Summary
Den nåværende protokollen etablerer en streng og reproduserbar metode for kvantifisering av morfologiske leddendringer som følger med slitasjegikt. Anvendelse av denne protokollen kan være verdifull i overvåking av sykdomsprogresjon og evaluering av terapeutiske inngrep i slitasjegikt.
Abstract
En av de mest utbredte leddforstyrrelsene i USA, slitasjegikt (OA) er preget av progressiv degenerasjon av leddbrusk, hovedsakelig i hofte- og kneleddene, noe som resulterer i betydelige konsekvenser for pasientens mobilitet og livskvalitet. Til dags dato er det ingen eksisterende kurative terapier for OA i stand til å bremse eller hemme bruskdegenerasjon. For tiden er det en omfattende mengde pågående forskning for å forstå OA-patologi og oppdage nye terapeutiske tilnærminger eller agenter som effektivt kan bremse ned, stoppe eller til og med reversere OA. Dermed er det avgjørende å ha en kvantitativ og reproduserbar tilnærming for å nøyaktig evaluere OA-tilknyttede patologiske forandringer i leddbrusk, synovium og subkondral bein. For tiden vurderes OA-alvorlighetsgrad og progresjon primært ved hjelp av Osteoarthritis Research Society International (OARSI) eller Mankin-scoringssystemer. Til tross for viktigheten av disse scoringssystemene, er de semikvantitative og kan påvirkes av brukersubjektivitet. Enda viktigere, de unnlater å nøyaktig vurdere subtile, men viktige, endringer i brusk under de tidlige sykdomstilstander eller tidlige behandlingsfaser. Protokollen vi beskriver her bruker et datastyrt og halvautomatisk histomorfoometrisk programvaresystem for å etablere en standardisert, streng og reproduserbar kvantitativ metodikk for evaluering av fellesendringer i OA. Denne protokollen presenterer et kraftig tillegg til de eksisterende systemene og gir mer effektiv påvisning av patologiske forandringer i leddet.
Introduction
En av de mest utbredte leddforstyrrelser i USA, OA er preget av progressiv degenerasjon av leddbrusk, primært i hofte- og kneledd, noe som resulterer i betydelige konsekvenser for pasientens mobilitet og livskvalitet1,2,3. Leddbrusk er spesialisert bindevev av diartropdiale ledd designet for å minimere friksjon, lette bevegelse og tåle felles kompresjon4. Leddbrusk består av to primære komponenter: kondrocytter og ekstracellulær matrise. Chondrocytes er spesialiserte, metabolsk aktive celler som spiller en primær rolle i utvikling, vedlikehold og reparasjon av den ekstracellulære matrisen4. Chondrocyte hypertrofi (CH) er en av de viktigste patologiske tegn på OA utvikling. Det er preget av økt cellulær størrelse, redusert proteoglykanproduksjon, og økt produksjon av brusk matrise-nedverdigende enzymer som til slutt fører til brusk degenerasjon5,6,7. Videre patologiske forandringer i subkondralbenet og synovium av leddet spiller en viktig rolle i OA utvikling og progresjon8,9,10,11,12. Til dags dato er det ingen eksisterende kurative terapier som hemmer bruskdegenerasjon1,2,3,13,14. Dermed er det omfattende pågående forskning som tar sikte på å forstå OA patologi og oppdage nye terapeutiske tilnærminger som er i stand til å bremse eller til og med stoppe OA. Følgelig er det et økende behov for en kvantitativ og reproduserbar tilnærming som muliggjør nøyaktig evaluering av OA-tilknyttede patologiske forandringer i brusk, synovium og subkondralbein i leddet.
For tiden vurderes OA-alvorlighetsgrad og progresjon primært ved hjelp av OARSI- eller Mankin-poengsystemer15. Disse scoringssystemene er imidlertid bare semikvantitative og kan påvirkes av brukersubjektivitet. Enda viktigere, de unnlater å nøyaktig vurdere subtile endringer som oppstår i leddet under sykdom eller som svar på genetisk manipulasjon eller en terapeutisk intervensjon. Det er sporadiske rapporter i litteraturen som beskriver histomorfoometriske analyser av brusk, synovium, eller subchondral bein16,17,18,19,20,21. Imidlertid mangler en detaljert protokoll for streng og reproduserbar histomorfoometrisk analyse av alle disse felleskomponentene fortsatt, noe som skaper et udekket behov i feltet.
For å studere patologiske forandringer i OA ved hjelp av histomorfoometrisk analyse, brukte vi en kirurgisk OA-musemodell til å indusere OA via destabilisering av medial menisken (DMM). Blant de etablerte modellene av murine OA ble DMM valgt for vår studie fordi det innebærer en mindre traumatisk mekanisme for skade22,23,24,25,26. Sammenlignet med menisk-ligamentskade (MLI) eller fremre korsbåndskade (ACLI) operasjoner, fremmer DMM en mer gradvis progresjon av OA, lik OA-utvikling hos mennesker22,24,25,26. Mus ble euthanized tolv uker etter DMM kirurgi for å evaluere endringer i leddbrusk, subchondral bein, og synovium.
