Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מתוקננת הערכה היסטראורמטרית של אוסטיאוארתריטיס במודל עכבר כירורגי

Published: May 6, 2020 doi: 10.3791/60991
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,3
1Center for Orthopedic Research and Translational Sciences, Department of Orthopedics and Rehabilitation, Pennsylvania State College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Pennsylvania State College of Medicine, 3Department of Pharmacology, Pennsylvania State College of Medicine

Summary

הפרוטוקול הנוכחי יוצר שיטה קפדנית ומתוכנות לכמת של שינויים מורפולוגיים המלווים אוסטיאוארתריטיס. יישום פרוטוקול זה יכול להיות בעל ערך בניטור התקדמות המחלה והערכת התערבויות טיפוליות אוסטיאוארתריטיס.

Abstract

אחת ההפרעות המשותפת הנפוצות ביותר בארצות הברית, אוסטיאוארתריטיס (OA) מאופיין על ידי ניוון פרוגרסיבי של סחוס משני, בעיקר הירך ואת המפרקים בברך, אשר התוצאה משפיע משמעותית על ניידות המטופל איכות החיים. עד כה, אין טיפולים מרפא קיימים עבור OA מסוגל להאט או לעכב ניוון הסחוס. כיום, יש גוף נרחב של מחקר מתמשך להבין פתולוגיה OA לגלות גישות טיפוליות הרומן או סוכנים שיכולים ביעילות להאט, לעצור, או אפילו הפוכה OA. לפיכך, חיוני לקבל גישה כמותית ומשובת להעריך במדויק שינויים פתולוגיים המשויכים OA הסחוס המפרק, synovium, ו subchondral bone. כיום, חומרת OA והתקדמות מוערך בעיקר באמצעות החברה מחקר אוסטיאוארתריטיס הבינלאומי (OARSI) או מנצ מערכות הניקוד. למרות החשיבות של מערכות הניקוד הללו, הן כמותיים למחצה ויכולות להיות מושפעות מסובייקטיביות של המשתמש. חשוב מכך, הם לא מצליחים להעריך במדויק מעודן, אך חשובות, שינויים בסחוס במהלך מצבי המחלה המוקדמים או שלבי הטיפול המוקדמים. הפרוטוקול שאנו מתארים כאן משתמש במערכת תוכנה ממוחשבת וחצי אוטומטית ליצירת מתודולוגיה כמותית מתוקננת ומחמירה להערכת שינויים משותפים ב OA. פרוטוקול זה מציג תוספת רבת עוצמה למערכות הקיימות ומאפשר זיהוי יעיל יותר של שינויים פתולוגיים במפרק.

Introduction

אחת ההפרעות המשותפת הנפוצות ביותר בארצות הברית, OA מאופיין על ידי ניוון פרוגרסיבי של סחוס משני, בעיקר הירך ואת מפרקי הברך, אשר תוצאות השפעות משמעותיות על ניידות המטופל איכות החיים1,2,3. סחוס מעבר העור הוא רקמת החיבור המקצועית של המפרקים diarthrodial נועד למזער את החיכוך, להקל על התנועה, ולסבול דחיסה משותפת4. הסחוס הראשי מורכב משני מרכיבים עיקריים: כונדרוציטים ו מטריקס מסחטות. כונדרוציטים הם התמחה, metabolically תאים פעילים המשחק תפקיד עיקרי בפיתוח, תחזוקה, ותיקון של מטריצה החילוץ4. היפרפרס כונדרוציטים (CH) הוא אחד הסימנים הפתולוגיים העיקריים של התפתחות OA. הוא מאופיין על ידי גודל הסלולר גדל, ירידה בייצור פרוטאוגליקן, וייצור מוגבר של אנזימים מכמטריקס משפיל הסחוס כי בסופו של דבר להוביל את ניוון הסחוס5,6,7. עוד, שינויים פתולוגיים בעצם subchondral ו synovium של משותף לשחק תפקיד חשוב בפיתוח OA התקדמות8,9,10,11,12. עד כה, אין טיפולים מרפא קיימים המעעכב את ניוון הסחוס1,2,3,13,14. לפיכך, יש מחקר מתמשך נרחב שמטרתו להבין מחלות OA ולגלות גישות טיפוליות הרומן כי הם מסוגלים להאט או אפילו לעצור OA. לפיכך, יש צורך הולך וגובר לגישה כמותית ומשתנה המאפשר הערכה מדויקת של שינויים פתולוגיים OA הקשורים הסחוס, synovium, ו subchondral bone של המפרק.

כיום, חומרת OA והתקדמות מוערך בעיקר באמצעות מערכות הניקוד OARSI או Mankin15. עם זאת, מערכות הניקוד הללו הן רק חצי כמותית ויכולות להיות מושפעות מסובייקטיביות משתמשים. חשוב מכך, הם נכשלים בהערכת מדויק של שינויים עדינים המתרחשים במפרק במהלך המחלה או בתגובה מניפולציה גנטית או התערבות טיפולית. ישנם דיווחים מאוד בספרות המתארת ניתוחים היסטומריים של הסחוס, סינובינום, או subchondral bone16,17,18,19,20,21. עם זאת, פרוטוקול מפורט לניתוח היסטראומטרי קפדני ומעמיק של כל הרכיבים המשותפים הללו עדיין חסר, ויוצר צורך בלתי מתקיים בתחום.

כדי ללמוד שינויים פתולוגיים ב OA באמצעות ניתוח histomorphometric, השתמשנו במודל העכבר OA כירורגית כדי לגרום OA באמצעות חוסר יציבות של מניסקוס המדילי (dmm). בין המודלים הקימו של מורנה OA, dmm נבחר עבור המחקר שלנו כי זה כרוך מנגנון פחות טראומטי של פציעה22,23,24,25,26. בהשוואה ל-meniscal-ligamentous פציעה (mli) או פציעה ברצועה הצולבת הקדמית (acli) ניתוחים, dmm מקדם התקדמות הדרגתית יותר של OA, דומה לפיתוח oa בבני אדם22,24,25,26. עכברים הורדמים 12 שבועות לאחר ניתוח DMM להערכת שינויים הסחוס הפרקולארית, subchondral bone, ו synovium.

