Summary
Den nuværende protokol indfører en streng og reproducerbar metode til kvantificering af morfologiske fælles ændringer, der ledsager slidgigt. Anvendelse af denne protokol kan være værdifuld i overvågning af sygdomsprogression og evaluering terapeutiske indgreb i slidgigt.
Abstract
En af de mest udbredte ledsygdomme i USA, slidgigt (OA) er karakteriseret ved progressiv degeneration af ledbrusk, primært i hofte-og knæled, hvilket resulterer i betydelige konsekvenser for patientens mobilitet og livskvalitet. Til dato er der ingen eksisterende helbredende behandlinger for OA i stand til at bremse eller hæmme brusk degeneration. I øjeblikket er der en omfattende mængde af igangværende forskning for at forstå OA patologi og opdage nye terapeutiske tilgange eller agenter, der effektivt kan bremse, stoppe, eller endda vende OA. Det er således afgørende at have en kvantitativ og reproducerbar tilgang til præcist at evaluere OA-relaterede patologiske ændringer i den fælles brusk, synovium og subchondral knogle. I øjeblikket, OA sværhedsgrad og progression er primært vurderes ved hjælp af Slidgigt Research Society International (OARSI) eller Mankin scoring systemer. På trods af betydningen af disse scoringssystemer er de semikvantitative og kan påvirkes af brugerens subjektivitet. Endnu vigtigere, de undlader at præcist at vurdere subtile, men vigtigt, ændringer i brusk i de tidlige sygdomstilstande eller tidlige behandlingsfaser. Den protokol, vi beskriver her, bruger et edb-og semiautomatiseret histomorfometrisk softwaresystem til at etablere en standardiseret, stringent og reproducerbar kvantitativ metode til evaluering af fælles ændringer i OA. Denne protokol udgør et stærkt supplement til de eksisterende systemer og giver mulighed for mere effektiv påvisning af patologiske ændringer i leddet.
Introduction
En af de mest udbredte ledsygdomme i USA, OA er karakteriseret ved progressiv degeneration af ledbrusk, primært i hofte-og knæled, hvilket resulterer i betydelige konsekvenser for patientens mobilitet og livskvalitet1,2,3. Ledbrusk er den specialiserede bindevæv af diarthrodialsamlinger designet til at minimere friktion, lette bevægelse, og udholde fælles kompression4. Ledbrusk består af to primære komponenter: chondrocytter og ekstracellulær matrix. Chondrocytter er specialiserede, metabolisk aktive celler, der spiller en primær rolle i udviklingen, vedligeholdelsen og reparationen af den ekstracellulære matrix4. Chondrocyt hypertrofi (CH) er en af de vigtigste patologiske tegn på OA udvikling. Det er kendetegnet ved øget cellulær størrelse, nedsat proteoglycan produktion, og øget produktion af brusk matrix-nedbrydende enzymer, der i sidste ende fører til brusk degeneration5,6,7. Yderligere, patologiske ændringer i subchondral knogle og synovium af den fælles spiller en vigtig rolle i OA udvikling og progression8,9,10,11,12. Til dato er der ingen eksisterende helbredende behandlinger, der hæmmer bruskdedegeneration1,2,3,13,14. Således er der omfattende igangværende forskning, der har til formål at forstå OA patologi og opdage nye terapeutiske tilgange, der er i stand til at bremse eller endda stoppe OA. Derfor er der et stigende behov for en kvantitativ og reproducerbar tilgang, der muliggør nøjagtig evaluering af OA-relaterede patologiske ændringer i brusk, synovium og subchondral knogle i leddet.
I øjeblikket vurderes OA-sværhedsgrad og progression primært ved hjælp af OARSI- eller Mankin-scoringssystemerne15. Men disse scoringssystemer er kun semikvantitative og kan påvirkes af brugerens subjektivitet. Endnu vigtigere, de undlader præcist at vurdere subtile ændringer, der opstår i leddet under sygdom eller som reaktion på genetisk manipulation eller en terapeutisk intervention. Der er sporadiske rapporter i litteraturen, der beskriver histomorforometriske analyser af brusk, synovium eller subchondral knogle16,17,18,19,20,21. Der mangler imidlertid stadig en detaljeret protokol for streng og reproducerbar histomorfometrisk analyse af alle disse fælles komponenter, hvilket skaber et udækket behov på området.
For at studere patologiske ændringer i OA ved hjælp af histomorfometrisk analyse, brugte vi en kirurgisk OA mus model til at fremkalde OA via destabilisering af den mediale menisk (DMM). Blandt de etablerede modeller af murine OA, DMM blev udvalgt til vores undersøgelse, fordi det indebærer en mindre traumatisk mekanisme af skade22,23,24,25,26. I forhold til menisk-ligamentous skade (MLI) eller forreste korsbånd skade (ACLI) operationer, DMM fremmer en mere gradvis progression af OA, svarende til OA udvikling hos mennesker22,24,25,26. Mus blev aflivet tolv uger efter DMM kirurgi til at evaluere ændringer i ledbrusk, subchondral knogle, og synovium.