Målet med denne protokollen er å etablere en standardisert, streng og kvantitativ tilnærming til å evaluere felles endringer som følger med OA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tolv uker gamle hannC57BL/6 mus ble kjøpt fra Jax Labs. Alle musene ble plassert i grupper på 3-5 mus per mikroisolatorbur i et rom med en 12 timers lys / mørk tidsplan. Alle dyreprosedyrer ble utført i henhold til National Institute of Health (NIH) Guide for care and use of Laboratory Animals og godkjent av Animal Care and Use Committee of Pennsylvania State University.
1. Posttraumatisk slitasjegikt (PTOA) kirurgisk modell
- Bedøve mus ved hjelp av en ketamin (100 mg/kg)/xylazin (10 mg/kg) kombinasjon via intraperitoneal injeksjon, administrer buprenorfin (1 mg/kg) via intraperitoneal injeksjon for smertelindring, og barber håret over kneet. Kontroller mangelen på en pedalrefleks før operasjonen startes.
- Utfør destabilisering av den mediale meniskoperasjonen (DMM) som tidligere beskrevet22,23.
MERK: Vennligst se Glasson et al. og Singh et al. referanser for mer detaljert kirurgisk protokollinformasjon22,23.- Lag et 3 mm langsgående snitt fra den distale patella til det proksimale tibiale platået i høyre kneledd. Bruk en sutur for å fortrenge patellar senen.
- Åpne leddkapselmedial til senen og flytte infrapatellar fett pad for å visualisere intercondylar regionen, mediale menisk, og meniscotibial ligament23.
- Transect medial meniscotibial ligament for å fullføre DMM og destabilisere leddet22,23. Lukk snittstedet med stifter eller suturer.
- Utfør falske operasjoner etter en lignende prosedyre, men uten transseksjon av det mediale meniscotibial ligamentet.
MERK: Mus ble randomisert til å motta enten DMM eller sham kirurgi. Ifølge den tidligere publiserte litteraturen utvikler mus betydelig PTOA 12 uker etter DMM-operasjonen22,23,24.
2. Mus eutanasi og prøvesamling
- Mus eutanasi
- Tolv uker etter DMM, bedøve mus ved hjelp av en ketamin (100 mg/kg)/xylazin (10 mg/kg) kombinasjon via intraperitoneal injeksjon.
- Lag et mellomsnitt gjennom huden langs thoraxen og trekk tilbake brystkassen for å utsette hjertet for perfusjonsfiksering27.
MERK: Se Gage et al. referanse for ytterligere informasjon om protokollen for riktig gnagerfiksering samt videoskildringen av riktig utstyrsmontering og prosedyrer27. - Sett opp perfusjonsapparatet i henhold til produsentens protokoll.
- Euthanize musen ved å perfusing heparinisert saltvann gjennom venstre ventrikkel til blodet er ryddet ut og leveren blir blek. Perfuse musen med 10% nøytral bufret formalin til fullstendig mus fiksering er oppnådd.
MERK: En vellykket perfundert mus vil bli stiv. Gjennomsnittlig perfusjonstid ved hjelp av det automatiserte pumpesystemet er 5–7 min.
- Prøveinnsamling og forberedelse
- Isoler knærne ved å kutte beinet på midten av femur og mid-tibia og dissekere det omkringliggende muskelvevet.
- Fortsett fikseringen ved å lagre kneledd i 10% nøytralbufret formalin ved romtemperatur i 24 timer, deretter ved 4 °C i 6 dager.
- Avkalk beinet ved å lagre prøven i EDTA avkalkingsbuffer en uke ved romtemperatur med mild risting28. Endre avkalkingsbufferløsningen hver 3.
MERK: Avkalkningsbufferble utarbeidet ved å oppløse 140 g ultraren EDTA tetranatrium i en løsning på 850 ml destillert vann pluss 15 ml iseddiksyre. Bufferen ble pH equilibrated til 7,6 ved dropwise tillegg av iseddiksyre til løsningen. Ved å nå pH = 7,6 ble bufferen brakt til 1 L totalt volum med destillert vann. Avkalkningsbufferen ble tilberedt frisk og brukt innen 1 uke etter forberedelse. - Vask knærne med 50% etanol, deretter 70% etanol i 15 min hver, og behandle deretter for innebygging.
MERK: Væskeoverføringsbehandlingen ble utført av Molecular and Histopathology Core ved Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Ta kontakt med institusjonens histologikjerne for anbefalinger om optimal prøvebehandling. - Bygg museknærne i parafin med det mediale aspektet av leddet vendt mot den nederste overflaten av parafinblokken. Påfør lite trykk på tibialsiden av leddet under innebygging for å sikre at tibiale og lårbensoverflater er så nær samme plan som mulig.
3. Mikrotome snitting og lysbildevalg
- Mikrotomsnitt
- Bruk planjusteringsknottene på blokkholderen på mikrotomen for å sikre riktig oppveid prøveblokken.