המטרה של פרוטוקול זה היא ליצור גישה סטנדרטית, קפדנית וכמותית להערכת שינויים משותפים המלווים OA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בן שתים עשרה שבועות C57BL עכברים שנרכשו ממעבדות ג'אקס. כל העכברים שוכנו בקבוצות של 3 – 5 עכברים לכל כלוב מיקרו מבודדת בחדר עם לוח זמנים של 12 שעות אור/כהה. כל ההליכים בעלי חיים בוצעו על פי המדריך הלאומי לבריאות (NIH) מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשתמש באוניברסיטת פנסילבניה סטייט.

1. המודל הכירורגי פוסט טראומטי (PTOA)

  1. עכברים מכהים באמצעות קטמין (100 מ"ג/ק"ג)/xylazine (10 מ"ג/ק"ג) שילוב באמצעות הזרקת תוך הצפק, מנהל בופרמורפין (1 מ"ג/ק"ג) באמצעות הזרקה תוך הצפק להקלה על הכאב, ולגלח את השיער מעל הברך. בדוק אם העדר רפלקס פדלים לפני תחילת הניתוח.
  2. לבצע חוסר יציבות של כירורגיה של מניסקוס (dmm) כמתואר בעבר22,23.
    הערה: אנא פנה לגלאססון ואח ' ולסינג ואח '. הפניות למידע על פרוטוקול כירורגי מפורט יותר22,23.
    1. לעשות חתך האורך 3 מ"מ מן הפרק המרוחק אל הרמה האבובית התיכון של המפרק בברך הימנית. השתמש בתפר כדי לתפוס. את גיד הפצ'יני
    2. פתח את הקפסולה המשותפת האמצעי לגיד ולהעביר את משטח שומן התשתית כדי להמחיש את האזור intercondylar, המדיסקוס מניסקוס, ורצועה ממנבשוקה23.
    3. כדי להשלים את היציבות. בפרק22,23 סגור את אתר החתך. עם סיכות או תפרים
  3. לבצע ניתוחים מזויפים בעקבות הליך דומה, אך ללא היפוך של הרצועה המדיאלי האמצעי.
    הערה: עכברים היו אקראיים לקבל או ניתוח DMM או הדמה. על פי הספרות שפורסמה בעבר, עכברים לפתח משמעותית ptoa 12 שבועות לאחר ניתוח dmm22,23,24.

2. המתת-חסד של העכבר ומדגם אוסף

  1. המתת חסד
    1. שנים עשר שבועות לאחר DMM, עכברים מורדם באמצעות קטמין (100 mg/ק"ג)/xylazine (10 מ"ג/ק"ג) שילוב באמצעות הזרקת בצפק פנימי.
    2. הפוך את קו האמצע לחתך דרך העור לאורך בית החזה ולסגת את כלוב הצלעות כדי לחשוף את הלב עבור קיבעון זלוף27.
      הערה: עיין ב-Gage et al. התייחסות למידע נוסף על הפרוטוקול עבור קיבעון מכרסם הנכון, כמו גם את התיאור וידאו של ההרכבה ציוד תקין והליכים27.
    3. הגדר את מכשיר המיזוג לפי פרוטוקול היצרן.
    4. המתת החסד של העכבר על-ידי מבשם מלוחים heparinized דרך החדר השמאלי עד שהדם מתנקה והכבד הופך חיוור. מבשם עכבר עם 10% המאגר ניטרלי פורמלין עד קיבוע העכבר המלא מושגת.
      הערה: עכבר שבעל מעשה בהצלחה יהיה נוקשה. זמן הפרזיה הממוצע באמצעות מערכת המשאבה האוטומטית הוא 5 – 7 דקות.
  2. איסוף והכנה לדוגמה
    1. לבודד את הברכיים על ידי חיתוך העצם באמצע הירך באמצע השוקה ולנתח את רקמת השריר שמסביב.
    2. המשך את הקיבעון על-ידי אחסון מפרקי הברך ב-10% פורמאלין ניטרלי באגירה בטמפרטורת החדר עבור 24 שעות, ואז ב 4 ° c עבור 6 ימים.
    3. Decalcify העצם על ידי אחסון המדגם מאגר decalcify EDTA עבור שבוע 1 בטמפרטורת החדר עם טלטול מתון28. שינוי הפתרון של מאגר decalcification כל 3 ימים.
      הערה: מאגר decalcification הוכן על ידי המסת 140 g של בדיקת ה-edta באלקטרופורזה בתמיסה של 850 mL של מים מזוקקים בתוספת 15 מ ל של חומצה אצטית קרחוני. המאגר היה pH ל7.6 על ידי הוספת dropwise של חומצה אצטית קרחוני לפתרון. לאחר הגעה ל-pH = 7.6, המאגר הובא ל-1 כולל נפח L עם מים מזוקקים. מאגר decalcification היה מוכן טרי והשתמשו בתוך 1 שבוע של הכנה.
    4. לשטוף את הברכיים עם 50% אתנול, אז 70% אתנול עבור 15 דקות כל אחד, לאחר מכן תהליך להטבעה.
      הערה: עיבוד העברת נוזלים בוצע על ידי הליבה המולקולרית וההיסטולוגיה במרכז הרפואי של פן סטייט מילטון ס. הרשי. עיין בליבת היסטולוגיה של המוסד לקבלת המלצות על עיבוד לדוגמה אופטימלי.
    5. להטביע את הברכיים העכבר בתוך פרפין עם ההיבט המדיאלי של המפרק מול המשטח התחתון של בלוק פרפין. הפעילו לחץ קל על הצד הטאלי של המפרק במהלך ההטבעה כדי להבטיח שמשטחים משטחי הירך והעורק יהיו קרובים לאותו מישור ככל האפשר.