Målet med denne protokol er at etablere en standardiseret, stringent og kvantitativ tilgang til evaluering af fælles ændringer, der ledsager OA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tolv uger gamle mandlige C57BL/6 mus blev købt fra Jax Labs. Alle mus var anbragt i grupper på 3-5 mus pr. mikroisolatorbur i et rum med en 12 timers lys/mørk tidsplan. Alle dyreforsøg blev udført i henhold til National Institute of Health (NIH) Guide for pleje og brug af laboratoriedyr og godkendt af Animal Care and Use Committee of Pennsylvania State University.
1. Post-traumatisk slidgigt (PTOA) kirurgisk model
- Bedøve mus ved hjælp af et ketamin (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) kombination via intraperitoneal injektion, administrere buprenorphin (1 mg/kg) via intraperitoneal injektion for smertelindring, og barbere håret over knæet. Kontroller, at der mangler en pedalrefleks, før operationen påbegyndes.
- Udfør destabilisering af den mediale meniskoperation (DMM) som tidligere beskrevet22,23.
BEMÆRK: Se Glasson et al. og Singh et al. referencer for mere detaljerede kirurgiske protokol oplysninger22,23.- Lav et 3 mm langsgående snit fra den distale patella til det proksimale tibial plateau i højre knæled. Brug en sutur til at fortrænge patellar senen.
- Åbn den fælles kapsel mediale til senen og flytte infrapatellar fedt pad til at visualisere intercondylar regionen, mediale menisk, og meniscotibial ledbånd23.
- Transect den mediale meniscotibial ledbånd til at fuldføre DMM og destabilisere den fælles22,23. Luk indsnitstedet med hæfteklammer eller suturer.
- Udfør fingeret operationer efter en lignende procedure, men uden transection af den mediale meniscotibial ledbånd.
BEMÆRK: Mus blev randomiseret til at modtage enten DMM eller fingeret kirurgi. Ifølge den tidligere offentliggjorte litteratur, mus udvikle betydelige PTOA 12 uger efter DMM kirurgi22,23,24.
2. Mus dødshjælp og prøve indsamling
- Mus dødshjælp
- Tolv uger efter DMM, bedøve mus ved hjælp af et ketamin (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) kombination via intraperitoneal injektion.
- Lav et midterliniesnit gennem huden langs brystkassen og træk brystkassen tilbage for at eksponere hjertet for perfusionfiksering27.
BEMÆRK: Se Gage et al. referencen for yderligere oplysninger om protokollen for korrekt fiksering af gnavere samt videoskildringen af den korrekte udstyrssamling og procedurer27. - Indstil perfusionsapparatet i henhold til fabrikantens protokol.
- Euthanize musen ved perfusing heparinized saltvand gennem venstre hjertekammer, indtil blodet er ryddet ud og leveren bliver bleg. Perfuse musen med 10% neutral buffered formalin indtil fuldstændig mus fiksering er opnået.
BEMÆRK: En vellykket perfunderet mus bliver stiv. Den gennemsnitlige perfusionstid ved hjælp af det automatiske pumpesystem er 5-7 min.
- Indsamling og forberedelse af prøver
- Isoler knæene ved at skære knoglen i midten af lårbenet og midten af skinnebenet og dissekere det omgivende muskelvæv.
- Fikseringen fortsættes ved opbevaring af knæled i 10% neutral buffered formalin ved stuetemperatur i 24 timer, derefter ved 4 °C i 6 dage.
- Afkalk knoglen ved opbevaring af prøven i EDTA afkalkningsbuffer i 1 uge ved stuetemperatur med mild omrystning28. Skift afkalkningsbufferopløsningen hver 3.
BEMÆRK: Afkalkningsbufferen blev fremstillet ved at opløse 140 g ultraren EDTA tetranatrium i en opløsning på 850 ml destilleret vand plus 15 ml iseddike. Bufferen blev ekvilibreret til 7,6 ved dråbelig tilsætning af iseddike til opløsningen. Ved at nå pH = 7,6, bufferen blev bragt til 1 L samlede volumen med destilleret vand. Afkalkningsbufferen blev forberedt frisk og blev anvendt inden for 1 uge efter tilberedningen. - Vask knæene med 50% ethanol, derefter 70% ethanol i 15 minutter hver, derefter behandle for indlejring.
BEMÆRK: Fluid overførsel behandling blev udført af molekylære og histopatologisk Kerne på Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Se instituttets histologikerne for at få anbefalinger til optimal prøvebehandling. - Integrer musen knæ i paraffin med den mediale aspekt af den fælles vender den nederste overflade af paraffin blok. Påfør let tryk på leddets tibiale side under indlejring for at sikre, at tibial- og lårbensoverfladerne er så tæt på samme plan som muligt.
3. Mikrotome-skæring og valg af dias
- Mikrotomskæring
- Brug planetjusteringsknapperne på blokholderen på mikrotomen for at sikre, at prøveblokken vender korrekt.
