Summary
Le protocole actuel établit une méthode rigoureuse et reproductible pour la quantification des changements articulaires morphologiques qui accompagnent l’arthrose. L’application de ce protocole peut être utile en surveillant la progression de la maladie et en évaluant les interventions thérapeutiques dans l’arthrose.
Abstract
L’un des troubles articulaires les plus répandus aux États-Unis, l’arthrose (ARTH) se caractérise par une dégénérescence progressive du cartilage articulaire, principalement dans les articulations de la hanche et du genou, ce qui a des répercussions importantes sur la mobilité des patients et la qualité de vie. À ce jour, il n’existe aucune thérapie curative existante pour l’œud de œvé capable de ralentir ou d’inhiber la dégénérescence du cartilage. À l’heure actuelle, il existe un vaste ensemble de recherches en cours pour comprendre la pathologie de l’œd de l’œil et découvrir de nouvelles approches thérapeutiques ou des agents qui peuvent ralentir efficacement, arrêter ou même inverser l’œd de soi. Ainsi, il est crucial d’avoir une approche quantitative et reproductible pour évaluer avec précision les changements pathologiques associés à l’OA dans le cartilage articulaire, le synovium et l’os subchondral. À l’heure actuelle, la gravité et la progression de l’arthrose sont principalement évaluées à l’aide des systèmes internationaux de recherche sur l’arthrose (OARSI) ou Mankin. Malgré l’importance de ces systèmes de notation, ils sont semi-quantitatifs et peuvent être influencés par la subjectivité de l’utilisateur. Plus important encore, ils ne parviennent pas à évaluer avec précision les changements subtils, mais importants, dans le cartilage au cours des premiers états de la maladie ou des phases de traitement précoce. Le protocole que nous décrivons ici utilise un système logiciel histomorphométrique informatisé et semi-automatisé pour établir une méthodologie quantitative normalisée, rigoureuse et reproductible pour l’évaluation des changements conjoints dans l’arthrose. Ce protocole présente un ajout puissant aux systèmes existants et permet une détection plus efficace des changements pathologiques dans l’articulation.
Introduction
L’un des troubles articulaires les plus répandus aux États-Unis, l’arthrose se caractérise par une dégénérescence progressive du cartilage articulaire, principalement dans les articulations de la hanche et du genou, ce qui entraîne des impacts significatifs sur la mobilité des patients et la qualité de vie1,2,3. Le cartilage articulaire est le tissu conjonctif spécialisé des articulations diarthrodiales conçues pour minimiser la friction, faciliter le mouvement et supporter la compression articulaire4. Le cartilage articulaire est composé de deux composants primaires : les chondrocytes et la matrice extracellulaire. Les chondrocytes sont des cellules spécialisées et métaboliquement actives qui jouent un rôle principal dans le développement, l’entretien et la réparation de la matrice extracellulaire4. L’hypertrophie chondrocyte (CH) est l’un des principaux signes pathologiques du développement de l’œd de l’œux. Il est caractérisé par l’augmentation de la taille cellulaire, la diminution de la production de protéoglycan, et l’augmentation de la production d’enzymes de matrice de cartilage dégradant qui mènent par la suite à la dégénérescence du cartilage5,6,7. En outre, les changements pathologiques dans l’os et le synovium subchondral de l’articulation jouent un rôle important dans le développement et la progressionde l’OV 8,9,10,11,12. À ce jour, il n’existe pas de thérapies curatives existantes qui inhibent la dégénérescence du cartilage1,2,3,13,14. Ainsi, il existe des recherches approfondies en cours qui visent à comprendre la pathologie de l’œa et à découvrir de nouvelles approches thérapeutiques qui sont capables de ralentir ou même d’arrêter l’œd de l’œil. En conséquence, il y a un besoin croissant pour une approche quantitative et reproductible qui permet l’évaluation précise des changements pathologiques oA-associés dans le cartilage, le synovium, et l’os subchondral de l’articulation.
Actuellement, la gravité et la progression de l’œd de l’œux sont principalement évaluées à l’aide des systèmes de notation OARSI ou Mankin15. Cependant, ces systèmes de notation ne sont que semi-quantitatifs et peuvent être influencés par la subjectivité de l’utilisateur. Plus important encore, ils ne parviennent pas à évaluer avec précision les changements subtils qui se produisent dans l’articulation pendant la maladie ou en réponse à une manipulation génétique ou une intervention thérapeutique. Il y a des rapports sporadiques dans la littérature décrivant des analyses histomorphométriques du cartilage, du synovium, ou de l’os subchondral16,17,18,19,20,21. Cependant, un protocole détaillé pour l’analyse histomorphométrique rigoureuse et reproductible de tous ces composants articulaires fait encore défaut, créant un besoin non satisfait sur le terrain.
Pour étudier les changements pathologiques dans l’arthrose à l’aide de l’analyse histomorphométrique, nous avons utilisé un modèle chirurgical de souris oA pour induire l’arthrose par déstabilisation du ménisque médial (DMM). Parmi les modèles établis de l’OA murine, DMM a été sélectionné pour notre étude parce qu’il implique un mécanisme moins traumatique de la blessure22,23,24,25,26. Par rapport aux blessures ménisque-ligamentaires (MLI) ou aux chirurgies antérieures des ligaments croisés (ACLI), DMM favorise une progression plus graduelle de l’OA, similaire au développement de l’OA chez l’homme22,24,25,26. Les souris ont été euthanasiées douze semaines après chirurgie de DMM pour évaluer des changements dans le cartilage articulaire, l’os subchondral, et le synovium.