3. בנייה מיקרוטומה ובחירת שקופיות

  1. הסטום
    1. השתמש בידיות הכוונון של המטוס על מחזיק הבלוק של המיקרוטומה כדי להבטיח את הכיוון הנכון של בלוק המדגם.
    2. התמודד עם בלוק הפרפין כך שהפן המרוחק של עצם הירך, האזור הקדמי של השוקה, והקרניים הקדמיות והאחוריים של מניסקוס מופיעים באותו מישור לאוסף המקטעים (איור משלים 1a). התחל לאסוף קטעים על השקופיות כאשר הקרניים הקדמיות והאחוריים של המדיסקוס מתחילות להפריד זה מזה.
    3. ודא כי שוקה, עצם הירך, ו menisci מופיעים באותו מישור על ידי השוואת גודל המבנה. השוקה ועצם הירך אמורים להיות בגודל דומה, והקרניים המדומות בגודל ובצורה (איור משלים 1A). אם מבנה מופיע גדול מדי בהשוואה לעמיתו, הדבר מצביע על כך שיש צורך בהתמודדות נוספת. חשוב לוודא שהשטח המשותף. נותר ללא פגע
    4. לקחת קטעים משונן של פרפין ברכיים עכבר מוטבע דרך תא משותף המדיאלי בסעיפים 5 יקרומטר ולאסוף את הסעיפים על השקופיות. לאסוף כ 30 סעיפים לכל בלוק פרפין.
  2. בחירת שקופיות
    1. בחר שלושה סעיפים מייצגים 50 יקרומטר מלבד עבור כל מדגם החל מהחלק החמישי (כלומר, שקופיות 5, 15, ו -25). שקופיות נבחרות ישמשו עבור כתמים מאוחרים יותר, הבקיע OARSI, וניתוח histomorphometric.
      הערה: מבלוק עם 30 מקטעים כולל, בחר שקופיות מתחילת (שקופיות 5-10), אמצע (שקופיות 15-20) והקצה (שקופיות 25 – 30) של הערכה כדי לייצג בבירור את המדגם כולו. בחר שקופיות מרמות דומות של עומק בין דגימות.

4. המטאוקסילין, Safranin תפוז, מכתים ירוק מהיר

  1. דפפיזציה השקופיות הנבחרות עם שלושה שינויים של xylene. מימה את השקופיות עם שני שינויים של 100% אתנול, שני שינויים של 95% אתנול, ושינוי אחד של 70% אתנול.
  2. הכתם את השקופיות עם המטאוקסילין עבור 7 דקות ולאחר מכן לשטוף עם מים זורמים עבור 10 דקות. כתם עם ירוק מהיר עבור 3 דקות ולשטוף ב 1.0% חומצה אצטית קרחוני עבור 10 s. כתם עם Safranin-O עבור 5 דקות לשטוף במהירות על ידי טבילה ב 0.5% חומצה אצטית קרחוני.
  3. שטפו שקופיות בשני שינויים של מים מזוקקים והרשו לאוויר להתייבש.
  4. ברור שקופיות בשלושה שינויים של קסילן עבור 5 דקות כל לאחר מכן לטעון עם קסילן מבוססי מדיה הרכבה ו coverslip.
    הערה: המטאוקסילין משמש ככתם גרעיני לזיהוי אזורי מח עצם. Safranin-O משמש כדי להכתים את הסחוס, הפרוטגליקנים, mucin, ו בגרגרים תא תורן. ירוק מהיר משמש ככתם נגדי לעצם.

5. שקופית הדמיה

  1. התמונה Safranin-O ו-Fast שקופיות מוכתם ירוק באמצעות מצלמה זמינה המצורפת מיקרוסקופ ותוכנת דימות מבוססי מחשב.
  2. פתח את תוכנת הדימות (ראה טבלת חומרים) וסדר את אזור הברך המשותף של הריבית (ROI) במרכז חלון ההדמיה. אם נעשה שימוש בשלב שקופית המיקרוסקופ הסיבוב, יישר את השקופית כך שמשטח המים המקיף את רוחב הציר האופקי של אזור ההדמיה.
  3. קבעו את האיזון הלבן של המצלמה לפני שמתחילים לצלם סדרה של דוגמאות (איור משלים 2). תמונה תא משותף בהגדלה 4x ו-10x, להבטיח כי הן המשטח השני של העצמות והירך ואת העצם subchondral בתוך כל אחד מה, כלולים בכל אחת מתמונות ROIs (איור משלים 1A, B). שמור תמונות עבור כל אחת משלוש הרמות שנבחרו לשימוש עבור הבקיע OARSI.
    הערה: הגדרת האיזון הלבן של המצלמה תהיה תלויה במערכות התוכנה והמצלמה המשמשות. בדרך כלל, נווט ללשונית המצלמה או לתפריט ההדמיה הראשי וגלול למטה כדי לקבוע איזון לבן. בחר ' קבע איזון לבן ' וסמן קטן או סמל יופיע (איור משלים 2 א). באמצעות הסמן, בחר אזור בתוך התמונה/מדגם שאינו נקי מכתמים, כגון המרחב המשותף, כדי לקבוע את האיזון הלבן.

6. אוסטיאוארתריטיס החברה מחקר בינלאומי (OARSI) הבקיע15

  1. באקראי את שלושת Safranin-O ומהיר ירוק מחליק שקופיות מכל הדגימות.
  2. בצע הבקיע OARSI באופן עיוור עם שלושה משקיפים. בקצרה, להציג תמונה אחת בכל פעם בסדר אקראי ולאפשר שלושה משקיפים להבקיע כל תמונה, הקשורות לאחת משלוש רמות שנבחרו עבור כל מדגם.
    הערה: עיין בטבלת הניקוד של OARSI לקבלת תיאורים מפורטים של סולם הציונים15.
  3. לחשב את הציון הממוצע עבור כל מקטע באמצעות ציונים בודדים מכל משקיף. לקבוע את הציון הממוצע לכל מדגם על-ידי נקיטת הציון הממוצע של שלושת הסעיפים הנציג.

7. ניתוח היפוסטומטרי

הערה: תמונות בשידור חי של מפרק הברך מוצגים בצג מסך מגע באמצעות מצלמת מיקרוסקופ, ומשמש לאיתור ידני של ה-ROIs. אלגוריתמים מוכללים של תוכנת ההיסטוממטריה מכמת את הפרמטרים שצוינו (ראה פרוטוקול להלן) ב-ROIs המוגדר. חשוב מכך, אותו Safranin-O ו-מהיר ומוכתם ירוק מקטעים המשמשים בניקוד OARSI משמשים לניתוח histomorphometric.