- Face paraffin blok, således at det distale aspekt af lårbenet, proksimale region af skinnebenet, og forreste og bageste horn i den mediale menisk vises i samme plan for sektion indsamling (Supplerende Figur 1A). Begynd at indsamle sektioner på dias, når den første og bageste horn i den mediale menisk begynder at adskille sig fra hinanden.
- Sørg for, at skinnebenet, lårbenet og menisci vises i samme plan ved at sammenligne strukturstørrelser. Skinnebenet og lårbenet skal være af sammenlignelig størrelse, idet begge meniskhorn ligner hinanden i størrelse og form (Supplerende figur 1A). Hvis en struktur ser for stor ud i forhold til dens modstykke, betyder det, at der er behov for yderligere belægning. Vigtigt, bekræft, at det fælles rum forbliver intakt.
- Tag sagittal dele af paraffin-indlejrede mus knæ gennem den mediale fælles rum i 5 μm sektioner og indsamle sektioner på dias. Saml ca. 30 sektioner pr. paraffinblok.
- Valg af slide
- Der vælges tre repræsentative sektioner med en afstand på 50 μm for hver prøve startende fra femte afsnit (dvs. dias 5, 15 og 25). Udvalgte dias vil blive brugt til efterfølgende farvning, OARSI scoring, og histomorphometrisk analyse.
BEMÆRK: Fra en blok med 30 sektioner i alt skal du vælge dias fra begyndelsen (dias 5-10), midt (dias 15-20) og slutningen (dias 25-30) af sættet for klart at repræsentere hele eksemplet. Vælg slides fra lignende dybdeniveauer mellem eksempler.
- Der vælges tre repræsentative sektioner med en afstand på 50 μm for hver prøve startende fra femte afsnit (dvs. dias 5, 15 og 25). Udvalgte dias vil blive brugt til efterfølgende farvning, OARSI scoring, og histomorphometrisk analyse.
4. Hematoxylin, Safranin Orange, og Fast Green farvning
- Deparaffinize de valgte dias med tre ændringer af xylen. Fugt objektglassene med to ændringer på 100% ethanol, to ændringer på 95% ethanol og en ændring på 70% ethanol.
- Plettediasmed hæmatoxylin i 7 min derefter vaskes med rindende vand i 10 min. Pletten med Fast Green i 3 min og skyl i 1,0% iseddike i 10 s. Pletten med Safranin-O i 5 min og skyl hurtigt ved dypning i 0,5% iseddike.
- Skyl objektglassene i to ændringer af destilleret vand, og lad luften tørre.
- Ryd dias i tre ændringer af xylen i 5 min hver derefter montere med xylen-baserede monteringsmedier og en coverslip.
BEMÆRK: Hematoxylin fungerer som den nukleare plet til identifikation af områder af knoglemarv. Safranin-O bruges til at plette brusk, proteoglycans, mucin, og mast celle granulat. Fast Green bruges som en modplet for knogle.
5. Billedbehandling af dias
- Image Safranin-O og Fast Green farvede dias ved hjælp af en tilgængelig kamera knyttet til et mikroskop og computer-baseret billedbehandling software.
- Åbn billedbehandlingssoftwaren (se Materialetabel)og arranger knæleddets interesseområde (ROI) i midten af billedvinduet. Hvis du bruger et rotationsmikroskopslidetrin, skal du justere diaset, så den tibiale overflade strækker sig over bredden af billedområdets vandrette akse.
- Indstil kameraets hvidbalance, før du begynder at afbilde et sæt prøver (Supplerende figur 2). Billede ledrummet ved både 4x og 10x forstørrelse, der sikrer, at både tibial og femoral leddelt overflade og tibial subchondral knogle er inkluderet i hver af billedet ROI(supplerende figur 1A, B). Gem billeder for hvert af de tre valgte niveauer, der skal bruges til OARSI-scoring.
BEMÆRK: Indstilling af hvidbalancen af kameraet vil afhænge af den software og kamera systemer, der anvendes. Generelt skal du navigere til kamerafanen eller menuen Hovedbilledbilleder og rulle ned for at angive hvidbalance. Vælg Angiv hvidbalance, og der skal vises en lille markør eller et lille ikon (Supplerende figur 2A). Brug markøren til at vælge et område i billedet/eksemplet, der er fri for pletter, f.eks.
6. Slidgigt forskningsselskab international (OARSI) scoring15
- Randomiser de tre udvalgte Safranin-O og Fast Green farvede dias fra alle prøver.
- Udfør OARSI scoring i en blindet måde med tre observatører. Kort, vise et billede ad gangen i en randomiseret rækkefølge og lad tre observatører til at score hvert billede, korrelerer med en af de tre niveauer udvalgt for hver prøve.
BEMÆRK: Se oarsi-scoringstabellen for detaljerede beskrivelser af karakterskalaen15. - Beregn den gennemsnitlige score for hver sektion ved hjælp af individuelle score fra hver observatør. Den gennemsnitlige score pr. stikprøve bestemmes ved at tage den gennemsnitlige score for de tre repræsentative sektioner.