L’objectif de ce protocole est d’établir une approche normalisée, rigoureuse et quantitative pour évaluer les changements conjoints qui accompagnent l’œil de sécurité.
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Protocol
Des souris mâles de 12 semaines C57BL/6 ont été achetées auprès de Jax Labs. Toutes les souris ont été logées dans des groupes de 3-5 souris par cage de micro-isolateur dans une pièce avec un programme clair/foncé de 12 h. Toutes les procédures animales ont été effectuées selon le National Institute of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de Pennsylvanie.
1. Modèle chirurgical post-traumatique d’arthrose (PTOA)
- Anesthésiez les souris utilisant une combinaison de kétamine (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) par injection intrapéritoénique, administrer la buprénorphine (1 mg/kg) par injection intraperitonéale pour soulager la douleur et raser les cheveux sur le genou. Vérifiez l’absence d’un réflexe de pédale avant de commencer l’opération.
- Effectuez la déstabilisation du ménisque médial (DMM) chirurgie comme précédemment décrit22,23.
REMARQUE : Veuillez consulter Glasson et coll. et Singh et coll. références pour des informations plus détaillées sur le protocole chirurgical22,23.- Faire une incision longitudinale de 3 mm de la rotule distale au plateau tibial proximale de l’articulation du genou droit. Utilisez une suture pour déplacer le tendon rotulien.
- Ouvrez la capsule articulaire médiale au tendon et déplacez le coussinet de graisse infrapatellar pour visualiser la région intercondylar, le ménisque médial, et le ligament méiscotibial23.
- Transect le ligament meniscotibial médial pour compléter DMM et déstabiliser l’articulation22,23. Fermez le site d’incision avec des agrafes ou des sutures.
- Effectuez des chirurgies de feinte suivant une procédure semblable, mais sans transection du ligament meniscotibial médial.
REMARQUE : Des souris ont été randomisées pour recevoir la DMM ou la chirurgie fictive. Selon la littérature précédemment publiée, les souris développent PTOA significative 12 semaines après la chirurgie de DMM22,23,24.
2. Euthanasie de souris et collection d’échantillons
- Euthanasie de souris
- Douze semaines après DMM, anesthésiez les souris à l’aide d’une combinaison de kétamine (100 mg/kg)/xylazine (10 mg/kg) par injection intraperitonéale.
- Faire une incision de ligne médiane à travers la peau le long du thorax et rétracter la cage thoracique pour exposer le cœur pour la fixation de perfusion27.
REMARQUE : Consultez la référence Gage et coll. pour obtenir des renseignements supplémentaires sur le protocole de fixation appropriée des rongeurs ainsi que sur la représentation vidéo de l’assemblage et des procédures appropriés de l’équipement27. - Configurez l’appareil de perfusion selon le protocole du fabricant.
- Euthanasez la souris en perfusant saline héparinisée à travers le ventricule gauche jusqu’à ce que le sang soit effacé et que le foie devienne pâle. Perfusez la souris avec 10% de formaline tampon neutre jusqu’à ce que la fixation complète de la souris soit atteinte.
REMARQUE : Une souris perfusée avec succès deviendra raide. Le temps moyen de perfusion à l’aide du système de pompe automatisé est de 5 à 7 min.
- Collection et préparation d’échantillons
- Isoler les genoux en coupant l’os au mi-fémur et au milieu du tibia et disséquer le tissu musculaire environnant.
- Poursuivre la fixation en stockant les articulations du genou dans une formaline tampon neutre à 10 % à température ambiante pendant 24 h, puis à 4 oC pendant 6 jours.
- Décalcifier l’os en stockant l’échantillon dans le tampon de décalcification EDTA pendant 1 semaine à température ambiante avec des secousses légères28. Modifier la solution tampon de décalcification tous les 3 jours.
REMARQUE : Le tampon de décalcification a été préparé en dissolvant 140 g de tétrasodium ultrapure EDTA dans une solution de 850 ml d’eau distillée plus 15 ml d’acide acétique glaciaire. Le tampon a été pH équilibré à 7,6 par ajout dropwise de l’acide acétique glaciaire à la solution. En atteignant le pH de 7,6, le tampon a été porté à 1 L volume total avec de l’eau distillée. Le tampon de décalcification a été préparé frais et utilisé dans la semaine suivant la préparation. - Laver les genoux avec 50% d’éthanol, puis 70% d’éthanol pendant 15 minutes chacun, puis traiter pour l’intégration.
REMARQUE : Le traitement de transfert de fluide a été effectué par le noyau moléculaire et histopathologique au penn State Milton S. Hershey Medical Center. Consultez le noyau d’histologie de l’établissement pour obtenir des recommandations sur le traitement optimal des échantillons. - Incorporer les genoux de souris dans la paraffine avec l’aspect médial de l’articulation face à la surface inférieure du bloc de paraffine. Appliquer une légère pression sur le côté tibial de l’articulation pendant l’intégration pour s’assurer que les surfaces tibiales et fémorales sont aussi proches que possible du même plan.