  1. התקנת תוכנה והכנת מדידה
    1. הפעל מיקרוסקופ, מצלמה, מחשב, מסך מגע. לחץ על אייקון התוכנה כדי להפעיל את תוכנת התוכנה. הצב את השקופית על הבמה במיקרוסקופ לצפייה.
    2. מרכוז הדגימה בתוך חלון המדידה. ודא שרשת המדידה מוגדרת להגדלה הנכונה כדי להתאים למטרה הנמצאת בשימוש במיקרוסקופ (איור משלים 3).
    3. עבור אל הכרטיסיה קובץ בחלק העליון של המסך וגלול מטה כדי לקרוא את הגדרות. פתח את חלון ההגדרות ובחר את קובץ ההגדרות המתאים כדי למדוד את הפרמטרים.
    4. בחר את הפרמטר שיש למדוד מהרשימה בצד ימין של המסך (איור משלים 3). השתמש בעט העט או בסמן העכבר כדי לעקוב אחר תמונות בהתאם לשלבים המתוארים להלן כדי למדוד ROIs רקמות ספציפיות. בסיום המדידה, לחץ לחיצה ימנית כדי לסיים את המדידה ולהמשיך לפרמטר הבא.
      הערה: רשימת הפרמטרים שיש למדוד נוצרת באמצעות קובץ העדפה ייחודי המוגדר בהתייעצות עם חברת התוכנה למטרת מדידת ROIs המתואר. נא עיין בדיון לקבלת פרטים נוספים בנוגע לכיוונון המלא.
    5. השלם את כל המדידות ולאחר מכן נווט אל הכרטיסיה נתוני תקציר בחלק התחתון של מסך התוכנה (איור משלים 3). לחץ על חלון המסך, הכה את מקש Insert במקלדת או העתק והדבק את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני נפרד.
      הערה: בצע ניתוח histomorphometric באופן אקראי ועיוור. לאחר השלמת כל מדידות הפרמטרים עבור כל הדגימות, ארגן את הנתונים והממוצע את המידות משלוש השקופיות מכל מדגם.
  2. מדידות של אזורי הסחוס הכולל, מסויד ובלתי מסויד
    הערה: השתמש בתוכנה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים) כדי לבצע שלבים אלה. נא עיין באיור המשלים 1b,C לבירור על אזורי סחוס, צמתים ואזורי עצם subchondral שנדונו במהלך סעיף זה.
    1. לצייר קו על פני הקצה העליון של משטח הסחוס של האזור שבו הסחוס פוגש את החלל המשותף. צייר קו שנייה ב-צ'ונdro-osseous הצומת שבו הסחוס מסתיירת פוגש את העצם subchondral (איור 1B). השתמש בפונקציה אזור התוכנה כדי לקבל באופן אוטומטי את מדידת אזור הסחוס הכולל.
    2. צייר קו לאורך tidemark, קו טבעי המפריד בין אזורים מסויד ובלתי מסויד של סחוס. צייר קו שנייה ב-צ'ונdro-osseous הצומת שבו הסחוס מסתיירת פוגש את העצם subchondral (איור 1B). השתמש בפונקציה של אזור התוכנה כדי להשיג באופן אוטומטי את המדידה של אזור הסחוס מסויד.
    3. לחשב את אזור הסחוס בלתי מסויד על ידי הפחתת אזור הסחוס מסויד מאזור הסחוס הכולל (איור 1B).
  3. קביעת מספר כונדרוציטוט ופנוטיפ
    1. צור פונקציות מספור נפרדות בתוך ההגדרות בתוכנת ההיסטומוריקה כדי להבחין בהפקת המטריצה ובמטריצה שאינה מייצרת כונדרוציטים (איור 1B).
    2. לקבוע את מספר מטריצות לייצר או לא לייצר כונדרוציטים באמצעות העט כדי לעשות נקודה קטנה על כל כונדרוציט המבטא את הפנוטיפ שצוין (איור 1B).
      הערה: מונה תאים לפי פנוטיפים שלהם כמו מטריצה לייצר (כלומר, Safranin-O חזק כתמים) או מטריצה לא מייצר (כלומר, קלוש מאוד או לא Safranin-O כתמים).
  4. מדידת היקף המשטח התחתי
    1. מדוד את היקף המשטח האבסולוטי המוחלט על ידי מעקב אחר קו על פני פני השטח של הסחוס העצמי, בזהירות הגדרת fibrillations הפרט (איור 1C).
    2. צייר שורה שנייה לאורך המשטח כדי לשמש כפקד פנימי למישור של כל מקטע (איור 1C).
    3. לחשב את מדד המשטח הפרשולי של האזור על-ידי חלוקת השטח החיצוני של המשטח באזור ההיקפי.
      הערה: tidemark הפרימטר הם בדרך כלל שווים על פני דגימות, כך ההבדל במשטח הפרקיות טרים בין המזויף ו-dmm היה בדרך כלל קטן אם היקף מוחלט או מדד פרפור שימשו.
  5. המדידה של העצם הsubchondral ואזורי החלל מח
    1. למדוד את אזור החלל מח subchondral באמצעות הפונקציה אזור על ידי חלוקה לרמות באזור subchondral ויטראז ' עם המטאוקסילין בלבד (כלומר, שלילי ירוק מהיר) כדי לקבוע את שטח החלל במח הכולל בתוך העצם subchondral. לצייר קווים סביב ההיקף של אזורים אלה כדי לקבוע את השטח הכולל של כל מרחב במח בתוך subchondral bone העצם (איור 2B).
    2. למדוד את האזור subchondral הכולל באמצעות הפונקציה שטח על ידי חלוקה לרמות של האזור בין הצומת צ'וננדרו-osseous ואת הגבול העליון של צלחת הצמיחה, הרחבת השוליים לאזורים של האוסטאופטים הקדמי והאחורי (איור 2B).
    3. לחשב את אזור העצם subchondral על ידי הפחתת אזור מח עצם subchondral שטח מאזור subchondral הכולל (איור 2B,C).
  6. מדידת האזורים האחוריים והאחורי
    1. כדי למדוד את האזור האוסטאופתים, עקוב אחר האוסטאופטים הקדמי והאחורי של השוקה הקדמית באמצעות הפונקציה area (איור 2b,E,F).
      הערה: האוסטאופטאים הם התחזיות הגרמיות היוצרות בין הסחוס הקדמי לבין לוחית הצמיחה, הקדמית או האחורי לאזור הsubchondral. אזורים אוסטאופבים על הצדדים הקדמי והאחורי של השוקה נקבעים על ידי מעקב אחר האזור הקדמי או האחורי של העצם subchondral. הצומת בין העצמות האוסטאופניים והעצם הsubchondral מוקף באופן ברור על-ידי קו של תאים החורגים מהסחוס האומנותי ועד לצלחת הצמיחה. הצומת בין האוסטאופה והסיננובינום מוגדר על ידי מעבר בין רקמות גרמיות וסיבי.
  7. מדידה של עובי אמתחת
    1. למדוד את עובי מערכת הירך הקדמית באמצעות הפונקציה אזור על ידי ציור קו מנקודת ההכנסה הפנימית של אמתחת הקדמי על עצם הירך לקראת נקודת ההחזקה שלה על מניסקוס (איור 3b).
    2. צייר קו שני מן הכניסה החיצונית של הסיננוביאום על עצם הירך לכיוון ההחזקה שלה למנסקוס (איור 3B).
    3. לחשב את עובי אמתחת ידי חלוקת האזור אמתחת הכולל על ידי היקף אמתחת.

