 डिग्री सेल्सियस तक लाया जाना चाहिए। सेब का रस प्लेटों है कि धीमी विकास में पूर्व गर्म परिणाम नहीं किया गया है और नमूने है कि अभी तक एक BBB की स्थापना नहीं की है और इसलिए तंत्रिका तंत्र में 10 kDa dextran के संचय का प्रदर्शन होगा उपज कर सकते हैं का उपयोग करना. इस प्रकार, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि एक नमूने इंजेक्शन है कि 18.5 एच से पुराने हैं इसके अतिरिक्त, जब भ्रूण में इन प्रयोगों के प्रदर्शन, यह एक विकासात्मक देरी की संभावना पर विचार करने के लिए आवश्यक है, क्योंकि इस तरह के एक देरी बस में परिणाम सकता है बाद में BBB की स्थापना. किसी भी संभावित विकासात्मक देरी के लिए खाते में, नमूने 20 डिग्री 21 एच एईएल पर परख किए गए थे, थोड़ा BBB गठन की सूचना के बाद. अन्य ऊतकों की आकृति विज्ञान का उपयोग करना, विशेष रूप से विकासशील मिडगुट, परखी जा रहा है भ्रूण के विकास की सही अवस्था स्थापित करने में सहायता कर सकते हैं (चित्र 3)। इसके विपरीत, अनुचित प्रयोगात्मक समय नमूने है कि पहले से ही गतिशील हैं और hatching प्रक्रिया शुरू कर दिया है में परिणाम कर सकते हैं. लार्वा की संख्या को कम करने के लिए जो पहले से ही अंडे से निकलने लगे हैं, इंजेक्शन के लिए भ्रूण इकट्ठा करने से पहले महिलाओं से पुराने भ्रूणों को साफ करने के लिए कम से कम दो 1 एच संग्रह करना महत्वपूर्ण है। यदि पहले इनस्टार लार्वा में बीबीबी का विश्लेषण वांछित है, तो बर्फ पर 9-वेल डिश में 1x पीबीएस में लार्वा की एक संक्षिप्त ऊष्मायन इंजेक्शन से पहले गतिशीलता को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। स्लाइड भी गतिशीलता को कम करने के लिए इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान एक बर्फ पैक पर रखा जा सकता है।

आदेश में गुणवत्ता छवियों और भ्रूण में BBB की स्थापना के बारे में सटीक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, अतिरिक्त कदम सावधानी से प्रक्रिया के दौरान पालन किया जाना चाहिए. जब यह अग्र स्लैब पर भ्रूणों को अस्तर देता है, तो श्वासनली का सामना करना पड़ सकता है, क्योंकि यह भ्रूण का पृष्ठीय पक्ष होता है (चित्र 1ठ)। जब भ्रूण डबल पक्षीय टेप के साथ स्लाइड करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं, भ्रूण के अधर पक्ष तो सामना करना पड़ जाएगा, प्रोटोकॉल में बाद में confocal इमेजिंग के दौरान तंत्रिका कॉर्ड के इष्टतम दृश्य के लिए अनुमति देता है. भ्रूण भी सुरक्षित रूप से इंजेक्शन के दौरान आंदोलन को बाधित करने के लिए डबल पक्षीय टेप का पालन किया जाना चाहिए। एक फ्लैट 2% agarose पैड का उपयोग शोधकर्ता भ्रूण को नुकसान के जोखिम के बिना हस्तांतरण प्रक्रिया के दौरान भ्रूण पर मजबूती से दो तरफा टेप के साथ स्लाइड पुश करने के लिए अनुमति देता है. स्लाइड करने के लिए स्थानांतरण के बाद, शुष्कीकरण डाई इंजेक्शन पर फटने से भ्रूण को रोकने के लिए आवश्यक है। बहुत अधिक डाई का इंजेक्शन भी भ्रूण फट करने के लिए पैदा कर सकता है. यह केवल भ्रूण में सुई डालने के लिए पर्याप्त डाई इंजेक्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन इतना नहीं है कि सुई संभावित तंत्रिका तंत्र punctures, जो एक झूठी सकारात्मक परिणाम देना होगा. एक पंचर घाव का बहुत बड़ा भी हेमोलिम्फ में परिणाम कर सकते हैं और भ्रूण से बाहर बाढ़ डाई, एक असफल प्रयोग करने के लिए अग्रणी. मन में इन संभावित नुकसान के साथ, इंजेक्शन एक सुई है कि टिप करने के लिए एक मामूली कोण है के साथ सबसे सफल है, इस तरह है कि वहाँ एक छोटा सा बिंदु है जिसके साथ ध्यान से भ्रूण पंचर करने के लिए है.