3. Sélection de sections microtomes et de diapositives
- Sectionnement microtome
- Utilisez les boutons d’ajustement de l’avion sur le support de bloc du microtome pour assurer une face appropriée du bloc d’échantillon.
- Faites face au bloc de paraffine de sorte que l’aspect distal du fémur, région proximale du tibia, et les cornes antérieures et postérieures du ménisque médial apparaissent dans le même plan pour la collecte de section(figure supplémentaire 1A). Commencez à collecter des sections sur des diapositives lorsque les cornes antérieures et postérieures du ménisque médial commencent à se séparer les unes des autres.
- Assurez-vous que le tibia, le fémur et le ménisque apparaissent dans le même plan en comparant la taille de la structure. Le tibia et le fémur doivent être de taille comparable, avec les deux cornes ménisques de taille et de forme similaires(figure supplémentaire 1A). Si une structure semble trop grande par rapport à son homologue, cela indique qu’une face supplémentaire est nécessaire. Surtout, confirmer que l’espace commun reste intact.
- Prenez des sections sagittales des genoux de souris à paraffine à travers le compartiment commun médial en sections de 5 m et collectez les sections sur des toboggans. Recueillir environ 30 sections par bloc de paraffine.
- Sélection de diapositives
- Sélectionnez trois sections représentatives à 50 millions d’euros l’une de l’autre pour chaque échantillon à partir de la cinquième section (c.-à-d. les diapositives 5, 15 et 25). Des diapositives sélectionnées seront utilisées pour la coloration ultérieure, la notation OARSI et l’analyse histomorphométrique.
REMARQUE : À partir d’un bloc de 30 sections totales, sélectionnez des diapositives dès le début (diapositives 5 à 10), milieu (diapositives 15-20) et fin (diapositives 25-30) de l’ensemble afin de représenter clairement l’échantillon entier. Sélectionnez des diapositives à partir de niveaux de profondeur similaires entre les échantillons.
- Sélectionnez trois sections représentatives à 50 millions d’euros l’une de l’autre pour chaque échantillon à partir de la cinquième section (c.-à-d. les diapositives 5, 15 et 25). Des diapositives sélectionnées seront utilisées pour la coloration ultérieure, la notation OARSI et l’analyse histomorphométrique.
4. Hématoxyline, Safranin Orange, et Fast Green colorant
- Déparaffinizez les diapositives sélectionnées avec trois changements de xylène. Hydratez les diapositives avec deux changements d’éthanol à 100 %, deux changements d’éthanol de 95 % et un changement de 70 % d’éthanol.
- Tacher les lames avec de l’hématoxyline pendant 7 min, puis laver avec de l’eau courante pendant 10 min. Tache avec vert rapide pendant 3 min et rincez dans 1,0% d’acide acétique glaciaire pour 10 s. Tache avec Safranin-O pendant 5 min et rincer rapidement en plongeant dans 0,5% d’acide acétique glaciaire.
- Rincer les diapositives dans deux changements d’eau distillée et laisser sécher l’air.
- Effacer les diapositives en trois changements de xylène pendant 5 min chacun, puis monter avec des supports de montage à base de xylène et un coverlip.
REMARQUE : L’hématoxyline sert de tache nucléaire pour identifier les zones de moelle osseuse. Safranin-O est utilisé pour tacher le cartilage, les protéoglycans, la mucine et les granules de mastocytes. Fast Green est utilisé comme comptoir pour l’os.
5. Imagerie par diapositives
- Imagez les diapositives tachées Safranin-O et Fast Green à l’aide d’une caméra disponible attachée à un microscope et à un logiciel d’imagerie informatisé.
- Ouvrez le logiciel d’imagerie (voir Tableau des matériaux) et arrangez la région d’intérêt de l’articulation du genou (ROI) au centre de la fenêtre d’imagerie. Si vous utilisez un stade de diapositives de microscope de rotation, alignez la glissière de sorte que la surface tibiale s’étende sur la largeur de l’axe horizontal de la région d’imagerie.
- Réglez la balance blanche de la caméra avant de commencer à imaginer un ensemble d’échantillons(figure supplémentaire 2). Imagez le compartiment commun au grossissement 4x et 10x, en veillant à ce que la surface articulaire tibiale et fémorale et l’os subchondral tibial soient inclus dans chacune des RIA d’image(figure supplémentaire 1A, B). Enregistrez des images pour chacun des trois niveaux sélectionnés à utiliser pour la notation OARSI.
REMARQUE : La configuration de la balance des blancs de la caméra dépendra du logiciel et des systèmes de caméra utilisés. Généralement, naviguez vers l’onglet appareil photo ou le menu d’imagerie principale et faites défiler vers le bas pour définir la balance des blancs. Sélectionnez Set White Balance et un petit curseur ou icône doit apparaître(figure supplémentaire 2A). À l’aide du curseur, sélectionnez une zone dans l’image/échantillon qui est exempte de taches, comme l’espace commun, pour régler la balance des blancs.
6. Osteoarthritis research society international (OARSI) score15
- Randomisez les trois diapositives tachées Safranin-O et Fast Green sélectionnées de tous les échantillons.
- Effectuez la notation OARSI d’une manière aveuglée avec trois observateurs. En bref, affichez une image à la fois dans un ordre randomisé et permettez à trois observateurs de marquer chaque image, en corrélation avec l’un des trois niveaux sélectionnés pour chaque échantillon.