7. Histomorfometrisk analyse
BEMÆRK: Levende billeder af knæleddet ses på en touchscreen-skærm ved hjælp af et mikroskopkamera, og en pen bruges til manuelt at spore investeringsafkastet. Indbyggede algoritmer af histomorfinsoftware kvantificerer de angivne parametre (se protokol nedenfor) i de definerede ROI'er. Det er vigtigt, at de samme Safranin-O og Fast Green farvede sektioner, der anvendes i OARSI scoring bruges til histomorphometrisk analyse.
- Forberedelse af softwareopsætning og -måling
- Tænd for mikroskop, kamera, computer og berøringsskærm. Klik på softwareikonet for at starte softwareprogrammet. Placer sliden på mikroskopscenen til visning.
- Centrer prøven i målevinduet. Sørg for, at målegitteret er indstillet til den korrekte forstørrelse, så det svarer til det mål, der anvendes på mikroskopet (supplerende figur 3).
- Gå til fanen Filer øverst på skærmen, og rul ned til Læseindstillinger. Åbn vinduet Indstillinger, og vælg den relevante indstillingsfil for de parametre, der skal måles.
- Vælg den parameter, der skal måles på listen i højre side af skærmen (Supplerende figur 3). Brug pennen eller musemarkøren til at spore billeder i henhold til nedenstående trin for at måle specifikke vævs-ROI'er. Når du er færdig med hver måling, skal du højreklikke for at afslutte målingen og fortsætte til den næste parameter.
BEMÆRK: Listen over parametre, der skal måles, oprettes ved hjælp af en særskilt præferencefil, der er oprettet i samråd med softwarevirksomheden med henblik på at måle de beskrevne investeringsafkast. Se diskussionen for yderligere oplysninger om den komplette opsætning. - Gennemfør alle målinger, og naviger derefter til fanen Oversigtsdata nederst på softwareskærmen (supplerende figur 3). Klik på skærmvinduet, tryk på indsæt-tasten på tastaturet, eller kopiér og indsæt dataene i et separat regneark.
BEMÆRK: Udfør histomorfometrisk analyse på en randomiseret og blindet måde. Når alle parametermålinger for alle prøver er udført, skal du organisere dataene og beregne gennemsnittet af målingerne fra de tre objektglas fra hvert eksempel.
- Målinger af de samlede, forkalkede og uforkalkede bruskområder
BEMÆRK: Brug en kommercielt tilgængelig software (se Materialetabel) til at udføre disse trin. Se supplerende figur 1B,C for afklaring af bruskregioner, vejkryds og subchondral knogleregioner, der er drøftet i hele dette afsnit.- Tegn en linje over den overlegne kant af den tibial bruskoverflade, hvor brusk møder det fælles rum. Der tegner en anden linje ved det chondro-ossøse kryds, hvor den forkalkede brusk opfylder subchondralknoglen (figur 1B). Brug funktionen Område til automatisk at opnå den samlede måling af bruskområdet.
- Tegn en linje langs tidevandsmærket, en naturligt forekommende linje, der adskiller de forkalkede og uforkalkede bruskområder. Der tegner en anden linje ved det chondro-ossøse kryds, hvor den forkalkede brusk opfylder subchondralknoglen (figur 1B). Brug funktionen SoftwareOmråde til automatisk at opnå måling af forkalkede bruskområder.
- Det uforkalkede bruskområde beregnes ved at trække det forkalkede bruskareal fra det samlede bruskområde (figur 1B).
- Bestemmelse af chondrocytnummeret og fænotypen
- Opret separate optællingsfunktioner i indstillingerne i histomorphometri-softwaren for at skelne mellem matrixproducerende og matrixikkeproducerende chondrocytter (figur 1B).
- Det bestemmes, hvor mange matricer der producerer eller ikke producerer chondrocytter, ved at bruge pennen til at lave en lille prik over hver chondrocyt, der udtrykker den angivne fænotype (Figur 1B).
BEMÆRK: Tæl celler efter deres fænotype som enten matrixproducerende (dvs. stærk Safranin-O-farvning) eller matrixikkeproducerende (dvs. meget svag eller ingen Safranin-O-farvning).
- Måling af den tibiale artikulære overfladeomkreds
- Mål den absolutte tibial ledvinkel overflade omkreds ved at spore en linje på tværs af overfladen af den tibial brusk, omhyggeligt definere individuelle fibrillationer (Figur 1C).
- Tegn en anden linje langs tidevandsmærket for at fungere som en intern kontrol for planet for hver sektion (Figur 1C).
- Det tibiale ledikulære overfladefibrilleringsindeks beregnes ved at dividere den tibiale ledfladeomkreds med tidevandsmærkets omkreds.
BEMÆRK: Tidevandsmark-omkredsen er generelt lig med prøver, så forskellen i de artikulære overfladekanter mellem sham og DMM var generelt lille, uanset om der blev anvendt absolut perimeter- eller fibrilleringsindeks.
- Måling af subchondral knogle og marv rumområder
- Delmartodralområdet måles ved hjælp af funktionen Område ved kun at skitsere områder i subchondralregionen, der kun er plettet med hæmatoxylin (dvs. negativt for Fast Green) for at bestemme det samlede marvrumsområde i subchondralknoglen. Tegn linjer omkring omkredsen af disse områder for at bestemme det samlede areal af al marv plads i tibial subchondral knogle (Figur 2B).