8. אנליזה סטטיסטית

  1. לאסוף את הפרמטרים נמדד ממוצע התוצאות של שלושת הסעיפים נציג עבור כל מדגם. נתח את הנתונים באמצעות מבחן t של סטודנט שאינו משויך כדי להשוות בין שתי קבוצות או ANOVA בכיוון אחד כדי להשוות שלוש קבוצות או יותר.
  2. הצג את הנתונים כממוצע השגיאה הסטנדרטית ±.
    הערה: משמעות סטטיסטית הושגה ב p ≤ 0.05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

DMM-המושרה תוצאות OA בניוון הסחוס הפרקולארית והפסד כונדרוציטוט
OA המושרה DMM הביא לציון OARSI גדל לעומת עכברים מזויפים, מאופיין בבירור על ידי שחיקת פני השטח ואובדן הסחוס (איור 1A,D). פרוטוקול histomorphometry מפורט כאן זיהה כמה שינויים OA הקשורים, כולל ירידה באזור הסחוס הכולל באזור סחוס בלתי מסויד (איור 1A,B,E,G); הפחתה במספר הכולל כונדרוציטוט; וחשוב מכך, אובדן מטריצה המייצרת כונדרוציטים (איור 1H,I). שינויים במשטח הפרקיות הרומז על חומרת הסחף, הוערכו באמצעות מדד פרפור פרוזדורים. בסך הכל, המדד פרפור פרוזדורים גדל בעכברים DMM (איור 1C,K,L). עם זאת, חשוב גם לציין כי המדד פרוזדורים עלול להצטמצם OA בשלב הסופי בשל שחיקה מלאה של משטח הסחוס, כפי שנדונו בפרוטוקול. עלייה במדד פרפור פרוזדורים מרמז על ניוון של משטח הסחוס הפרקולארית במהלך פיתוח OA והתקדמות. תוצאות אלו מדגישות את היכולת של תוכנית הניתוח histomorphometric כדי לזהות ולכמת שינויי סחוס פתולוגיים המאפיינים התקדמות OA.

הערכה של שינויים משותפים אחרים ב-OA המושרה ב-DMM
OA משפיע על רקמות משותפות מלבד הסחוס, ושינויים פתולוגיים ברקמות אלה לשחק תפקיד מכריע התקדמות המחלה. כאן, שיטת הניתוח histomorphometric המתוארת חשפה עלייה באזור העצם subchondral וירידה באזור מח העצם בעכברים dmm (איור 2a–D), המציין subchondral טרשת העצם29,30. גם אזורים האוסטאופבים הקדמי והאחורי הוגדלה בעכברים dmm (איור 2e,F), מציע שיפוץ עצם subchondral מתמשך המשמש כמנגנון פיצוי כדי לטפל בשינויים בטעינה משותפת באתר של פציעה29,30.

ניתוח histomorphometric של synovium הראה עובי synovium מוגבר בעכברים dmm (איור 3a–C), שהיא תוצאה טיפוסית של דלקת בקבוקון OA הקשורים ו הדיפוזיה של ציטוקינים דלקתיים לחלל משותף11,12,31,32,33,34.

ניתוח של השתנות בין משתמשים בין הניקוד של OARSI לעומת היפוסטומוטמטריה
איור 4A מראה לא השתנות בין משתמשים משמעותיים של ניתוח הימאנאנמטרי של אזור הסחוס בלתי מסויד (איור 4a) ואת הציון Oarsi (איור 4a). עם זאת, ניתוח histomorphometric הראה הבדל ממוצע נמוך ביותר בין משקיפים הנע מ-0.0001179 – 0.00120, המוביל חפיפה כמעט מלאה של התוצאות שהתקבלו על ידי שלושת המשקיפים, בעוד ההבדל הממוצע בין משקיפים היה גבוה יותר בציון OARSI החל-0.3 – 0.3 עם סטייה ברורה של O1 ערכים מ O2 O3 ערכים.