REMARQUE : Veuillez consulter le tableau de notation OARSI pour des descriptions détaillées de l’échelle de classement15. - Calculez la note moyenne pour chaque section à l’aide de scores individuels de chaque observateur. Déterminer la note moyenne par échantillon en prenant la note moyenne des trois sections représentatives.
7. Analyse histomorphométrique
REMARQUE : Des images en direct de l’articulation du genou sont visionnées sur un écran tactile à l’aide d’une caméra au microscope, et un stylet est utilisé pour retracer manuellement les IPP. Les algorithmes intégrés du logiciel d’histomorphométrie quantifient les paramètres spécifiés (voir protocole ci-dessous) dans les IPP définis. Fait important, les mêmes sections tachées Safranin-O et Fast Green utilisées dans la notation OARSI sont utilisées pour l’analyse histomorphométrique.
- Installation logicielle et préparation de mesure
- Allumez le microscope, la caméra, l’ordinateur et le moniteur à écran tactile. Cliquez sur l’icône logicielle pour lancer le logiciel. Placez la glissière sur la scène du microscope pour le visualiser.
- Centrez l’échantillon dans la fenêtre de mesure. Assurez-vous que la grille de mesure est réglée au grossissement approprié pour correspondre à l’objectif utilisé au microscope(figure supplémentaire 3).
- Accédez à l’onglet Fichier en haut de l’écran et faites défiler vers le bas pour lire les paramètres. Ouvrez la fenêtre Paramètres et sélectionnez le fichier de paramètres approprié pour mesurer les paramètres.
- Sélectionnez le paramètre à mesurer à partir de la liste sur le côté droit de l’écran(figure supplémentaire 3). Utilisez le stylet ou le curseur de souris pour tracer des images selon les étapes décrites ci-dessous afin de mesurer les IPP tissulaires spécifiques. Une fois terminé à chaque mesure, cliquez à droite pour terminer la mesure et continuer au paramètre suivant.
REMARQUE : La liste des paramètres à mesurer est créée à l’un des dossiers de préférence distincts qui est configuré en consultation avec l’éditeur de logiciels dans le but de mesurer les IPP décrits. S’il vous plaît voir la discussion pour plus de détails concernant la configuration complète. - Remplissez toutes les mesures, puis naviguez vers l’onglet Données sommaires au bas de l’écran logiciel(figure supplémentaire 3). Cliquez sur la fenêtre de l’écran, appuyez sur la touche Insert sur le clavier ou copiez et collez les données dans une feuille de calcul distincte.
REMARQUE : Effectuez l’analyse histomorphométrique d’une manière randomisée et aveuglée. Après avoir effectué toutes les mesures de paramètres pour tous les échantillons, organisez les données et faites la moyenne des mesures des trois diapositives de chaque échantillon.
- Mesures des zones de cartilage totales, calcifiées et noncalcifiées
REMARQUE : Utilisez un logiciel disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux) pour effectuer ces étapes. S’il vous plaît voir la figure supplémentaire 1B,C pour des éclaircissements sur les régions de cartilage, les jonctions, et les régions osseuses sous-chondral discutés tout au long de cette section.- Tracez une ligne à travers le bord supérieur de la surface du cartilage tibial où le cartilage rencontre l’espace articulaire. Dessinez une deuxième ligne à la jonction chondro-osélique où le cartilage calcifié rencontre l’os sous-chondral(figure 1B). Utilisez la fonction de zone logicielle pour obtenir automatiquement la mesure totale de la zone du cartilage.
- Tracez une ligne le long de la tache de marée, une ligne naturelle séparant les régions calcifiées et noncalcifiées du cartilage. Dessinez une deuxième ligne à la jonction chondro-osélique où le cartilage calcifié rencontre l’os sous-chondral(figure 1B). Utilisez la fonction de zone logicielle pour obtenir automatiquement la mesure calcifiée de la zone de cartilage.
- Calculer la zone du cartilage noncalcifiée en soustrayant la zone calcifiée du cartilage de la zone totale du cartilage(figure 1B).
- Détermination du nombre de chondrocytes et phénotype
- Créez des fonctions de comptage séparées dans les paramètres du logiciel d’histomorphométrie pour distinguer la production de matrice et les chondrocytes non productifs de matrice(figure 1B).
- Déterminer le nombre de matrices produisant ou ne produisant pas de chondrocytes en utilisant le stylet pour faire un petit point sur chaque chondrocyte exprimant le phénotype spécifié(figure 1B).
REMARQUE : Comptez les cellules selon leur phénotype comme produisant la matrice (c’est-à-dire la coloration forte de Safranin-O) ou la non-production de matrice (c.-à-d. très faible ou pas de coloration Safranin-O).
- Mesure du périmètre de surface articulaire tibial
- Mesurer le périmètre de surface articulaire tibial absolu en traçant une ligne à travers la surface du cartilage tibial, en définissant soigneusement les fibrillations individuelles(figure 1C).
- Tracer une deuxième ligne le long du point de marée pour servir de contrôle interne pour le plan de chaque section(figure 1C).
- Calculez l’indice de fibrillation articulaire tibial de surface en divisant le périmètre de surface articulaire tibial par le périmètre de la balise.