BBB अखंडता के लिए लार्वा परादने के मामले में, नमूने की गतिशीलता के कारण चुनौतियां उत्पन्न हो सकती हैं। उच्च गुणवत्ता वाले डबल पक्षीय टेप का उपयोग महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह इंजेक्शन के लिए लार्वा को स्थिर करने में प्रभावी होना चाहिए। यदि लार्वा अटक जाता है, तो इसे टेप पर वापस लुढ़काया जा सकता है और धीरे से इसे असुरक्षित करने के लिए नीचे धकेल दिया जा सकता है। इंजेक्शन के लिए लार्वा ले जाते समय, लार्वा के न आने की स्थिति में पेट्री डिश में स्लाइड ले जाने में सहायक होता है। इंजेक्शन के बाद कदम BBB के विघटन से बचने के लिए सबसे अधिक देखभाल की आवश्यकता है. आदेश में नमूने के लिए संभावित क्षति को कम करने के लिए, यह इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि स्लाइड पर सीधे नमूना विच्छेदन के लिए आसान है. यदि विच्छेदन के लिए नमूना स्थानांतरित करते समय लार्वा का दृढ़ता से टेप का पालन किया जाता है, तो टेप में 1x पीबीएस की एक बूंद को आसंजन को ढीला करने के लिए जोड़ा जा सकता है और विच्छेदन के लिए स्लाइड में स्थानांतरण की अनुमति दी जा सकती है। विच्छेदन के बाद, यह नमूना पर्याप्त रूप से झूठी सकारात्मक परिणाम से बचने के लिए समतल करने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन इतना नहीं है कि नमूना अखंडता समझौता किया है. coverslip और अतिरिक्त coverslips का उपयोग कर स्लाइड के बीच लार्वा सैंडविच के रूप में spacers क्षतिग्रस्त होने से मस्तिष्क को रोकता है, अभी तक प्रभावी इमेजिंग के लिए नमूना immobilizes.

भ्रूण और लार्वा दोनों के लिए प्रोटोकॉल के साथ सफलता प्राप्त करने के लिए, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि नमूना प्रसंस्करण शुरू होने से पहले इंजेक्शन उपकरण और confocal माइक्रोस्कोप स्थापित किए जाते हैं। यह नमूने की इमेजिंग में सटीक समय के लिए अनुमति देता है, जो नमूना तुलना के लिए आवश्यक है. अन्य दृष्टिकोण और अधिक उन्नत इंजेक्शन सेट अप का उपयोग किया है, भ्रूण इंजेक्शन के लिए स्थापित एक उल्टे माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है. इस प्रोटोकॉल एक दबाव नियामक के साथ एक मानक विच्छेदन माइक्रोस्कोप और micromanipulator का इस्तेमाल करता है. इस मामले में, एक ज़ेब्राफ़िश इंजेक्शन की स्थापना बस मक्खी भ्रूण और लार्वा के इंजेक्शन के लिए अनुकूलित किया गया था। इस प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से इंजेक्शन के लिए एक सिरिंज के साथ एक micromanipulator का उपयोग करने के लिए आगे सरलीकृत किया जा सकता है. इन उपकरणों के कई जीव विज्ञान विभागों में आसानी से उपलब्ध हैं और यहां तक कि कक्षा प्रयोगशाला सेटिंग्स में उपलब्ध हो सकता है, प्रोटोकॉल कार्यान्वयन के अधिक से अधिक आसानी के लिए अनुमति देता है.

इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान, यह और अधिक आसानी से इमेजिंग के लिए वांछित क्षेत्र की पहचान करने के लिए तंत्रिका तंत्र की कोशिकाओं लेबल करने के लिए उपयोगी हो सकता है. विशेष रूप से, एक GAL4/UAS प्रणाली का उपयोग करने के लिए या तो न्यूरॉन्स या glia में GFP व्यक्त कर सकते हैं, elav-Gal4 या रेपो-Gal4 उपभेदों का उपयोग कर, क्रमशः (तालिका 2)31,32,33. इस तरह की लेबलिंग तंत्रिका तंत्र की अखंडता की कल्पना करने के लिए sulforhodamine 101 एसिड क्लोराइड डेक्सट्रन के साथ एक विपरीत प्रदान करेगा।

हालांकि इस विधि D. melanogasterके विकास के दौरान BBB की अखंडता पर ध्यान केंद्रित किया है, इस दृष्टिकोण जीवों और ऊतकों की एक किस्म भर में अन्य बाधाओं की अखंडता की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, चूहों 34 में BBB पर चढ़ाई के लिए इसी तरह के प्रोटोकॉल प्रकाशित किए गएहैं। इसके अतिरिक्त, रक्त-नेत्र ीय अवरोध तथा जनन कोशिकाओं के आस-पास की दैहिक बाधा की पारगम्यता डी मेलैनोगैस्टर में शुक्राणुजनन के दौरान एक समान दृष्टिकोण29,35का उपयोग करता है। प्रोटोकॉल भी आंत में सहित पारगम्यता का परीक्षण करने के लिए अन्य ऊतकों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। जब अन्य ऊतकों या प्रजातियों में उपयोग के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन, यह अणुओं है कि बाधा घुसना कर सकते हैं के आकार पर विचार करने के लिए आवश्यक हो जाएगा, के रूप में यह संभव है कि 10 kDa dextran काफी छोटे कुछ बाधाओं permeate हो सकता है. कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल डी melanogaster विकास है कि आसानी से अन्य सेटिंग्स में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के दौरान BBB अखंडता के लिए परख के लिए एक कदम दर कदम प्रक्रिया प्रदान करता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों इंजेक्शन के लिए उपकरणों के उपयोग के लिए डॉ एफ ब्रायन पिकेट और डॉ रोडनी डेल धन्यवाद. इस काम को लोयोला विश्वविद्यालय शिकागो से एमडी, डी.टी., और जे.जे.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 kDa sulforhodamine 101 acid chloride (Texas Red) Dextran ThermoFisher Scientific D1863 Dextran should be diluted in autoclaved ddH2O to a concentration of 25 mg/mL.
20 μL Gel-Loading Pipette Tips Eppendorf 22351656
100% Ethanol (200 proof) Pharmco-Aaper 11000200
Active Dry Yeast Red Star
Agar Fisher Scientific BP1423
Agarose Fisher Scientific BP160-500
Air Compressor DeWalt D55140
Apple Juice Mott's Natural Apple Juice
Bleach Household Bleach 1-5% Hypochlorite
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4
Bottle Plugs Fisher Scientific AS-277
Cell Strainers BD Falcon 352350
Confocal Microscope Olympus FV1000 Samples imaged using 20x objective (UPlanSApo 20x/ 0.75)
Cotton-Tipped Applicator Puritan 19-062614
Double-Sided Tape 1/2" Scotch
Dumont Tweezers; Pattern #5; .05 x .01 mm Tip Roboz RS-5015
Fly Food Bottles Fisher Scientific AS-355
Fly Food Vials Fisher Scientific AS-515
Foot Pedal Treadlite II T-91-S
Gel Caster Bio-Rad 1704422
Gel Tray Bio-Rad 1704436
Glass Pipette VWR 14673-010
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Granulated sugar Purchased from grocery store.
Halocarbon Oil Lab Scientific, Inc. FLY-7000
Light Source Schott Ace I
Manipulator Stand World Precision Instruments M10
Micromanipulator World Precision Instruments KITE-R
Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-97
Needle Holder World Precision Instruments MPH310
Nightsea Filter Sets Electron Microscopy Science SFA-LFS-CY For visualization of YFP
Nightsea Full Adapter System w/ Royal Blue Color Light Head Electron Microscopy Science SFA-RB For visualization of GFP
Paintbrush Simply Simmons Chisel Blender #6
Pipetter Fisher Scientific 13-683C
Pneumatic Pump World Precision Instruments PV830 This is also referred to as a microinjector or pressure regulator. Since the model used in our study is no longer available this is one alternative.
Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Small Embryo Collection Cages Genesee Scientific 59-100
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Steel Base Plate World Precision Instruments 5052
Stereomicroscope Carl Zeiss Stemi 2000 Used for tissue dissection.
Stereomicroscope with transmitted light source Baytronix Used for injection.
Tegosept (p-hydroxybenzoic acid, methyl ester) Genesee Scientific 20-258
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 Nonionic surfactant
Vial Plugs Fisher Scientific AS-273

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References

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