- Møt parafinblokken slik at det distale aspektet av lårbenet, proksimal region av tibia, og fremre og bakre horn av medial menisken vises i samme plan for seksjonssamling (Supplerende figur 1A). Begynn å samle seksjoner på lysbilder når de luftrette og bakre hornene til den mediale menisken begynner å skille seg fra hverandre.
- Sørg for at tibia, lårbenet og menisci vises i samme plan ved å sammenligne strukturstørrelser. Tibia og lårbenet bør være av sammenlignbar størrelse, med både menisk horn som ligner i størrelse og form (Supplerende figur 1A). Hvis en struktur vises for stor i forhold til motparten, indikerer dette at det er behov for ekstra vendt. Viktigere, må du bekrefte at fellesrommet forblir intakt.
- Ta sagittal deler av parafin-innebygde museknær gjennom mediale fellesrommet i 5 μm seksjoner og samle delene på lysbilder. Samle ca 30 seksjoner per parafinblokk.
- Valg av lysbilde
- Velg tre representative inndelinger 50 μm fra hverandre for hvert utvalg fra femte del (dvs. lysbilder 5, 15 og 25). Utvalgte lysbilder vil bli brukt for etterfølgende flekker, OARSI-scoring og histomorfoometrisk analyse.
MERK: Velg lysbilder fra begynnelsen (lysbilder 5–10), midten (lysbilder 15–20) og slutter (lysbilder 25–30) av settet for å representere hele eksemplet tydelig. Velg lysbilder fra lignende dybdenivåer mellom eksempler.
- Velg tre representative inndelinger 50 μm fra hverandre for hvert utvalg fra femte del (dvs. lysbilder 5, 15 og 25). Utvalgte lysbilder vil bli brukt for etterfølgende flekker, OARSI-scoring og histomorfoometrisk analyse.
4. Hematoksylin, Safranin Orange og Fast Green farging
- Deparaffiniser de valgte lysbildene med tre endringer i xylen. Hydrer lysbildene med to endringer av 100% etanol, to endringer av 95% etanol, og en endring på 70% etanol.
- Beis lysbildene med hematoksylin i 7 min og vask deretter med rennende vann i 10 min. Beis med fast grønn i 3 min og skyll i 1,0% iseddiksyre i 10 s. Flekk med Safranin-O i 5 min og skyll raskt ved å dyppe i 0,5% iseddiksyre.
- Skyll lysbilder i to endringer av destillert vann og la luften tørke.
- Fjern lysbilder i tre endringer av xylen i 5 min hver deretter montere med xylen-baserte monteringsmedier og en coverslip.
MERK: Hematoksylin fungerer som kjernefysisk flekk for å identifisere områder av benmarg. Safranin-O brukes til å flekke brusk, proteoglykaner, mucin og mastcellegranulat. Fast Green brukes som en motflekk for bein.
5. Skyv bildebehandling
- Bilde Safranin-O og Fast Green farget lysbilder ved hjelp av et tilgjengelig kamera festet til et mikroskop og databasert bildeprogramvare.
- Åpne bildeprogramvaren (se Materialtabellen) og ordne kneleddsområdet av interesse (ROI) i midten av bildevinduet. Hvis du bruker et rotasjonsmikroskoplysbildestadium, justerer du lysbildet slik at tibiale overflaten strekker seg over bredden på den horisontale aksen i bildebehandlingsområdet.
- Angi hvitbalansen til kameraet før du begynner å bilde av et sett med prøver (Tilleggsfigur 2). Bilde fellesrommet ved både 4x og 10x forstørrelse, slik at både tibial og femoral leddoverflate og tibial subkondral bein er inkludert i hvert av bildet ROIer (Supplerende figur 1A, B). Lagre bilder for hvert av de tre valgte nivåene som skal brukes til OARSI-scoring.
MERK: Hvis du angir hvitbalansen til kameraet, avhenger av programvaren og kamerasystemene som brukes. Du kan vanligvis navigere til kamerafanen eller hovedbildemenyen og bla ned for å angi hvitbalanse. Velg Angi hvitbalanse og en liten markør eller et lite ikon skal vises (Tilleggsfigur 2A). Bruk markøren til å velge et område i bildet/prøven som er fri for flekker, for eksempel fellesområdet, for å angi hvitbalansen.
6. Artrose forskningssamfunnet internasjonale (OARSI) scoring15
- Tilfeldigde de tre valgte Safranin-O og Fast Green farget lysbilder fra alle prøver.
- Utfør OARSI-scoring på en blindet måte med tre observatører. Kort, vis ett bilde om gangen i en randomisert rekkefølge og la tre observatører score hvert bilde, korrelerer til ett av de tre nivåene som er valgt for hver prøve.
MERK: Se tabellen for OARSI-scoring for detaljerte beskrivelser av vurderingsskalaen15. - Beregn gjennomsnittspoengsummen for hver del ved hjelp av individuelle poengsummer fra hver observatør. Bestem gjennomsnittlig poengsum per eksempel ved å ta gjennomsnittspoengsummen for de tre representative delene.