REMARQUE : Les périmètres de tidemark sont généralement égaux à tous les échantillons, de sorte que la différence dans les périmètres de surface articulaires entre la feinte et le DMM était généralement faible, que le périmètre absolu ou l’indice de fibrillation ait été utilisé.
- Mesure des zones subchondrales d’espace d’os et de moelle
- Mesurez la zone d’espace de moelle subchondral en utilisant la fonction de secteur en décrivant des régions dans la région subchondrale tachée avec l’hématoxyline seulement (c.-à-d. négative pour le vert rapide) pour déterminer la zone totale d’espace de moelle dans l’os subchondral. Tracer des lignes autour du périmètre de ces zones pour déterminer la superficie totale de tout l’espace de moelle dans l’os sous-chondral tibial(figure 2B).
- Mesurer la superficie sous-chondrale totale en utilisant la fonction de zone en décrivant la région entre la jonction chondro-oségeoise et la bordure supérieure de la plaque de croissance, s’étendant latéralement aux régions des ostéophytes antérieurs et postérieurs(figure 2B).
- Calculer la zone osseuse sous-chondrale en soustrayant la zone d’espace de moelle osseuse sous-chondrale de la zone sous-chondrale totale(figure 2B,C).
- Mesure des zones antérieures et postérieures d’ostéophyte
- Pour mesurer la zone ostéophyte, tracez les ostéophytes antérieurs et postérieurs du tibia proximale à l’aide de la fonction de zone (figure 2B,E,F).
REMARQUE : Les ostéophytes sont des projections osseuses qui se forment entre le cartilage articulaire et la plaque de croissance, antérieure ou postérieure à la région subchondrale. Les secteurs d’ostéophyte sur les côtés antérieurs et postérieurs du tibia sont déterminés en traçant la zone antérieure ou postérieure à l’os subchondral. La jonction entre les ostéophytes et l’os subchondral est clairement délimitée par une ligne de cellules s’étendant du cartilage articulaire à la plaque de croissance. La jonction entre l’ostéophyte et le synovium est définie par une transition entre le tissu osseux et le tissu fibreux.
- Pour mesurer la zone ostéophyte, tracez les ostéophytes antérieurs et postérieurs du tibia proximale à l’aide de la fonction de zone (figure 2B,E,F).
- Mesure de l’épaisseur synoviale
- Mesurer l’épaisseur synoviale fémorale antérieure à l’aide de la fonction zone en dessinant une ligne du point d’insertion interne du synovium antérieur sur le fémur vers son point d’attachement sur le ménisque(figure 3B).
- Tracer une deuxième ligne de l’insertion externe du synovium sur le fémur vers son attachement au ménisque(figure 3B).
- Calculez l’épaisseur synoviale en divisant la zone synoviale totale par le périmètre synovial.
8. Analyse statistique
- Recueillir les paramètres mesurés et la moyenne des résultats des trois sections représentatives pour chaque échantillon. Analyser les données à l’aide du t-test d’un étudiant non appréré pour comparer deux groupes ou ANOVA à sens unique pour comparer trois groupes ou plus.
- Afficher les données comme moyen - erreur standard de moyenne.
REMARQUE : L’importance statistique a été atteinte à p . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Representative Results
L’OA induit par DMM entraîne une dégénérescence articulaire du cartilage et une perte de chondrocyte
L’OA induit par le DMM a entraîné une augmentation du score d’OARSI par rapport aux souris simulées, caractérisées distinctement par l’érosion de surface et la perte de cartilage(figure 1A,D). Le protocole d’histomorphométrie détaillé ici a détecté plusieurs changements associés à l’OA, y compris une diminution de la région totale du cartilage et dans la région noncalcifiée du cartilage(figure 1A,B,E,G); réduction du nombre total de chondrocytes; et, surtout, la perte de matrice produisant des chondrocytes (Figure 1H,I). Des changements à la surface articulaire, indicatif de la sévérité de l’érosion, ont été évalués à l’aide de l’indice de fibrillation du cartilage. Dans l’ensemble, l’indice de fibrillation a augmenté chez les souris DMM(figure 1C,K,L). Cependant, il est également important de noter que l’indice de fibrillation peut diminuer dans l’OA de phase finale en raison de l’érosion complète de la surface du cartilage, comme discuté dans le Protocole. Une augmentation de l’indice de fibrillation signifie la dégénérescence de la surface articulaire du cartilage pendant le développement et la progression d’OA. Ces résultats mettent en évidence la capacité du programme d’analyse histomorphométrique à détecter et à quantifier les changements pathologiques du cartilage qui caractérisent la progression de l’arthrose.
Évaluation d’autres changements conjoints dans l’OA induit par le DMM
L’œil affecte les tissus articulaires autres que le cartilage, et les changements pathologiques dans ces tissus jouent un rôle crucial dans la progression de la maladie. Ici, la méthode d’analyse histomorphométrique décrite a indiqué une augmentation de la zone d’os subchondral et une réduction de la zone de l’espace de moelle osseuse chez les souris DMM(figure 2A-D), indiquant la sclérose osseuse sous-chondrale29,30. Les zones d’ostéophyte antérieurs et postérieures ont également augmenté chez les souris DMM(figure 2E,F), suggérant un remodelage subchondral continu d’os qui agit comme mécanisme compensatoire pour gérer les changements dans le chargement articulaire au site de la blessure29,30.