Figure 1
איור 1: הידברות של הסחוס המוח החירירי ופנוטיפים מתוך ניתוח מזויף ועכברים DMM. (א) פני השטחהארטיאני מוכתם עם Safranin-O/מהיר ירוק. (ב) ניתוח הידאוראורמטרי שימש למעקב אחר אזור הסחוס הכולל ואזור הסחוס המסויד (כתום). הסחוס העליון לאזור tidemark חושבה כסחוס בלתי מסויד (ירוק). מטריצה המייצרת כונדרוציטים (לבן) ומטריצה שאינה מייצרת כונדרוציטים (מגנטה) נספרו בתוך אזור הסחוס הבלתי מסויד. (ג) היקף המשטח הפנימי של האזור נמדד על ידי מעקב אחר המשטח הראשי (קו כחול) ולאחריו את ה-tidemark (קו סגול) כדי לקבוע את מדד פרפור. (ד) הציון של OARSI גדל בעכברים dmm. (E–L) ייצוג גרפי של אזורי הסחוס הקוונט וספירות כchondrocyte מתוך עכברים התחזות ו DMM. בהשוואה לעכברים מזויפים, עכברים dmm ירדו באזור הסחוס הכולל של העיר (E), אזור הסחוס של העצם מסויד (F), הסחוס בלתי מסויד (G), מספר הכולל של כונדרוציטים (H), מטריצה טיביאליס הייצור כונדרוcytes, (I) ומטריקס מטריצה בלתי מייצרת בהשוואה לעכברים מזויפים, עכברי DMM הגבירו את היקף המשטח ההיקפי (K) והגדילה הגדלה של משטח האזור הראשי (L). תמונות צולמו באמצעות הגדלה של 10x. * P < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001, ו * * * * p < 0.0001 באמצעות מבחן t מזווג עם תיקון של וולש, הערכים מבוטא כממוצע ± SEM; n = 5/קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הידברות של אזור מח עצם subchondral ואזור עצם subchondral מניתוח דמה ועכברים DMM. (א) סחוס העצמות הsubchondral ועצם מוכתם עם Safranin-O/מהיר ירוק. (ב) subchondral מח עצם (ירוק), אזור העצם subchondral (מגנטה), האזור האוסטאופא הקדמי (צהוב), והאזור האחורי האוסטאופא (אפור) נמצאו עם תוכנת histomorphometry מחושב. (ג–ו) בגרף האזורים האלה בין עכברי הדמה לבין העכברים DMM. לעומת העכברים המזויפים, העכברים DMM היה אזור subchondral עצמות מוגברת של העצם (C) ואת הסביבה הקדמית והאחורי באזורים מוגלבים (E–F), כמו גם באזור מח עצם subchondral העצמות לעומת עכברים מזויף (ד). תמונות נלקחו באמצעות הגדלה 4x. * P < 0.05, * * P < 0.01 באמצעות מבחן t לזווג עם תיקון של וולש. הערכים מבוטאים כממוצע ± SEM; n = 5/קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הידברות של synovium מהניתוח המזויף ועכברים DMM. (A) synovium ויטראז ' עם Safranin-O/מהיר גרין. (ב) עובי אמתחת נמדד על ידי מעקב אחר הממברנה הקדמית מוסרית אמתחת על פני ההיבט הקדמי של המפרק המוסרי (ירוק). (C) ייצוג גרפי של מדידות עובי אמתחת באמצעות תוכנת histomorphometry מחושב. עכברים dmm היה עובי אמתחת מוגבר לעומת עכברים מזויפים. תמונות צולמו בהגדלה של 20 x. P < 0.001 באמצעות מבחן t מזווג עם תיקון של וולש, ערכים מבוטא כממוצע ± SEM; n = 5/קבוצה; S = סיננובינום; F = עצם הירך; ו-M = מניסקוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ההבדלים בין משתמשים בניקוד OARSI לעומת ניתוח היסטראומטרי. (א) מדידות אזור הסחוסבלתי מסויד שהתקבלו באמצעות histomorphometry על ידי שלושה משקיפים עיוור (O1, O2, O3). (ב) ציונים oarsi עבור עכברים התחזות ו dmm המתקבלים שלושה משקיפים עיוור. הקווים המנוקדים מציינות את הערך הממוצע עבור כל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: ניתוח היסטולוגית של Safranin-O and מהיר ירוק מוכתם מקטעים משותף מוסרי. (א) תמונת הגדלה של 4 x של המפרק המוסרי. תחומי המיקוד מתויגים. (ב) תמונת הגדלה של 10x של התשואה המשותפת של הפונקציה. משטחי הירך והעורק, כמו גם הקרניים הקדמיות והאחוריים של מנטאלי הינם מדמיינו. Menisci הם בערך באותו גודל ואת ROI הדמיה ממורכז בתא משותף. (ג) דמות הגדלה של 40 x של המשטח הפנימי ביותר של השוקה. קו הטידמארק מתויג כקו הגבול בין אזורי הסחוס שאינם מסויד ומסויד. הצומת osteochondral מסומן בין הקצה של הסחוס מסויד ותחילתו של העצם subchondral. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

איור משלים 2: התקנת מערכת ההיסטודומטריה ומצלמה כיול איזון לבן. (א) העכבר משותף מוסרי דמיינו בהגדלה 4x בחלון התוכנה עם איזון לבן לא להגדיר. שים לב ללשונית הגדרות המצלמה בחלק העליון של המסך והבחירה בתפריט הנפתח כדי לקבוע את האיזון הלבן. (ב) מפרק מוסרי של העכבר בהגדלה של 4x עם ערכת איזון לבן. שימו לב לשינוי בצבע ובצביעת המדגם, הגברת היכולת של המשתמש להבחין בין אזורים מסוימים של המפרק המוסרי בעת ביצוע מדידות. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

איור משלים 3: התקנה של התוכנה ההיסטוממטרית לפני מדידות ניתוח ההיסטוממטרי. צילום מסך של הנציג של חלון תוכנה histomorphometric. הערה מקטע הברך המוכתמת של העכבר ממורכז באזור המדידה (רשת צהובה) וקנה המידה הנכון של האזור נבחר כדי להתאים את המטרה המשמשת לשימוש במיקרוסקופ (בצבע אדום בפינה הימנית העליונה של המסך). רשימת הפרמטרים מוצגת בעמודה מימין לאזור ההדמיה והמדידה. בחירה בפרמטר תגרום להדגשת הפרמטר, ולכן האפשרות ' פרפור פרוזדורים ' נבחרה כעת למדידה. הכרטיסיה נתוני סיכום בתחתית החלון היא המקום שבו המידות עבור כל פרמטר עבור כל דוגמה מאורגנות ונשמרות כדי להיות מיוצאות לאחר השלמת כל מדידת הפרמטרים עבור כל מקטע. אנא לחץ כאן כדי להוריד את האיור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקר אוסטיאוארתריטיס האחרונות הגדילו את ההבנה שלנו של הוצלב בין הרקמות השונות בתוך המפרק ואת התפקיד כל רקמה משחק חניכה המחלה או התקדמות8,9,10,35,36. בהתאם, זה הפך ברור כי הערכה של OA לא צריך להיות מוגבל ניתוח של הסחוס, אבל צריך גם לכלול ניתוח של העצם subchondral ו synovium. למרות זאת, הסחוס הפרקולארית כבר המוקד העיקרי של הבקיע חצי כמותי של OA15,37,38. למרות מחושב hiסטומורמוטמטריה כבר הוחל על תחומים שונים של מחקר השלד החיצוני39,40,41,42,43,44, יש פער קליניות בתיאור פרוטוקול במדויק ובאופן מדויק לנתח שינויים נפרדים המון רקמות בתוך התא מפרק הברך במהלך OA. היישום של מדידות ניתוח histomorphometric כדי שינויים בכמת את הסחוס, subchondral bone, ו synovium מספק הערכה הוליסטית יותר של השינויים העיקריים והמשניים במפרקים OA.