7. Histomorfoometrisk analyse
MERK: Levende bilder av kneleddet vises på en berøringsskjerm ved hjelp av et mikroskopkamera, og en pekepenn brukes til å spore ROIene manuelt. Innebygde algoritmer av histomorphometry programvare kvantifisere de angitte parametrene (se Protokoll nedenfor) i de definerte ROIer. Viktigere, de samme Safranin-O og Fast Green farget seksjoner som brukes i OARSI scoring brukes for histomorphometric analyse.
- Forberedelse av programvareoppsett og måling
- Slå på mikroskop, kamera, datamaskin og berøringsskjerm. Klikk på Programvareikonet for å starte programmet. Plasser lysbildet på mikroskopstadiet for visning.
- Midtstill prøven i målevinduet. Kontroller at målegitteret er satt til riktig forstørrelse for å samsvare med målet som brukes på mikroskopet (Supplerende figur 3).
- Gå til Fil-fanen øverst på skjermen, og bla ned til Leseinnstillinger. Åpne Innstillinger-vinduet, og velg riktig innstillingsfil for parameterne som skal måles.
- Velg parameteren som skal måles fra listen på høyre side av skjermen (Tilleggsfigur 3). Bruk pekepennen eller musepekeren til å spore bilder i henhold til trinnene som er beskrevet nedenfor for å måle bestemte vevsROIer. Når du er ferdig med hver måling, høyreklikker du for å avslutte målingen og fortsette til neste parameter.
MERK: Listen over parametere som skal måles opprettes gjennom en distinkt preferansefil som er satt opp i samråd med programvareselskapet med det formål å måle de beskrevne AVKASTNINGENe. Se diskusjon for mer informasjon om hele oppsettet. - Fullfør alle målinger, og naviger deretter til Sammendragsdata-fanen nederst på programvareskjermen (Tilleggsfigur 3). Klikk på skjermvinduet, trykk sett inn-tasten på tastaturet eller kopier og lim inn dataene i et eget regneark.
MERK: Utfør histomorfometrisk analyse på en randomisert og blindet måte. Når du har fullført alle parametermålinger for alle eksempler, organiserer du dataene og gjennomsnittmålene fra de tre lysbildene fra hvert utvalg.
- Målinger av total, forkalket og ikke-forkalket bruskområder
MERK: Bruk en kommersielt tilgjengelig programvare (se Materialtabellen) til å utføre disse trinnene. Se supplerende figur 1B,C for avklaring om bruskregioner, veikryss og subkondralbeinregioner som diskuteres i hele denne delen.- Tegn en linje over den overlegne kanten av tibialbruskoverflaten der brusk møter fellesrommet. Tegn en annen linje ved det kondro-osseous krysset der forkalket brusk møter subkondralbenet (Figur 1B). Bruk programvaren Area-funksjonen til å automatisk få den totale bruskområdet måling.
- Tegn en linje langs tidevannsmerket, en naturlig forekommende linje som skiller de forkalkede og uforkalkede områdene av brusk. Tegn en annen linje ved det kondro-osseous krysset der forkalket brusk møter subkondralbenet (Figur 1B). Bruk programvaren Område-funksjonen til å automatisk få tak i måling av forkalket bruskområde.
- Beregn det uforkalkede bruskområdet ved å trekke det forkalkede bruskområdet fra det totale bruskområdet (figur 1B).
- Bestemmelse av chondrocyte nummer og fenotype
- Lag separate tellefunksjoner i innstillingene i histomorphometry-programvaren for å skille mellom matriseproduksjon og matrise ikke-produserende kondrocytter (Figur 1B).
- Bestem antall matriser som produserer eller ikke produserer kondrocytter ved hjelp av pekepennen for å lage en liten prikk over hver kondrocyte som uttrykker den angitte fenotypen (figur 1B).
MERK: Telle celler i henhold til deres fenotype som enten matriseproduksjon (dvs. sterk Safranin-O-farging) eller matrisenonprodusering (dvs. svært svak eller ingen Safranin-O-farging).
- Måling av tibial leddoverflateomkrets
- Mål den absolutte tibiale leddoverflaten ved å spore en linje over overflaten av tibialbrusk, nøye definere individuelle flimmer (Figur 1C).
- Tegn en annen linje langs tidevannsmerket for å fungere som en intern kontroll for planet i hver seksjon (Figur 1C).
- Beregn den tibiale kuikkel overflateflimmerindeksen ved å dele den tibiale leddoverflaten omkretsen av tidevannsmerket.
MERK: Tidemark-omkretsene er generelt like på tvers av prøver, så forskjellen i leddoverflaten mellom sham og DMM var generelt liten om absolutt perimeter eller flimmerindeks ble brukt.
- Måling av subkondral ben og marg plass områder
- Mål subkondralmargsområde ved hjelp av områdefunksjonen ved å skissere regioner i subkondralområdet som bare er farget med hematoksylin (dvs. negativ for Fast Green) for å bestemme totalt margplass i subkondralbenet. Tegn linjer rundt omkretsen av disse områdene for å bestemme det totale arealet av all margplass i tibial subchondral bein (Figur 2B).
- Mål det totale subkondralområdet ved hjelp av områdefunksjonen ved å skissere regionen mellom kondro-osseous junction og den overordnede grensen til vekstplaten, som strekker seg sidelengs til regionene i fremre og bakre osteophytes (Figur 2B).
- Beregn det subkondrale beinområdet ved å trekke det subkondrale benmargsområdet fra det totale subkondralområdet (figur 2B,C).
- Måling av de anterior og bakre osteophyte områdene
- For å måle osteophyteområdet, spor geromior- og bakre osteophytes av proksimal tibia ved hjelp av områdefunksjonen (Figur 2B,E,F).
MERK: Osteofytter er benete projeksjoner som dannes mellom leddbrusk og vekstplate, fremre eller bakre til subkondralregionen. Osteophyte områder på den anterior og bakre sidene av tibia bestemmes ved å spore området anterior eller bakre til subkondral bein. Krysset mellom osteofytter og subkondralbein er tydelig avgrenset av en linje av celler som strekker seg fra leddbrusk til vekstplaten. Krysset mellom osteophyte og synovium er definert av en overgang mellom benete og fibrøst vev.
- For å måle osteophyteområdet, spor geromior- og bakre osteophytes av proksimal tibia ved hjelp av områdefunksjonen (Figur 2B,E,F).
- Måling av synovial tykkelse
- Mål den framre femorale synovialtykkelsen ved hjelp av områdefunksjonen ved å tegne en linje fra det indre innsettingspunktet til den framre synovium på lårbenet mot festepunktet på menisken (figur 3B).
- Tegn en annen linje fra den ytre innsettingen av synovium på lårbenet mot vedlegget til menisken (figur 3B).
- Beregn synovial tykkelse ved å dele det totale synovialområdet ved synovial omkretsen.
8. Statistisk analyse
- Samle inn de målte parametrene og gjennomsnittlig resultatene fra de tre representative delene for hvert utvalg. Analyser dataene ved hjelp av en uparet students t-test for å sammenligne to grupper eller enveis ANOVA for å sammenligne tre eller flere grupper.
- Vis dataene som gjennomsnitt ± standard feil av gjennomsnittet.
MERK: Statistisk signifikans ble oppnådd ved p ≤ 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DMM-indusert OA resulterer i leddbruskdegenerasjon og konnodrocyte tap
DMM-indusert OA resulterte i økt OARSI-score sammenlignet med shammus, tydelig preget av overflateerosjon og brusktap (figur 1A,D). Den histomorfotoriskprotokollen som er beskrevet her oppdaget flere OA-tilknyttede endringer, inkludert en reduksjon i totalt bruskområde og i det uforkalkede bruskområdet (Figur 1A,B,E,G); reduksjon i det totale kondrocytetallet; og, viktigst, tap av matrise produserende chondrocytes (Figur 1H,I). Endringer i leddoverflaten, som indikerer alvorlighetsgraden av erosjon, ble evaluert ved hjelp av bruskflimmerindeksen. Samlet sett økte flimmerindeksen hos DMM-mus (figur 1C,K,L). Det er imidlertid også viktig å merke seg at flimmerindeksen kan avta i endetrinns OA på grunn av fullstendig erosjon av bruskoverflaten, som omtalt i protokollen. En økning i flimmerindeksen betyr degenerasjon av leddbruskoverflaten under OA-utvikling og progresjon. Disse resultatene fremhever evnen til histomorfoometrisk analyseprogram for å oppdage og kvantifisere patologiske bruskendringer som karakteriserer OA-progresjon.
Vurdering av andre fellesendringer i DMM-indusert OA
OA påvirker annet leddvev enn brusk, og patologiske forandringer i disse vevene spiller en avgjørende rolle i sykdomsprogresjonen. Her viste den beskrevne histomorfoometriske analysemetoden en økning i subkondral benområdet og en reduksjon i området av benmargsrommet i DMM-mus (Figur 2A–D), noe som indikerer subkondral beinsklerose29,30. Både anterior og bakre osteophyte områder også økt i DMM mus (Figur 2E,F), noe som tyder på en pågående subkondral bein remodeling som fungerer som en kompenserende mekanisme for å håndtere endringer i felles lasting på stedet av skade29,30.
Histomorfometrisk analyse av synovium viste økt synovial tykkelse i DMM mus (Figur 3A–C), som er et typisk resultat av OA-assosiert synovial betennelse og diffusjon av inflammatoriske cytokiner i fellesrommet11,,12,,31,,32,33,34.
Analyse av interuser variabilitet mellom OARSI scoring versus histomorphometry
Figur 4A viser ingen signifikant interuservariabilitet av både histomorfometrisk analyse av det ikke-forkalkede bruskområdet (figur 4A) og OARSI-poengsummen (figur 4B). Den histomorfometriske analysen viste imidlertid en ekstremt lav gjennomsnittlig forskjell mellom observatører fra -0,0001179-0,00120, noe som førte til en nesten fullstendig overlapping av resultatene oppnådd av de tre observatørene, mens den gjennomsnittlige forskjellen mellom observatører var høyere i OARSI-poengsummen fra -0,3-0,3 med et klart avvik av O1-verdier fra O2- og O3-verdiene.
Figur 1: Histomorphometry av tibial leddbrusk og leddkondrocyte fenotyper fra sham kirurgi og DMM mus. (A) Tibial leddoverflate farget med Safranin-O/Fast Green. (B) Histomorfoometrisk analyse ble brukt til å spore det totale bruskområdet og det forkalkede bruskområdet (oransje). Brusk som var bedre enn tidevannsområdet ble beregnet som den uforkalkede brusk (grønn). Matrix produserende chondrocytes (hvit) og matrise ikke-produserende chondrocytes (magenta) ble talt innenfor uncalcified brusk området. (C) Den tibiale leddoverflateomkretsen ble målt ved å spore den leddoverflaten (blå linje) etterfulgt av tidevannsmerket (lilla linje) for å bestemme flimmerindeksen. (D) OARSI-skåren økte hos DMM-mus. - Jeg harikkenoeå si. Grafisk representasjon av kvantifiserte bruskområder og konnodrocyte teller fra sham og DMM mus. Sammenlignet med sham mus, DMM mus hadde redusert total tibial brusk området (E), tibial forkalket brusk området (F), tibial uncalcified brusk (G), tibial total chondrocyte antall (H), tibial matrise produsere konpiratytter, (I) og tibial matrise nonproducing chondrocytes (J). Sammenlignet med sham mus, DMM mus hadde økt tibial artikulær overflate omkrets (K) og økt tibial artikulær overflateflimmer indeks (L). Bilder ble tatt ved hjelp av 10x forstørrelse. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 og ****P < 0,0001 ved hjelp av uparet t-test med Welchs rettelse, uttrykkes verdier som gjennomsnitt ± SEM; n = 5/gruppe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Histomorphometry av subkondral benmargsområde og subkondral beinområde fra sham kirurgi og DMM mus. (A) Tibial leddbrusk og subkondral bein farget med Safranin-O/Fast Green. (B) Subchondral benmargområder (grønn), subkondral beinområde (magenta), anterior osteophyte område (gul), og bakre osteophyte område (grå) ble sporet med beregnet histomorphometry programvare. -CJeg har ikke noe åsi. Graferte histomorfoometriske områder mellom sham og DMM mus. Sammenlignet med sham mus, DMM mus hadde en økt tibial subchondral benområdet (C) og tibial anterior og bakre osteophyte områder (E–F), samt redusert tibial subchondral benmarg området sammenlignet med sham mus (D). Bilder ble tatt ved hjelp av 4x forstørrelse. *P < 0,05, **P < 0,01 ved hjelp av uparet t-test med Welchs rettelse. Verdier uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM; n = 5/gruppe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Histomorphometry av synovium fra sham kirurgi og DMM mus. (A) Synovium farget med Safranin-O/ Fast Green. (B) Den synoviale tykkelsen ble målt ved å spore den fremre meniscofemoralske synovialmembranen over det fremre aspektet av tibiofemoralleddet (grønn). (C) Grafisk representasjon av synovial tykkelse målinger ved hjelp av beregnet histomorphometry programvare. DMM mus hadde en økt synovial tykkelse sammenlignet med sham mus. Bilder ble tatt ved 20x forstørrelse. P < 0,001 ved hjelp av uparet t-test med Welchs korreksjon, uttrykkes verdier som gjennomsnitt ± SEM; n = 5/gruppe; S = synovium; F = femur; og M = menisken. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Interuser variabilitet i OARSI scoring versus histomorphometric analyse. (A) Målinger av forkalket bruskområde oppnådd ved hjelp av histomorfoometri av tre blindede observatører (O1, O2, O3). (B) OARSI score for sham og DMM mus hentet fra de tre blinde de tre blinde de observatører. De stiplede linjene betegner gjennomsnittsverdien for hver gruppe. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Histologisk analyse av Safranin-O og Fast Green farget mus tibiofemoral felles seksjoner. (A) Et 4x forstørrelsesbilde av tibiofemoralfelleset. Fokusområder er merket. (B) Et 10x forstørrelsesbilde av tibiofemoral felles avkastning. De tibiale og femorale overflatene samt de fremre og bakre menisk hornene visualiseres. Menisci er omtrent samme størrelse og bilde-avkastningen er sentrert på fellesrommet. (C) Et 40x forstørrelsesbilde av den proksimale tibiale overflaten. Tidevannsmerkelinjen er merket som linjen mellom de ikke-forkalkede og forkalkede brusksonene. Osteokondralkrysset er merket mellom enden av forkalket brusk og begynnelsen av subkondralbenet. Vennligst klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 2: Oppsett av histomorfoomforsøkssystem og kalibrering av kameraets hvitbalanse. (A) Mouse tibiofemoral felles visualisert ved 4x forstørrelse i programvarevinduet med hvitbalanse ikke satt. Legg merke til kamerainnstillingsfanen øverst på skjermen og valget i rullegardinmenyen for å angi hvitbalansen. (B) Mus tibiofemoral felles ved 4x forstørrelse med hvitbalanse satt. Legg merke til endringen i fargelegging og farging av prøven, noe som øker brukerens evne til å skille visse områder av tibiofemoralleddet når du utfører målinger. Vennligst klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende figur 3: Oppsett av histomorfoometrisk programvare før histomorfometriske analysemålinger. Representativt skjermbilde av vinduet histomorfoometrisk programvare. Legg merke til at den fargede museknedelen er sentrert i måleområdet (gult rutenett) og riktig forstørrelsesskala for regionen er valgt for å matche målet som brukes på mikroskopet (sirklet i rødt øverst til høyre på skjermen). Listen over parametere vises i kolonnen til høyre for bilde- og måleområdet. Hvis du velger en parameter, merkes parameteren, og derfor er Tibial Fibrillation valgt å måles. Kategorien Sammendragsdata nederst i vinduet er der målinger for hver parameter for hvert utvalg skal organiseres og lagres for å eksporteres etter fullføring av hver parametermåling for hver del. Vennligst klikk her for å laste ned denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nyere slitasjegikt forskning har forbedret vår forståelse av crosstalk mellom de ulike vev ene i leddet og rollen hvert vev spiller i sykdom initiering eller progresjon8,9,10,35,36. Følgelig har det blitt åpenbart at vurderingen av OA ikke bør begrenses til analyse av brusk, men bør også inkludere analyse av subkondralbenet og synovium. Til tross for det, har leddbrusk vært hovedfokus for semikvantitativ scoring av OA15,37,38. Selv om det allerede er brukt ulike områder av muskel- og skjelettforskning39,40,41,,42,43,44 ,44, er det et udekket gap i å beskrive en protokoll for nøyaktig og reproduserbart analysere diskrete endringer i mangfoldet av vev i kneleddsrommet under OA. Anvendelsen av histomorfoometriske analysemålinger for å kvantifisere endringer i brusk, subkondralbein og synovium gir en mer helhetlig vurdering av de primære og sekundære endringene i OA-leddene.
Her beskriver vi for første gang en detaljert protokoll som benytter en datastyrt og halvautomatisk histomorfoometrisk analyseprogramvare for å kvantifisere patologiske forandringer i forskjellige fellesrom og evaluere OA-utvikling, progresjon eller regresjon. Det bør utvises forsiktighet under prøveforberedelse, da klare og konsekvente Safranin-O- og Fast Green-flekker er avgjørende for å begrense tvetydighet ved sporing og målinger med histomorfoometrisk programvare. Bruk av friske flekker løsninger for hver batch av lysbilder er tilrådelig. I tillegg må lysbildevalg for farging forekomme på konsistente nivåer mellom blokkene. Det første lysbildet må tas på et lignende nivå mellom prøver, ideelt sett så snart de fremre og bakre menisk hornene begynner å skilleseg.
Under OA reduseres total brusk og uforkalket bruskområder på grunn av bruskflimmer og degenerasjon. I alvorlig OA kan fullstendig degenerasjon av forkalket brusk også forekomme. Protokollen fremhever betydningen av å bestemme chondrocyte fenotype som en vurdering av OA progresjon for evaluering av anabole versus katabolske signalering i brusk. Det totale antallet kondrocytter og antall matriseproduserende kondrocytter (anabole) er høyt i normal brusk og lav i OA brusk, hvor flertallet av eksisterende kondrocytter i OA er matrise nonproducing (katabolsk). Viktigere, denne essensielle parameteren innen OA terapeutisk oppdagelse evalueres ikke av OARSI eller Mankins scoringssystemer. Visse intervensjoner som ikke bare bevare brusk området og antall chondrocytes men også fremme chondrocyte anabole fenotypen kan være mer effektive terapeutiske tilnærminger.
Protokollen som er beskrevet her gir også en metode for å kvantitativt måle de subtile endringene i bruskoverflateflimmer som finnes i mild til moderat OA. Et større antall flimmer betyr økt perimetermåling på grunn av tilstedeværelsen av innrykk i leddoverflaten. Dermed er den tibiale artikulære overflateomkretsen og flimmerindeksen lav i normal brusk, mellomliggende i mild OA på grunn av noen flimmer, høy i moderat OA på grunn av flere flimmer, men igjen lav i alvorlig OA på grunn av fullstendig bruskdegenerasjon og tap.
Subchondral bein remodeling og sklerose er karakteristiske patologiske tegn på OA, noe som resulterer i redusert subkondral marg plass område og økt subkondral bein område8,,9,10,29,30. Kvantifisering av endringer i subkondral beinområdet og subkondral margplass området beskrevet i protokollen viser viktigheten av å forstå multi-vev endringer som en drivende komponent for den komplekse natur OA sykdom utvikling og progresjon. Måling av fremre og bakre osteophyte områder gir viktig innsikt i omfanget av bein remodeling skjer i leddet. Osteophyte-området er ekstremt lite i sham-opererte knær og økes på grunn av osteophytedannelse i OA. Måling av det framre osteophyteområdet skilte seg noe fra måling av det bakre osteophyteområdet på grunn av den alvorlige karakteren av beinremodellering som forekommende i det mediale området av kneet, nær stedet for DMM-skade.
Til slutt skisserer denne protokollen en kvantifiserbar vurdering av endringer i synovialmembranen. Synovial tykkelse er lav i sham ledd og øker i OA. Betennelse i OA fører til fortykning av synovialmembranen for å øke leveringen av inflammatoriske cytokiner og andre faktorer til fellesrommet10,,11,1231,32. Dermed er det viktig å evaluere leddbetennelse som en modulerende faktor for OA sykdomsprogresjon.
Bruk av histomorfoometry programvaren er begrenset av tilgjengeligheten av maskinvaren: berøringsskjermer eller tabletter med en pekepenn er helt nødvendig gitt mengden manuell sporing som kreves for å ta nøyaktige målinger. Forsøk på å måle små områder med histomorphometry programvare kan også være begrensende, som pennen størrelsen er begrenset til en diameter. Selv om denne manglende evnen til å måle små områder kan være ubeleilig, er de fellesområdene som måles lett definert med områdeverktøyet, og den lave diskrimineringen av programvaren gjør en ubetydelig forskjell i den endelige målingen.
Det bør også bemerkes at interuser variabilitet er alltid et område av bekymring om gjennomføring av en pålitelig og reproduserbar kvantitativ protokoll. Etablering av en effektiv, reproduserbar og streng histomorfoometry protokoll krever begrense potensielle sammensatte variabler innenfor eksperimentell analyse, inkludert å redusere interuser variabilitet. Men etter en kort treningsøkt (ca. 30 min) med programvaren, kunne laboratoriemedlemmene generere svært konsistente og reproduserbare målinger, hvor fordelingen av målinger mellom brukere gjenspeiler mer av et direkte overlegg som representerer nesten ingen interuservariabilitet. Viktigere, denne histomorphometry protokollen demonstrerer en effektiv metode for å kvantifisere selv diskrete forskjeller mellom falske prøver på en svært reproduserbar måte.
OARSI-skåringssystemet er et vanlig brukt vurderingsmål for bruskskader hos OA-pasienter og eksperimentelle murinemodeller15. Poengsystemet er basert på en heltallsskala som primært fokuserer på omfanget av kløfter/erosjon eller leddoverflaten. Selv om vi ikke fant noen signifikant interuser variabilitet med OARSI score i vårt eksperiment, det fortsatt var en høyere gjennomsnittlig forskjell mellom observatører, versus nesten ingen i den beskrevne histomorphometry protokollen. Dermed kan etablering av denne reproduserbare protokollen for histomorfoometrisk analyse av definerte parametere tillate svært konsekvente målinger av hver prøve, selv mellom flere brukere, fjerne noe av den subjektive karakteren av prøveanalyse.
OARSI standardisert scoring ser ut til å være en målestokk for OA-forskning. Imidlertid tillater ikke systemets begrensede resultatbaserte natur for kvantifisering av subtile endringer som skjer i leddet. Den utvidede felles evalueringen beskrevet i dette manuskriptet ved hjelp av histomorphometry programvare gir en forbedret og mindre subjektiv karakterisering av alvorlighetsgraden av OA. Denne protokollen er optimalisert for mus som har gjennomgått en kirurgisk induksjon av OA. Prosedyrene og teknikkene kan imidlertid brukes til evaluering av OA i andre modeller og hypoteser.
Oppsummert gir protokollen som er beskrevet her en klar veiledning for en streng og reproduserbar halvautomatisk kvantitativ tilnærming til å undersøke OA-patologi eller evaluere terapeutiske inngrep.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Vi vil gjerne anerkjenne hjelp fra Department of Comparative Medicine ansatte og Molecular og Histopathology kjernen på Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Finansieringskilder: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
References
- Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
- Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
- Lorenz, J., Grässel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S., Coppola, V. 1194, Humana Press. New York, NY. 401-419 (2004).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
- Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
- Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654 (2011).
- Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
- Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632 (2016).
- Martel-Pelletier, J., et al.
- Goldring, M. B., Otero, M.
- Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625 (2010).
- Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
- Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
- Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
- O'Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
- Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
- Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
- Pastoureau, P., Chomel, A. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. 101, Humana Press. New York, NY. 79-91 (2004).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Singh, S. R., Coppola, V. Mouse Genetics: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2004).
- Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413 (2014).
- Culley, K. L., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. Westendorf, J., van Wijnen, A. 1226, Humana Press. New York, NY. 143-173 (2015).
- Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
- Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33 (2011).
- Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
- Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
- De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
- Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028 (2016).
- Lories, R. J., Luyten, F. P.
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
- Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
- Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175 (2018).
- Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
- Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037 (2016).
- Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
- Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).