L’analyse histomorphométrique du synovium a montré l’épaisseur synoviale accrue chez les souris DMM(figure 3A-C), qui est un résultat typique de l’inflammation synoviale associée à l’OA et la diffusion de cytokines inflammatoires dans l’espace articulaire11,12,31,32,33,34.
Analyse de la variabilité interuser entre la notation OARSI par rapport à l’histomorphométrie
La figure 4A ne montre aucune variabilité interuser significative de l’analyse histomorphométrique de la zone du cartilage noncalcifiée(figure 4A) et du score OARSI(figure 4B). Toutefois, l’analyse histomorphométrique a montré une différence moyenne extrêmement faible entre les observateurs allant de -0,0001179-0,00120, ce qui a conduit à un chevauchement presque complet des résultats obtenus par les trois observateurs, tandis que la différence moyenne entre les observateurs était plus élevée dans le score OARSI allant de -0,3 à 0,3 avec une nette déviation des valeurs O1 de O2 et O3 valeurs.
Figure 1 : Histomorphometry du cartilage articulaire tibial et phénotypes articulaires de chondrocyte de la chirurgie de faux et des souris DMM. (A) Surface articulaire tibiale tachée de Safranin-O/Fast Green. (B) L’analyse histomorphométrique a été utilisée pour retracer la région totale de cartilage et la zone calcifiée de cartilage (orange). Le cartilage supérieur à la zone de la marée a été calculé comme le cartilage noncalcifié (vert). Les chondrocytes producteurs de matrice (blanc) et les chondrocytes non productifs de matrice (magenta) ont été comptés dans la région noncalcifiée de cartilage. (C) Le périmètre de surface articulaire tibial a été mesuré en traçant la surface articulaire (ligne bleue) suivie du galets (ligne violette) pour déterminer l’indice de fibrillation. (D) Le score OARSI a augmenté chez les souris DMM. (E-L) Représentation graphique des zones quantifiées de cartilage et des comptes de chondrocyte des souris de simulacre et de DMM. Comparé aux souris sham, les souris DMM avaient diminué la zone totale de cartilage tibial (E), zone de cartilage calcifié tibial (F), cartilage non évolutif tibial (G), nombre total de chondrocyte tibial (H), matrice tibiale produisant des chondrocytes, (I) et la matrice tibiale non productrice chondrocytes (J). Comparées aux souris simulées, les souris DMM avaient augmenté le périmètre articulaire tibial de surface (K) et augmenté l’indice articulaire de fibrillation de surface tibial (L). Des images ont été prises à l’aide d’un grossissement 10x. 'P’lt; 0.05, 'P’lt; 0.01, 'P 'lt; 0.001, et 'P 'lt; 0.0001 en utilisant non appired t-test avec la correction de Welch, les valeurs sont exprimées comme moyennes ' SEM; n 5/groupe. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Histomorphometry of subchondral bone marrow area and subchondral bone area from sham surgery and DMM mice. (A) cartilage articulaire tibial et os sous-chondral tachés de Safranin-O/Fast Green. (B) Les secteurs subchondral de moelle (vert), secteur subchondral d’os (magenta), secteur antérieur d’ostéophyte (jaune), et secteur postérieur d’ostéophyte (gris) ont été tracés avec le logiciel de histomorphometry calculé. (C-F) Graphique des zones histomorphométriques entre les souris sham et DMM. Comparé aux souris de feinte, les souris de DMM ont eu une zone d’os subchondral tibial accrue (C) et les secteurs antérieurs et postérieurs d’ostéophyte (E-F), aussi bien que la zone de moelle inférieure tibiale de subchondral comparée aux souris sham (D). Des images ont été prises à l’aide du grossissement 4x. -P’lt; 0.05, 'P 'lt; 0.01 en utilisant un t-test non appréré avec la correction de Welch. Les valeurs sont exprimées comme moyennes et SEM; n 5/groupe. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Histomorphométrie du synovium de la chirurgie fictive et des souris DMM. (A) Synovium taché de Safranin-O/Fast Green. (B) L’épaisseur synoviale a été mesurée en traçant la membrane synoviale meniscofemoral antérieure à travers l’aspect antérieur de l’articulation tibiofemorale (verte). (C) Représentation graphique des mesures d’épaisseur synoviale à l’aide d’un logiciel d’histomorphométrie calculé. Les souris DMM ont eu une épaisseur synoviale accrue comparée aux souris de faux. Des images ont été prises au grossissement 20x. P 'lt; 0.001 en utilisant le t-test non appréhectionné avec la correction de Welch, les valeurs sont exprimées comme moyennes ' SEM; n 5/groupe; Synovium; F et fémur; et M - ménisque. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Variabilité interuser dans la notation OARSI par rapport à l’analyse histomorphométrique. (A) Mesures noncalcifiées de secteur de cartilage obtenues utilisant l’histomorphométrie par trois observateurs aveuglés (O1, O2, O3). (B) OARSI scores pour les souris de faux et DMM obtenues des trois observateurs aveuglés. Les lignes pointillées indiquent la valeur moyenne pour chaque groupe. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1 : Analyse histologique des sections articulaires tibiofemorales de souris tachées De Safranin-O et Fast Green. (A) Une image de grossissement 4x de l’articulation tibiofemorale. Les domaines d’intérêt sont étiquetés. (B) A 10x image de grossissement du roi d’articulation tibiofemoral. Les surfaces tibiales et fémorales ainsi que les cornes ménisques antérieures et postérieures sont visualisées. Les ménisques sont à peu près de la même taille et le retour sur investissement d’imagerie est centré sur le compartiment commun. (C) Une image de grossissement 40x de la surface tibiale proximale. La ligne de repère de marée est étiquetée comme ligne entre les zones de cartilage non calcifiées et calcifiées. La jonction ostéochondral est étiquetée entre l’extrémité du cartilage calcifié et le début de l’os subchondral. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Figure supplémentaire 2 : Configuration du système d’histomorphométrie et étalonnage de la balance des blancs de la caméra. (A) Souris tibiofemoral joint visualisé à grossissement 4x dans la fenêtre logicielle avec la balance des blancs pas réglé. Notez l’onglet paramètres de la caméra en haut de l’écran et la sélection dans le menu de décrochage pour définir la balance des blancs. (B) Mur souris tibiofemoral joint à 4x grossissement avec équilibre des blancs ensemble. Notez le changement dans la coloration et la coloration de l’échantillon, ce qui augmente la capacité de l’utilisateur à distinguer certaines zones de l’articulation tibiofemorale lors de l’exécution des mesures. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
Figure supplémentaire 3 : Configuration d’un logiciel histomorphométrique avant les mesures d’analyse histomorphométrique. Capture d’écran représentative de la fenêtre logicielle histomorphométrique. Notez que la section du genou taché de souris est centrée dans la région de mesure (grille jaune) et l’échelle de grossissement correcte pour la région est sélectionnée pour correspondre à l’objectif utilisé au microscope (encerclé en rouge dans le coin supérieur droit de l’écran). La liste des paramètres est affichée dans la colonne à droite de la zone d’imagerie et de mesure. La sélection d’un paramètre mettra en évidence le paramètre, d’où la fibrillation tibiale est actuellement sélectionnée pour être mesurée. L’onglet Données sommaires au bas de la fenêtre est l’endroit où les mesures pour chaque paramètre pour chaque échantillon seront organisées et enregistrées pour être exportées après l’achèvement de chaque mesure de paramètres pour chaque section. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.
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Discussion
La recherche récente sur l’arthrose a amélioré notre compréhension de la traque entre les différents tissus de l’articulation et le rôle que chaque tissu joue dans l’initiation ou la progression de la maladie8,9,10,35,36. Par conséquent, il est devenu évident que l’évaluation de l’œil ne devrait pas se limiter à l’analyse du cartilage, mais devrait également inclure l’analyse de l’os sous-chondral et le synovium. Malgré cela, le cartilage articulaire a été le principal objectif de la notation semi-quantitative de l’OA15,37,38. Bien que l’histomorphométrie calculée ait déjà été appliquée à divers domaines de la recherche musculo-squelettique39,40,41,42,43,44,il y a une lacune non satisfaite dans la description d’un protocole pour analyser avec précision et reproductiblement des changements discrets à la multitude de tissus dans le compartiment articulaire du genou pendant l’OA. L’application des mesures d’analyse histomorphométrique pour quantifier les changements au cartilage, à l’os sous-chondral et au synovium fournit une évaluation plus holistique des changements primaires et secondaires des articulations d’OA.
Ici, nous décrivons pour la première fois un protocole détaillé qui utilise un logiciel d’analyse histomorphométrique informatisé et semi-automatique pour quantifier les changements pathologiques dans différents compartiments communs et évaluer le développement, la progression ou la régression de l’OA. Il faut faire attention lors de la préparation de l’échantillon, car des taches Safranin-O et Fast Green claires et cohérentes sont essentielles pour limiter l’ambiguïté lors du traçage et de la prise de mesures avec un logiciel histomorphométrique. L’utilisation de solutions de coloration fraîches pour chaque lot de diapositives est conseillée. En outre, la sélection de diapositives pour la coloration doit se produire à des niveaux cohérents entre les blocs. La première diapositive doit être prise à un niveau similaire entre les échantillons, idéalement dès que les cornes ménisques antérieures et postérieures commencent à se séparer.
Pendant l’œux, le cartilage total et les zones noncalcifiées de cartilage diminuent en raison de la fibrillation et de la dégénérescence du cartilage. Dans l’œil grave, la dégénérescence complète du cartilage calcifié peut également se produire. Le protocole souligne l’importance de déterminer le phénotype de chondrocyte comme évaluation de la progression d’OA pour l’évaluation de la signalisation anabolisante contre catabolique dans le cartilage. Le nombre total de chondrocytes et le nombre de chondrocytes producteurs de matrices (anabolisants) sont élevés dans le cartilage normal et faibles dans le cartilage d’OA, où la majorité des chondrocytes existants dans l’OA sont non-produisants de matrice (catabolique). Il est important de noter que ce paramètre essentiel dans le domaine de la découverte thérapeutique de l’OA n’est pas évalué par l’OARSI ou les systèmes de notation de l’humanité. Certaines interventions qui non seulement préservent la région du cartilage et le nombre de chondrocytes, mais aussi favorisent le phénotype anabolisant de chondrocyte peut être des approches thérapeutiques plus efficaces.
Le protocole détaillé ici fournit également une méthode pour mesurer quantitativement les changements subtils dans les fibrillations de surface de cartilage présentes dans l’œux légère à modérée. Un plus grand nombre de fibrillations signifie une mesure de périmètre accrue due à la présence d’indentations dans la surface articulaire. Ainsi, le périmètre de surface articulaire tibial et l’indice de fibrillation sont bas dans le cartilage normal, intermédiaire dans l’œil doux dû à quelques fibrillations, élevées dans l’OA modéré en raison de plus de fibrillations, mais encore une fois faible dans l’OA grave due à la dégénérescence et la perte complètes de cartilage.
Le remodelage et la sclérose subchondral d’os sont des signes pathologiques caractéristiques de l’IA, ayant pour résultat une zone d’espace sous-chondral réduite et une zone d’os subchondral accrue8,,9,10,29,30. La quantification des changements dans la région subchondral d’os et la zone subchondrale d’espace de moelle décrite dans le protocole démontrent l’importance de comprendre les changements multi-tissus comme composant moteur pour la nature complexe du développement et de la progression de la maladie d’OA. La mesure des secteurs antérieurs et postérieurs d’ostéophyte fournit un aperçu important de l’échelle du remodelage d’os se produisant dans l’articulation. La région ostéophyte est extrêmement petite dans les genoux simulés et est augmentée en raison de la formation d’ostéophyte dans l’œd de l’œil. La mesure de la zone antérieure d’ostéophyte différait légèrement de la mesure de la zone postérieure d’ostéophyte due à la nature grave du remodelage d’os se produisant à la région médiale du genou, près du site des dommages de DMM.
Enfin, ce protocole décrit une évaluation quantifiable des changements dans la membrane synoviale. L’épaisseur synoviale est faible en articulations fictives et augmente dans l’OA. L’inflammation dans l’œuvre d’oS conduit à l’épaississement de la membrane synoviale pour augmenter la livraison de cytokines inflammatoires et d’autres facteurs à l’espace articulaire10,11,1231,32. Ainsi, il est essentiel d’évaluer l’inflammation articulaire comme facteur modulant de la progression de la maladie d’OA.
L’utilisation du logiciel d’histomorphométrie est limitée par la disponibilité du matériel : les moniteurs à écran tactile ou les tablettes avec un stylet sont absolument nécessaires étant donné la quantité de traçage manuel nécessaire pour prendre des mesures précises. Tenter de mesurer de petites zones avec le logiciel d’histomorphométrie peut également être limitant, car la taille du stylo est limitée à un diamètre. Bien que cette incapacité à mesurer de petites zones puisse être gênante, les zones communes mesurées sont facilement définies avec l’outil de zone, et la faible discrimination du logiciel fait une différence négligeable dans la mesure finale.
Il convient également de noter que la variabilité interutiliser est toujours un sujet de préoccupation concernant la mise en œuvre d’un protocole quantitatif fiable et reproductible. L’établissement d’un protocole efficace, reproductible et rigoureux d’histomorphométrie exige de limiter les variables complexes potentielles dans l’analyse expérimentale, y compris la réduction de la variabilité interuser. Cependant, après une courte séance de formation (environ 30 min) avec le logiciel, les membres du laboratoire ont été en mesure de générer des mesures très cohérentes et reproductibles, où la distribution des mesures entre les utilisateurs reflète plus d’une superposition directe représentant presque aucune variabilité interutilisante. Fait important, ce protocole d’histomorphométrie démontre une méthode efficace pour quantifier même les différences discrètes entre les échantillons fictifs d’une manière hautement reproductible.
Le système de notation OARSI est une mesure couramment utilisée de l’évaluation des dommages de cartilage dans les patients d’OA et les modèles murins expérimentaux15. Le système de notation est basé sur une échelle de nombre entier principalement axée sur l’étendue des fissures/érosion ou la surface articulaire. Bien que nous n’ayons trouvé aucune variabilité interuser significative avec les scores DARSI dans notre expérience, il y avait encore une différence moyenne plus élevée entre les observateurs, contre presque aucun dans le protocole décrit d’histomorphométrie. Ainsi, l’établissement de ce protocole reproductible pour l’analyse histomorphométrique de paramètres définis permet des mesures très cohérentes de chaque échantillon, même entre plusieurs utilisateurs, en supprimant une partie de la nature subjective de l’analyse de l’échantillon.
Le système de notation standardisé OARSI est une référence pour la recherche sur l’œga. Cependant, la nature limitée basée sur le score du système ne permet pas la quantification des changements subtils qui se produisent au sein de l’articulation. L’évaluation conjointe élargie décrite dans ce manuscrit à l’aide d’un logiciel d’histomorphométrie fournit une caractérisation améliorée et moins subjective de la gravité de l’œd de l’œil. Ce protocole est optimisé pour les souris qui ont subi une induction chirurgicale de l’œdage de l’œux. Les procédures et les techniques peuvent être appliquées pour l’évaluation de l’œd de l’œil dans d’autres modèles et hypothèses, cependant.
En résumé, le protocole détaillé ici fournit un guide clair pour une approche quantitative semi-autonome rigoureuse et reproductible pour étudier la pathologie de l’œil ou évaluer les interventions thérapeutiques.
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Disclosures
Aucun
Acknowledgments
Nous tenons à remercier l’aide du personnel du Département de médecine comparée et du noyau moléculaire et histopathologique du Penn State Milton S. Hershey Medical Center. Sources de financement : NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
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