- Mål det samlede subchondral område ved hjælp af området funktion ved at skitsere regionen mellem chondro-osseous krydset og den overlegne kant af vækstpladen, der strækker sig sideværts til regionerne i den anterior og posterior osteophytes (Figur 2B).
- Det subchondrale knogleområde beregnes ved at trække det subchondrale knoglemarvsrumsområde fra det samlede subchondralområde (figur 2B,C).
- Måling af de anteriore og bageste osteophyteområder
- For at måle osteophyteområdet skal du spore de bageste og bageste osteophytes i det proksimale skinneben ved hjælp af funktionen Område (Figur 2B,E,F).
BEMÆRK: Osteophytes er knoklede fremskrivninger, der danner mellem ledbrusk og vækstpladen, anterior eller posterior til subchondral regionen. Osteophyte områder på den anterior og bageste sider af skinnebenet bestemmes ved at spore området anterior eller posterior til subchondral knoglen. Krydset mellem osteophytes og subchondral knogle er klart afgrænset af en linje af celler, der strækker sig fra ledbrusk til vækstpladen. Krydset mellem osteophyt og synovium er defineret ved en overgang mellem knoklet og fibrøst væv.
- For at måle osteophyteområdet skal du spore de bageste og bageste osteophytes i det proksimale skinneben ved hjælp af funktionen Område (Figur 2B,E,F).
- Måling af synovialtykkelsen
- Mål den anterior femorale synovial tykkelse ved hjælp af Area funktion ved at trække en linje fra den indre indsættelsepunkt af den anterior synovium på lårbenet mod dens fastgørelsepunkt på menisken (Figur 3B).
- Tegn en anden linje fra den ydre indsættelse af synovium på lårbenet mod dens fastgørelse til menisken (Figur 3B).
- Sregn synovial tykkelsen ved at dividere det samlede synovial område med synovial omkredsen.
8. Statistisk analyse
- De målte parametre indsamles, og resultaterne beregnes i gennemsnit fra de tre repræsentative afsnit for hver prøve. Analysér dataene ved hjælp af en ikke-parret studenterttest for at sammenligne to grupper eller envejs ANOVA for at sammenligne tre eller flere grupper.
- Dataene vises som middel ± standardfejl af middelværdi.
BEMÆRK: Statistisk signifikans blev opnået ved p ≤ 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DMM-induceret OA resulterer i artikulær bruskdegeneration og chondrocyt tab
DMM-induceret OA resulterede i en øget OARSI score sammenlignet med fingerede mus, tydeligt karakteriseret ved overfladeerosion og brusk tab (Figur 1A,D). Histomorftriprotokollen, der er beskrevet her, afslørede flere OA-relaterede ændringer, herunder et fald i det samlede bruskområde og i det ukalkede bruskområde (figur 1A,B,E,G); reduktion i det samlede chondrocytantal og, vigtigere, tab af matrix producerer chondrocytter (Figur 1H,I). Ændringer i ledoverfladen, der indikerer erosionens alvor, blev evalueret ved hjælp af kartilatimerflimren indeks. Samlet set steg fibrilleringsindekset hos DMM-mus (Figur 1C,K,L). Det er dog også vigtigt at bemærke, at fibrilleringsindekset kan falde i slutstadiet OA på grund af fuldstændig erosion af bruskoverfladen, som beskrevet i protokollen. En stigning i fibrilleringsindekset betyder degeneration af ledbrusningsoverfladen under OA-udvikling og progression. Disse resultater fremhæver muligheden for, at det histomororometriske analyseprogram kan registrere og kvantificere patologiske bruskændringer, der karakteriserer OA-progression.
Vurdering af andre fælles ændringer i DMM-induceret OA
OA påvirker andre ledvæv end brusk, og patologiske ændringer i disse væv spiller en afgørende rolle i sygdomsprogression. Her afslørede den beskrevne histomorforometriske analysemetode en stigning i subchondral knogleområdet og en reduktion i området af knoglemarvsrummet i DMM-mus (Figur 2A–D), hvilket indikerer subchondral knoglesklerose29,30. Både de første og bageste osteophyteområder steg også i DMM-mus (figur 2E,F), hvilket tyder på en igangværende subchondral knogleremodellering , der fungerer som en kompenserende mekanisme til håndtering af ændringer i ledbelastningen påskadesstedet 29,30.
Histomorfometrisk analyse af synovium viste øget synovial tykkelse i DMM mus (Figur 3A–C), som er et typisk resultat af OA-associeret synovial inflammation og diffusion af inflammatoriske cytokiner i det fælles rum11,12,31,32,33,34.