כאן, אנו מתארים בפעם הראשונה פרוטוקול מפורט אשר מנצל תוכנת ניתוח histomorphometric ממוחשב וחצי אוטומטי כדי לכמת שינויים פתולוגיים בתאי משותף שונים ולהעריך את התפתחות OA, התקדמות, או רגרסיה. הטיפול צריך להילקח במהלך הכנת המדגם, כמו ברור ועקבי Safranin-O ו מהיר כתמים ירוקים הם חיוניים כדי להגביל את בהירות בעת מעקב ונקיטת מדידות עם תוכנה histomorphometric. שימוש בפתרונות מכתים טרי עבור כל אצוות של שקופיות רצוי. בנוסף, בחירת שקופיות עבור כתמים חייבת להתרחש ברמות עקביות בין בלוקים. השקופית הראשונה חייבת להילקח ברמה דומה בין דגימות, באופן אידיאלי ברגע שהקרניים הקדמיות והאחוריים מתחילות להפריד.

במהלך OA, סחוס מוחלט ואזורים סחוס בלתי מסויד לירידה עקב פרפור פרוזדורים וניוון. ב OA חמור, ניוון מוחלט של הסחוס מסויד עשוי להתרחש גם. הפרוטוקול מדגיש את המשמעות של קביעת פנוטיפים כונדרוטיפ כהערכה של התקדמות OA להערכה של אנבוליים לעומת catabolic איתות בסחוס. המספר הכולל של כונדרוציטים ואת מספר מטריקס הפקת כונדרוציטים (אנבוליים) הם גבוהים בסחוס נורמלי נמוך בסחוס OA, שם רוב כונדרוציטים קיימים ב OA הם מטריצה שאינה מייצרת (catabolic). חשוב מכך, פרמטר זה חיוני בתחום של תגלית טיפולית OA לא מוערך על ידי OARSI או מנצ של מערכות הניקוד. התערבויות מסוימות כי לא רק לשמר את אזור הסחוס ואת מספר כונדרוציטים אבל גם לקדם כchondrocyte אנבוליים פנוטיפ יכול להיות גישות טיפוליות יעיל יותר.

הפרוטוקול מפורט כאן גם מספק שיטה כדי לכמת את השינויים עדין במשטח הסחוס fibrillations נוכח מתון עד מתון OA. מספר גדול יותר של fibrillations פירושו מדידה היקפית מוגברת עקב נוכחות של כניסות במשטח ההיקפי. כך, היקף המשטח החיצוני של השטח ואת המדד פרוזדורים נמוך בסחוס נורמלי, ביניים OA מתון בשל כמה fibrillations, גבוה OA מתון בשל fibrillations יותר, אבל שוב נמוך OA חמור עקב ניוון הסחוס המלא ואובדן.

שיפוץ עצם Subchondral וטרשת נפוצה סימנים פתולוגיים אופייניים של OA, וכתוצאה מכך אזור Subchondral החלל מח מופחת ומוגברת Subchondral אזור העצם8,9,10,29,30. קוונפיקציה של שינויים באזור עצם subchondral ואזור מח subchondral שטח המתואר בפרוטוקול להפגין את החשיבות של הבנה שינויים מרובי רקמות כרכיב נהיגה עבור הטבע המורכב של פיתוח מחלת OA והתקדמות. המדידה של האזורים הקדמי והאחורי הפנימי מספק תובנה חשובה בקנה מידה של שיפוץ העצם המתרחשים בתוך המפרק. האזור האוסטאופא קטן מאוד בברכיים המופעלות באופן המזויף, והוא מוגבר בשל היווצרות האוסטאופה ב OA. המדידה של האזור האוסטאופבים הקדמי שונה מעט ממדידה של האזור האוסטאופבים האחורי עקב האופי החמור של שיפוץ העצם המתרחשים באזור המדיאלי של הברך, ליד האתר של פציעה DMM.

לבסוף, פרוטוקול זה מתאר הערכה הניתנות לכימות של שינויים בקרום אמתחת. עובי synovial נמוך במפרקים הדמה ועליות OA. דלקת ב OA מוביל עיבוי של קרום אמתחת כדי להגדיל את המסירה של ציטוקינים דלקתיים וגורמים אחרים לחלל משותף10,11,1231,32. לכן, זה חיוני כדי להעריך דלקת משותף כגורם מודולליטינג של התקדמות מחלת OA.

השימוש בתוכנת ההיסטוממטריה מוגבל על-ידי הזמינות של החומרה: צגי מסך מגע או טבליות עם עט אלקטרוני הכרחיים בהתאם לכמות המעקב הידני הדרושה לקבלת מדידות מדויקות. מנסה למדוד אזורים קטנים בעזרת תוכנת ההיסטומימטריה ניתן גם להגביל, מכיוון שגודל העט מוגבל לקוטר אחד. אמנם חוסר היכולת למדוד אזורים קטנים עלול להיות לא נוח, האזורים המשותפים הנמדדים מוגדרים בקלות באמצעות כלי השטח, והאפליה הנמוכה של התוכנה מהווה הבדל זניח במדידה הסופית.

יש לציין כי השתנות בין משתמשים היא תמיד תחום של דאגה לגבי יישום של פרוטוקול כמותי אמין ומאפשר להתרבות. הקמת פרוטוקול histomorphometry יעיל וקפדני מחייבת הגבלת משתני הרכבה פוטנציאליים בתוך הניתוח הנסיוני, כולל הפחתת השתנות בין-משתמשים. עם זאת, בעקבות מפגש הכשרה קצר (כ -30 דקות) עם התוכנה, חברי המעבדה הצליחו ליצור מדידות עקבית ועקביות מאוד, כאשר התפלגות המידות בין משתמשים משקפת יותר כיסוי ישיר המייצג כמעט לא השתנות בין משתמשים. וחשוב מכך, פרוטוקול ההיסטוממטריה הזה ממחיש שיטה יעילה לכמת אפילו הבדלים בדידים בין דגימות מטעות באופן מאוד מתוכלתי.