Analyse af interbrugervariabilitet mellem OARSI-scoring i forhold til histomorfin
Figur 4A viser ingen signifikant variabilitet mellem brugerne af både histomorfometrisk analyse af det uforkalkede bruskområde (figur 4A) og OARSI-scoren (figur 4B). Den histomororometriske analyse viste imidlertid en ekstremt lav gennemsnitlig forskel mellem observatører fra -0,0001179-0,00120, hvilket førte til en næsten fuldstændig overlapning af de resultater, som de tre observatører opnåede, mens den gennemsnitlige forskel mellem observatører var højere i OARSI-scoren fra -0,3-0,3 med en klar afvigelse på O1-værdierne fra O2- og O3-værdierne.
Figur 1: Histomorftri af tibial ledbrusk og ledbrækkende chondrocyt fænotyper fra fingeret kirurgi og DMM mus. (A) Tibial leddelt overflade plettet med Safranin-O/Fast Green. (B) Histomorfometrisk analyse blev anvendt til at spore det samlede bruskområde og det forkalkede bruskområde (orange). Brusen, der var bedre end tidevandsmarkområdet, blev beregnet som den uforkalkede brusk (grøn). Matrixproducerende chondrocytter (hvide) og matrixikkeproducerende chondrocytter (magenta) blev talt inden for det uforkalkede bruskområde. (C) Den tibiale ledfladeblev målt ved at spore den ledflade (blå linje) efterfulgt af tidevandsmærket (lilla linje) for at bestemme fibrilleringsindekset. (D) OARSI-scoren steg i DMM-mus. (E–L) Grafisk repræsentation af de kvantificerede bruskområder og chondrocyt tællinger fra sham- og DMM-mus. Sammenlignet med sham mus, DMM mus havde faldt total tibial brusk område (E), tibial forkalket brusk område (F), tibial uforkalket brusk (G), tibial samlede chondrocyt nummer (H), tibial matrix producerer chondrocytter, (I) og tibial matrix ikke-producerende chondrocytter (J). Sammenlignet med fingerede mus, DMM mus havde øget tibial ledikulær overflade omkreds (K) og øget tibial ledikulær overflade flimren indeks (L). Billeder blev taget ved hjælp af 10x forstørrelse. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 og ****P < 0,0001 ved hjælp af ikke-parret t-test med Welchs korrektion udtrykkes værdier som middel ± SEM; n = 5/gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Histomorphometri af subchondral knoglemarvsområde og subchondral knogleområde fra fingeret kirurgi og DMM mus. (A) Tibial ledbrusk og subchondral knogle plettet med Safranin-O/Fast Green. (B) De subchondral knoglemarvsområder (grøn), subchondral knogleområde (magenta), anterior osteophyte område (gul), og posterior osteophyte område (grå) blev sporet med beregnet histomorphometri software. (C–F) Graferede histomorfoometriske områder mellem fingeret og DMM mus. Sammenlignet med de falske mus havde DMM-mus et øget tibial subchondral knogleområde (C) og tibial anterior og posterior osteophyte områder (E–F), samt nedsat tibial subchondral knoglemarvsområde sammenlignet med fingermus (D). Billeder blev taget ved hjælp af 4x forstørrelse. *P < 0,05, **P < 0,01 ved hjælp af ikke-parret t-test med Welchs korrektion. Værdierne udtrykkes som gennemsnitlig ± SEM; n = 5/gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Histomorphometri af synovium fra fingeret kirurgi og DMM mus. (A) Synovium farves med Safranin-O/Fast Green. (B) Den synovial tykkelse blev målt ved at spore den anterior meniscofemoral synovial membran på tværs af den anterior aspekt af tibiofemoral fælles (grøn). (C) Grafisk repræsentation af synovial tykkelse målinger ved hjælp af beregnet histomorphometri software. DMM mus havde en øget synovial tykkelse i forhold til fingeret mus. Billeder blev taget ved 20x forstørrelse. P < 0,001 ved hjælp af ikke-parrede t-test med Welchs korrektion udtrykkes værdierne som gennemsnitlig ± SEM; n = 5/gruppe S = synovium; F = lårben; og M = menisk. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Interuservariabilitet i OARSI-scoring i forhold til histomorfometrisk analyse. (A) Målinger af ukalkede bruskområder, der er opnået ved hjælp af histomorfomettri af tre blindede observatører (O1, O2, O3). (B) OARSI-scorer for sham- og DMM-mus fra de tre blindede observatører. De stiplede linjer angiver middelværdien for hver gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Histologisk analyse af Safranin-O og Fast Green farvede musetibiofemoral fælles sektioner. (A) En 4x forstørrelse billede af tibiofemoral fælles. Fokusområder er mærket. (B) Et 10x forstørrelsesbillede af det tibiofemoralske fælles investeringsafkast. De tibiale og lårbensoverflader samt de anteriore og bageste menisk horn visualiseres. Den menisci er omtrent samme størrelse og billeddannelse ROI er centreret om den fælles rum. (C) Et 40x forstørrelsesbillede af den proksimale tibiale overflade. Tidevandsmærkelinjen er mærket som linjen mellem de uforkalkede og forkalkede bruskzoner. Osteochondral krydset er mærket mellem slutningen af den forkalkede brusk og begyndelsen af subchondral knoglen. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2: Histomorphometri system opsætning og kamera hvidbalance kalibrering. (A) Mouse tibiofemoral fælles visualiseret ved 4x forstørrelse i softwarevinduet med hvidbalance ikke indstillet. Bemærk fanen kameraindstillinger øverst på skærmen og valget i rullemenuen for at indstille hvidbalancen. (B)Mouse tibiofemoral fælles ved 4x forstørrelse med hvidbalance sæt. Bemærk ændringen i farve og farvning af prøven, hvilket øger brugerens evne til at skelne visse områder af den tibiofemoral fælles, når de udfører målinger. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 3: Opsætning af histomorfometrisk software forud for histomorfometriske analysemålinger. Repræsentativt skærmbillede af det histomorfometriske softwarevindue. Bemærk, at den farvede museknæsektion er centreret i måleområdet (gult gitter), og den korrekte forstørrelsesskala for området vælges, så den svarer til det mål, der bruges på mikroskopet (cirkel med rødt i øverste højre hjørne af skærmen). Listen over parametre vises i kolonnen til højre for billedbehandlings- og måleområdet. Hvis du vælger en parameter, fremhæves parameteren, og derfor vælges Tibial fibrillering i øjeblikket til at blive målt. Fanen Oversigtsdata nederst i vinduet er det tidspunkt, hvor målinger ne for hver parameter for hver prøve organiseres og gemmes, så de kan eksporteres, når hver parametermåling for hver sektion er afsluttet. Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nylige osteoarthritis forskning har forbedret vores forståelse af krydstale mellem de forskellige væv i den fælles og den rolle hvert væv spiller i sygdomsstart eller progression8,9,10,35,36. Det er derfor blevet klart, at vurderingen af OA ikke bør begrænses til analyse af brusen, men også bør omfatte en analyse af subchondralknoglen og synovium. På trods af dette har ledbrusningen været det primære fokus for semikvantitative scoring af OA15,37,38. Selv om beregnet histomorphometri allerede er blevet anvendt på forskellige områder af muskuloskeletal forskning39,40,41,42,43,44, der er et udækket hul i at beskrive en protokol til præcist og reproducerbart analysere diskrete ændringer i de mange væv i knæleddet rum under OA. Anvendelsen af histomorfometriske analysemålinger til kvantificering af ændringer i brusk, subchondralknogle og synovium giver en mere holistisk vurdering af de primære og sekundære ændringer i OA-leddene.
Her beskriver vi for første gang en detaljeret protokol, der anvender en edb-og semiautomatiseret histomorphometrisk analyse software til at kvantificere patologiske ændringer i forskellige fælles rum og evaluere OA udvikling, progression eller regression. Der bør udvises forsigtighed under prøveforberedelsen, da klare og ensartede Safranin-O- og Fast Green-pletter er afgørende for at begrænse tvetydigheden, når der spores og foretages målinger med histomorfometrisk software. Brug friske farvningsopløsninger til hvert parti af dias er tilrådeligt. Desuden skal valg af dias til farvning finde sted på ensartede niveauer mellem blokke. Det første dias skal tages på et niveau, der ligger mellem prøverne, helst så snart de anteriore og bageste menisk horn begynder at adskille.
Under OA falder den samlede brusk og uforkalkede bruskområder på grund af bruskfibrillering og degeneration. Ved svær OA kan der også forekomme fuldstændig degeneration af den forkalkede brusk. Protokollen fremhæver betydningen af at bestemme chondrocyt fænotype som en vurdering af OA progression for evaluering af anabolske versus kataboliske signalering i brusk. Det samlede antal chondrocytter og antallet af matrixproducerende chondrocytter (anabolske) er højt i normal brusk og lav i OA brusk, hvor størstedelen af de eksisterende chondrocytter i OA er matrix ikke-producerende (katabolisk). Det er vigtigt, at denne vigtige parameter inden for OA terapeutisk opdagelse ikke evalueres af OARSI eller Mankins pointsystemer. Visse interventioner, der ikke kun bevare brusk området og antallet af chondrocytter men også fremme chondrocyt anabolske fænotype kan være mere effektive terapeutiske tilgange.
Protokollen detaljeret her giver også en metode til kvantitativt måle de subtile ændringer i brusk overflade fibriller til stede i mild til moderat OA. Et større antal fibriller betyder en øget perimetermåling på grund af tilstedeværelsen af fordybninger i den artikulære overflade. Således tibial ledikulær overflade omkreds og fibrillation indeks er lav i normal brusk, mellemliggende i mild OA på grund af nogle fibrillationer, høj i moderat OA på grund af mere fibrillerationer, men igen lav i svær OA på grund af fuldstændig brusk degeneration og tab.
Subchondral knogle remodeling og sklerose er karakteristiske patologiske tegn på OA, resulterer i reduceret subchondral marv rumareal og øget subchondral knogleområde8,9,10,29,30. Kvantificering af ændringer i subchondral knogleområdet og subchondral marv rumområde, der er beskrevet i protokollen viser betydningen af at forstå multi-væv ændringer som en drivende komponent for den komplekse karakter af OA sygdom udvikling og progression. Måling af de anteriore og bageste osteophyte områder giver vigtig indsigt i omfanget af knogleremodellering forekommer inden for leddet. Osteophyte området er ekstremt lille i fingerede knæ og øges på grund af osteophyte dannelse i OA. Målingen af det anteriorske osteophyteområde afveg en smule fra målingen af det bageste osteophyteområde på grund af den alvorlige karakter af knogleremodellering, der forekommer i den mediale del af knæet, nær det sted, hvor DMM-skaden finder sted.
Endelig skitserer denne protokol en kvantificerbar vurdering af ændringer i ledmembranen. Synovial tykkelse er lav i fingeret led dens og stigninger i OA. Betændelse i OA fører til fortykkelse af synovialmembranen for at øge leveringen af inflammatoriske cytokiner og andre faktorer til fællesrummet10,11,1231,32. Således er det vigtigt at evaluere ledbetændelse som en modulerende faktor for OA sygdomsprogression.
Brugen af histomorphometri software er begrænset af tilgængeligheden af hardware: touchscreen skærme eller tabletter med en pen er absolut nødvendigt i betragtning af mængden af manuel sporing kræves for at tage nøjagtige målinger. Forsøg på at måle små områder med histomorphometri software kan også begrænse, da pennen størrelse er begrænset til én diameter. Selv om denne manglende evne til at måle små områder kan være ubelejlig, er de målte fælles områder let defineret med områdeværktøjet, og den lave diskrimination af softwaren gør en ubetydelig forskel i den endelige måling.
Det skal også bemærkes, at variabilitet mellem brugerne altid er et område, der giver anledning til bekymring med hensyn til gennemførelsen af en pålidelig og reproducerbar kvantitativ protokol. Etablering af en effektiv, reproducerbar og streng histomorfotriprotokol kræver begrænsning af potentielle blandingsvariabler i forsøgsanalysen, herunder reduktion af interbrugervariabilitet. Men efter en kort træningssession (ca. 30 min) med softwaren, lab medlemmer var i stand til at generere meget konsekvent og reproducerbare målinger, hvor fordelingen af målinger mellem brugerne afspejler mere af en direkte overlay repræsenterer næsten ingen interuser variabilitet. Det er vigtigt, at denne histomorfotriprotokol viser en effektiv metode til at kvantificere selv diskrete forskelle mellem fingerede prøver på en meget reproducerbar måde.
OARSI-pointsystemet er et almindeligt anvendt vurderingsmål for bruskskader hos OA-patienter og eksperimentelle murinemodeller15. Scoringssystemet er baseret på en heltalskala, der primært fokuserer på omfanget af kløfter/erosion eller den kunstneriske overflade. Selv om vi ikke fandt nogen signifikant interuser variabilitet med OARSI score i vores eksperiment, der stadig var en højere gennemsnitlig forskel i mellem observatører, versus næsten ingen i den beskrevne histomorphometri protokol. Ved at fastsætte denne reproducerbare protokol for hisorfoometrisk analyse af definerede parametre kan der således foretages meget ensartede målinger af hver prøve, selv mellem flere brugere, hvilket fjerner noget af stikprøveanalysens subjektive karakter.
OARSI standardiserede scoring system er et benchmark for OA forskning. Systemets begrænsede scorebaserede karakter giver imidlertid ikke mulighed for kvantificering af subtile ændringer, der forekommer inden for leddet. Den udvidede fælles evaluering, der er beskrevet i dette manuskript ved hjælp af histomorfometri software giver en forbedret og mindre subjektiv karakterisering af sværhedsgraden af OA. Denne protokol er optimeret til mus, der har gennemgået en kirurgisk induktion af OA. Procedurerne og teknikkerne kan dog anvendes til evaluering af OA inden for andre modeller og hypoteser.
Sammenfattende giver den protokol, der er beskrevet her, en klar vejledning i en streng og reproducerbar halvautomatisk kvantitativ tilgang til at undersøge OA-patologi eller evaluere terapeutiske indgreb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Vi vil gerne anerkende bistand fra Department of Comparative Medicine personale og molekylær og histopatologi kerne på Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Finansieringskilder: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
References
- Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
- Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
- Lorenz, J., Grässel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S., Coppola, V. 1194, Humana Press. New York, NY. 401-419 (2004).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
- Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
- Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654 (2011).
- Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
- Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632 (2016).
- Martel-Pelletier, J., et al.
- Goldring, M. B., Otero, M.
- Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625 (2010).
- Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
- Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
- Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
- O'Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
- Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
- Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
- Pastoureau, P., Chomel, A. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. 101, Humana Press. New York, NY. 79-91 (2004).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Singh, S. R., Coppola, V. Mouse Genetics: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2004).
- Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413 (2014).
- Culley, K. L., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. Westendorf, J., van Wijnen, A. 1226, Humana Press. New York, NY. 143-173 (2015).
- Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
- Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33 (2011).
- Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
- Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
- De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
- Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028 (2016).
- Lories, R. J., Luyten, F. P.
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
- Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
- Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175 (2018).
- Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
- Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037 (2016).
- Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
- Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).