מערכת הניקוד OARSI הוא מידה נפוץ של הערכה לנזק הסחוס בחולים OA ומודלים מורטין ניסיוני15. מערכת הניקוד מבוססת על קנה מידה של מספר שלם המתמקד בעיקר בהיקף של בבליטות/בסחף או במשטח האומנותי. למרות שלא מצאנו הבדלים בין-משתמשים משמעותיים עם הציונים של OARSI בניסוי שלנו, עדיין היה הבדל ממוצע גבוה יותר בין משקיפים, לעומת כמעט אף אחד בפרוטוקול histomorphometry המתואר. לפיכך, הקמת פרוטוקול זה לניתוח הידברות של פרמטרים מוגדרים מאפשר מדידות עקבית מאוד של כל מדגם, אפילו בין משתמשים מרובים, הסרת חלק מהטבע הסובייקטיבי של ניתוח לדוגמה.

מערכת הניקוד הסטנדרטית של OARSI היא בחינת ביצועים עבור מחקר OA. עם זאת, האופי המוגבל מבוסס הציון של המערכת אינו מאפשר כימות של שינויים עדינים המתרחשים בתוך המפרק. הערכה משותפת מורחבת המתוארת בכתב יד זה באמצעות תוכנת histomorphometry מספק אפיון סובייקטיבי משופר ופחות של חומרת OA. פרוטוקול זה ממוטב עבור עכברים שעברו אינדוקציה כירורגית של OA. ההליכים והטכניקות ניתן להחיל על הערכה של OA בתוך דגמים אחרים השערות, עם זאת.

לסיכום, הפרוטוקול המפורט כאן מספק מדריך ברור עבור גישה קפדנית וכמותית למחצה אוטומטית לחקור פתולוגיה OA או להעריך התערבויות טיפוליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא

Acknowledgments

ברצוני להכיר בעזרתם של צוות המחלקה לרפואה השוואתית והליבה המולקולרית וההיסטולוגיה במרכז הרפואי פן מילטון ס. הרשי. מקורות מימון: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (סיר f סאוויני), דלקת מפרקים אנRF מחקר מענק (סיר f סאוויני).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% Buffered Formalin Phosphate Fisher Chemical SF100-20 For sample fixation following harvest
Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) Fisher Chemical A38S-212 For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining
Cintiq 27QHD Creative Pen Display Wacom https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch For histomorphometric analysis and imaging
Cintiq Ergo stand Wacom https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch For histomorphometric analysis and imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% Acros Organics AC446080010 For Decalcification Buffer preparation
Fast Green stain SIGMA Life Sciences F7258 For sample staining
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides Fisher 12-550-15 For sample section collection
HistoPrep Xylene Fisherbrand HC-700-1GAL For sample deparrafinization and staining
Histosette II Tissue Cassettes - Combination Lid and Base Fisher 15-182-701A For sample processing and embedding
HP Z440 Workstation HP Product number: Y5C77US#ABA For histomorphometric analysis and imaging
Manual Rotary Microtome Leica RM 2235 For sample sectioning
Marking pens Leica 3801880 For sample labeling, cassettes and slides
OLYMPUS BX53 Microscope OLYMPUS https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ For histomorphometric analysis and imaging
OLYMPUS DP 73 Microscope Camera OLYMPUS https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ For histomorphometric analysis and imaging (discontinued)
ORION STAR A211 pH meter Thermo Scientific STARA2110 For Decalcification Buffer preparation
OsteoMeasure Software OsteoMetrics https://www.osteometrics.com/index.htm For histomorphometric measurement and analysis
Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system Leica Model # 39471005 For mouse knee harvest
PRISM 7 Software GraphPad Institutional Access Account Statistical Analysis
Safranin-O stain SIGMA Life Sciences S8884 For sample staining
ThinkBoneStage - Rotating Microscope Stage Think Bone Consulting Inc. - OsteoMetrics (supplier) http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php For histomorphometric analysis and imaging
Wacom Pro Pen Stylus Wacom https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch For histomorphometric analysis and imaging
Weigerts Iron Hematoxylin A Fisher 5029713 For hematoxylin staining
Weigerts Iron Hematoxylin B Fisher 5029714 For hematoxylin staining

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
  2. Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
  3. Lorenz, J., Grässel, S. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. Singh, S., Coppola, V. 1194, Humana Press. New York, NY. 401-419 (2004).
  4. Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
  5. Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
  6. Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
  7. Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654 (2011).
  8. Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
  9. Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632 (2016).
  10. Martel-Pelletier, J., et al. Osteoarthritis. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16072 (2016).
  11. Goldring, M. B., Otero, M. Inflammation in osteoarthritis. Current Opinion in Rheumatology. 23 (5), 471 (2011).
  12. Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625 (2010).
  13. Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
  14. Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
  15. Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
  16. Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
  17. O'Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
  18. Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
  19. Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
  20. Pastoureau, P., Chomel, A. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. 101, Humana Press. New York, NY. 79-91 (2004).
  21. McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
  22. Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  23. Singh, S. R., Coppola, V. Mouse Genetics: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2004).
  24. Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413 (2014).
  25. Culley, K. L., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. Westendorf, J., van Wijnen, A. 1226, Humana Press. New York, NY. 143-173 (2015).
  26. Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  28. Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
  29. Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
  30. Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223 (2013).
  31. Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33 (2011).
  32. Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
  33. Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
  34. De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
  35. Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028 (2016).
  36. Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43 (2011).
  37. Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  38. Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
  39. Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
  40. Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175 (2018).
  41. Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
  42. Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037 (2016).
  43. Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
  44. Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).

Tags

רפואה סוגיה 159 אוסטיאוארתריטיס DMM חוסר יציבות של מניסקוס ניוון הסחוס פתולוגיה משותפת הערכה כמותית histomorphometry
מתוקננת הערכה היסטראורמטרית של אוסטיאוארתריטיס במודל עכבר כירורגי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pinamont, W. J., Yoshioka, N. K.,… More

Pinamont, W. J., Yoshioka, N. K., Young, G. M., Karuppagounder, V., Carlson, E. L., Ahmad, A., Elbarbary, R., Kamal, F. Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model. J. Vis. Exp. (159), e60991, doi:10.3791/60991 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter