Caenorhabditis elegans의 열 충격 반응 유도를 측정하는 표준화된 방법

열 충격 반응(HSR)은 온도 상승 및 기타 프로테오독성 응력에 의한 세포자극 단백질 오폴딩에 의해 유도된 보편적인 세포 응력 반응이다. Caenorhabditis elegans에서 HSR의 활성화는 hsp-70 및 hsp-16.2와 같은 열 충격 유전자의 전사 업 규제로 이어집니다. 많은 열 충격 단백질 (HSP)은 잘못 접히거나 손상된 단백질과 직접 상호 작용하여 단백질 접이식 항상성 또는 프로테오스타증을 복원하는 분자 보호자로 기능합니다. HSR의 마스터 레귤레이터는 전사 인자 열 충격 계수 1 (HSF-1)이며, 그 활성화는 여러 메커니즘^1을통해 우아하게 제어됩니다.

HSF-1의 역할은 스트레스에 국한되지 않습니다. HSF-1은 정상적인 성장과 발달을 위해 필요하며, hsf-1의 삭제는 애벌레 체포^2로이어집니다. HSF-1은 또한 단백질 골재의 축적 및 프로테오스타증을 유지하는 무능력을 특징으로 하는 노화 및 노화 관련 신경 퇴행성 질환 중에 중요합니다. hsf-1의 녹다운은 단백질 응집체의 축적과 수명을 단축시키는 동시에 hsf-1의 과발현은 단백질 응집을 감소시키고 수명을^3,,4로연장한다. 따라서 분자 수준에서 HSF-1의 조절은 유기체 생리학 및 질병에 광범위한 영향을 미칩니다.

C. elegans는 HSR이 분자, 세포 및 유기체 수준^{,4,,5,6에서}측정될 수 있기 때문에 HSR 연구를 위한 강력한 모델 유기체이다. 이 모델의 힘을 강조하는 HSR 조절의 조직별 차이와 같은 HSR 통로를 델린팅하는 주요 발전은 C. elegans^7,,8에서발견되었습니다. 또한, C. elegans는 노화 연구에 널리 사용되며 프로테오스타증 중단과 관련된 질병을 모델링하기위한 새로운 시스템입니다.

C. elegans와의 열 충격 실험은 빠르고 재현 할 수 있지만 시작하기 전에 고려해야 할 몇 가지 질문이 있습니다. 예를 들어 HSR 유도에 어떤 온도를 사용해야 하는지, 웜을 얼마나 오래 노출해야 합니까? 마른 인큐베이터 나 수조를 사용하는 것이 더 낫습니까? 어떤 발달 단계를 사용해야 합니까? 불행히도 HSR을 조사하는 데 사용되는 방법론은 실험실마다 크게 다르며 최상의 방법론을 선택하고 현장에서 결과를 비교하기가 어려울 때 혼란을 일으킵니다.

우리는 HSR을 측정하기 위해 RT-qPCR, 형광 기자 및 열회수를 사용하기위한 견고하고 표준화 된 프로토콜을 제시합니다. 이 세 가지 방법은 상호 보완적이지만 각각 고유한 장점과 단점이 있습니다. 예를 들어, RT-qPCR은 HSR의 가장 직접적이고 정량적 측정이며, 이러한 분석서는 많은 상이한 열 충격 유도 유전자를 포함하도록 쉽게 확장될 수 있다. 그러나 RT-qPCR은 가장 비싸고 기술적으로 어려울 수 있으며 특수 장비의 사용이 필요합니다. 대조적으로, 형광 기자는 HSR 유도에 있는 조직 특정 다름을 측정하는 이점이 있습니다. 그러나, 그(것)들은 정확하게 양수하기 어렵고, 특정 임계값 이상 유도를 측정할 수 있고, 형광 현미경의 사용을 요구합니다. 또한, 여기에 설명된 리포터 균주는 표준 N2 균주에 비해 개발지연된다. 단일 복사 전진을 포함하는 새로운 리포터 균주를 사용할 수 있지만 여기에서 테스트되지 않았습니다^9. 세 번째 분석, 열회수는 유기체 수준에서 생리학적으로 관련된 판독을 제공하는 장점이 있다. 그러나,이 분석은 틀림없이 가장 민감하고 가장 간접적입니다. 마지막으로, 우리는 이 사실학에서 찾아낸 몇몇 일반적인 변이를 토론하고 이 필드에 있는 연구를 촉진하기 위하여 모범 사례의 세트를 제안합니다.

1. C. 예인자의 유지 보수 및 동기화

1. OP50 에슈리치아 대장균 균으로 시드된 선충 성장 매체(NGM) 플레이트에 20°C의 벌레를 유지하여 여러 성인을 주^10주에약 2배씩 신선한 접시로 이송한다. 이 그들의 생리학에 영향을 미칠 수 있기 때문에 음식이 부족에서 벌레를 방지하기 위해 주의해야한다^11.
   1. NGM 플레이트준비.
      1. NaCl 3 g, 바토 펩톤 2.5g, 한천 20g, 탈이온화(DI) H₂O 최대 1L를 플라스크에 섞는다.
      2. 멸균을 위한 혼합물을 자동 클로브합니다.
      3. 혼합물을 ~50°C로 식힙니다.
      4. 1M KH₂PO₄ (pH = 6) 1 mL 의 25 mL을 추가, 1 M CaCl_2의1 mL, 1 M MgSO_4의1 mL, 콜레스테롤 1 mL (100 % 에탄올에서 5 mg / mL).
      5. 멸균 기술을 사용하여 혼합물을 6cm 플레이트에 부어 약 100 플레이트를 산출합니다. 혼합물이 먼저 300mL 멸균 비커로 전달되면 플레이트를 붓는 것이 더 쉽습니다.
      6. 박테리아로 파종하거나 4°C에서 저장하기 전에 실온(RT)에서 고형화할 수 있도록 1일을 허용하십시오.
   2. NGM 플레이트에 OP50 박테리아의 파종.
      1. 30°C 또는 37°C에서 LB에서 포화 하룻밤 OP50 세균 배양을 성장시다.
      2. 배양의 약 300 μL을 NGM 플레이트의 중앙에 놓습니다.
      3. 세균 잔디가 접시에 부착하는 데 필요한 대로 1-3 일 동안 RT에서 접시를 건조시키십시오. 그런 다음 플레이트를 4°C에서 사용하거나 저장할 수 있습니다.
2. 새로 낳은 계란(여기에 설명된)을 분리하거나 표백제로 벌레를 용해한 후 계란을 수집하여 벌레를 동기적으로 성장시키세요.
   1. 약 10개의 그레이드 성인용 웜을 백금 와이어 픽을 사용하여 신선한 접시에 옮기십시오. 어른이 성인의 첫날에 있는 경우에 계란 평신도 동기화는 가장 잘 작동합니다.
   2. 약 1 시간 후에 플레이트에서 웜을 제거합니다. 이 조건 및 변형에 따라 접시 당 40-60 계란 귀착되 야 한다.

2. HSR 기자의 형광 화상 진찰

1. 웜(섹션 1.2)을 동기화하고 원하는 발달 단계까지 20°C에서 유지합니다. AM446(hsp-70p:gfp)과CL2070(hsp-16.2p::gfp)의경우, 아직 생식 성숙도에 도달하지 않은 젊은 성인 벌레가 달걀 누워 동기화 후 64h를 생성한다.
   참고: 개발 타이밍은 각 변형과 웜이 발생하는 온도에 따라 다릅니다. 두 HSR 리포터 균주는 N2에 비해 약간의 발달 지연을 나타낸다. 중요한 것은, HSR 유도의 크기는 생식 성숙의 개시 후에 대략 2-4 배 감소합니다 (토론 참조).
2. 파라핀 필름으로 플레이트를 감싸고 순환 하는 수조에 1 h를 대 고 침수 하 여 벌레를 열 충격. 파라핀 필름의 얇은 스트립은 가장자리를 밀봉하기 위해 접시 주위에 2 배 포장해야합니다. 플레이트의 바닥을 덮지 않거나 열 전달을 방해할 수 있습니다. 테스트 튜브 랙과 리드 무게를 사용하여 플레이트를 거꾸로 잠급합니다. 필요한 경우 음수 제어 샘플(열 쇼크 없음)을 포함해야 합니다.
   참고: 파라핀 필름이 안전하지 않으면 물이 플레이트에 들어가면 플레이트를 데이터 수집에 사용해서는 안 됩니다.
3. 수조에서 접시를 제거하고 종이 타월로 건조하여 벌레를 복구합니다. 파라핀 필름을 제거하고 6-24h동안 20°C에서 웜을 배양한다. 이 복구 기간은 이미징 전에 GFP 합성 및 접기에 충분한 시간을 허용합니다.
4. 이미징을 위한 슬라이드를 준비합니다. 슬라이드는 사용마다 신선하게 준비해야 합니다.
   1. 아가로즈가 용해될 때까지 전자레인지를 사용하여 물과 열로 3% 아가로즈 용액을 만듭니다.
   2. 아가로즈 패드용 스페이서를 만들기 위해 실험실 테이프 스트립이 있는 두 개의 다른 현미경 슬라이드 사이에 이미징을 위한 현미경 슬라이드를 배치합니다.
   3. 1,000 μL 파이펫을 사용하여 가열된 3% 아가로즈의 드롭(~150 μL)을 현미경 슬라이드의 중앙에 놓습니다.
   4. 상단 슬라이드가 인접한 슬라이드의 실험실 테이프에 놓이도록 첫 번째 슬라이드에 수직으로 빈 현미경 슬라이드로 현미경 슬라이드를 즉시 덮습니다. 이것은 균일 한 폭의 패드를 만들기 위해 아가로즈의 방울을 확산.
   5. 조심스럽게 상단 슬라이드를 제거합니다.
5. 200 μL 파이펫을 사용하여 M9 버퍼에 1mM 레바미솔의 작은 낙하(~5 μL)를 아가로즈 패드의 중앙에 추가하여 웜을 고정합니다. 그런 다음 백금 와이어 픽을 사용하여 10 개의 웜을 레바미솔 드롭으로 옮길 수 있습니다. 커버 슬립으로 덮습니다. 덮개 전표를 밀봉하는 것은 직립 현미경을 위해 필요하지 않습니다. 선택적으로, 벌레는 레바미솔을 벗겨내고, 아가로즈 패드의 바깥쪽으로 퍼지고, 벌레를 백금 와이어 픽으로 정렬하여 마비될 때 정렬될 수 있다. 또는, 레바미솔은 실험실 닦아를 사용하여 담글 수 있습니다.
   참고: 레바미솔의 장기간 잠복이 형광을 바꿀 수 있기 때문에 가능한 한 빨리 이미지.
6. 형광 현미경을 사용하여 웜을 이미지합니다. 이미지 캡처의 세부 사항은 현미경 과 소프트웨어에 따라 다릅니다.
   참고: 이미지 강도를 직접 비교하려면 한 이미징 세션에서 동일한 현미경 설정을 사용합니다. 이미지를 과도하게 사용하지 마십시오.

3. RT-qPCR을 이용한 HSR 유전자 발현 측정

1. 웜(섹션 1.2)을 동기화하고 원하는 발달 단계까지 20°C에서 유지합니다. N2 벌레의 경우, 아직 생식 성숙도에 도달하지 않은 젊은 성인 벌레는 계란 누워 동기화 후 60 h를 생성합니다.
   참고: 개발 타이밍은 각 변형과 웜이 발생하는 온도에 따라 다릅니다. 중요한 것은, HSR 유도의 크기는 생식 성숙의 개시 후에 대략 2-4 배 감소합니다 (토론 참조).
2. 단계 2.2에 설명된 열 충격 벌레.
3. 수조에서 접시를 꺼내 파라핀 필름을 제거하고 즉시 벌레를 수집합니다. 벌레는 M9의 1mL로 부드럽게 판을 세척하고, 마이크로 원심 분리기 튜브에서 액체를 수집한 다음, 원심 분리 후 M9을 1 분 동안 400 x g에서 제거하여 수집 할 수 있습니다.
4. 벌레를 lyse하고 유기 추출을 사용하여 RNA를 정화합니다.
   1. RNA 격리 시약250μL를 추가합니다(재료표참조).
   2. 30 초 동안 손으로 소용돌이 튜브.
   3. 마이크로센트심분리기 튜브 부착물을 사용하여 4°C에서 20분 동안 소용돌이 튜브(재료 표참조).
   4. 50 μL의 클로로폼을 추가합니다.
   5. 30 초 용 소용돌이.
   6. 3 분 동안 RT에서 샘플을 배양.
   7. 4°C에서 15분 동안 ≥14,000 x g의 원심분리기.
   8. 수성 층(즉, 위층, ~125 μL)을 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기습니다.
      참고: 인터페이스의 유기 층과 재질을 피하십시오.
   9. 50 μL의 클로로폼을 추가합니다.
   10. 30 초 용 소용돌이.
   11. 3 분 동안 RT에서 샘플을 배양.
   12. 4°C에서 5분 동안 ≥14,000 x g의 원심분리기.
   13. 수성 층(~100 μL)을 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기습니다.
       참고: 인터페이스의 유기 층과 재질을 피하십시오.
   14. 이소프로판올의 동일한 부피(즉, 100 μL)를 가진 RNA를 침전시한다.
   15. 적어도 30 분 동안 -20 °C에서 배양하지만 바람직하게는 하룻밤.
       참고: 실험은 여기서 일시 중지될 수 있고 RNA는 -20°C에서 저장될 수 있다.
   16. 4°C에서 ≥30 분동안 ≥14,000 x g에서 원심분리로 RNA를 펠렛.
   17. 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상체를 제거하십시오.
       참고: 펠릿이 작아 보이지 않을 수 있습니다. 펠릿은 튜브의 측면에 단단히 부착되지 않을 수 있으므로 불고있는 것을 피하기 위해주의가 필요합니다.
   18. RNase 프리 H₂O로 만든 70 % 얼음 차가운 에탄올의 250 μL로 펠릿을 씻으십시오.
   19. 4°C에서 ≥5 분동안 ≥14,000 x g의 원심분리기.
   20. 펠릿을 방해하지 않고 가능한 한 많은 상체를 제거하십시오.
   21. RT에서 빠른 스핀을 수행하여 나머지 70%의 에탄올을 제거합니다.
   22. 필요에 따라 RT에서 튜브를 열어 두어 펠릿을 건조시키십시오. 일반적으로 적어도 20 분. 튜브는 오염을 방지하기 위해 보풀이없는 조직 또는 알루미늄 호일로 덮여 있을 수 있습니다.
   23. RNase 프리 H₂O의 20 μL에서 펠릿을 다시 중단합니다.
   24. 소량 분광광계(2 μL)를 사용하여 RNA 농도를 결정한다.
       참고: 실험은 여기에서 일시 중지될 수 있고 RNA는 -20°C 이하에서 일시적으로 저장될 수 있다.
5. DNase I로 배양하여 잔류 DNA를 제거합니다. 시판되는 키트(재료 표 참조)를 사용하고 제조업체의지침을 따르는 것이 좋습니다.
   1. 이 키트를 사용하면 37°C 수조에서 RNA 500 ng 및 DNase I의 1 μL로 20 μL 반응을 30분 동안 준비합니다.
   2. 각 샘플에 DNase 비활성화 시약(키트에 포함)의 2.5μL을 추가하고 RT에서 5분 동안 비큐어를 가끔 깜박임/소용돌이로 배양합니다.
   3. 2 분 동안 14,000 x g에서 아래로 회전합니다.
   4. 흰색 펠릿을 방해하지 않고, cDNA 합성을 위한 신선한 마이크로튜브로 15 μL의 체퍼를 옮기.
6. cDNA 합성을 실시합니다. 시판되는 키트(재료 표 참조)를 사용하고 제조업체의지침을 따르는 것이 좋습니다.
   1. 키트를 사용하면, 이전 단계에서 DNase I 처리 RNA의 15 μL 및 역 전사의 1 μL로 20 μL 반응을 준비한다.
   2. cDNA 합성을 위해 다음 프로그램을 사용하십시오: 5분 동안 25°C, 20분 동안 46°C, 1분 동안 95°C, 4°C 홀드.
   3. 샘플에 직접 RNase 가없는 H₂O의 80 μL을 추가하여 cDNA를 희석시 희석시.
   4. 잠시 소용돌이를 한 다음 회전하여 필요할 때까지 -20 °C에 보관하십시오.
7. qPCR을 수행합니다. 시판되는 키트(재료 표 참조)를 사용하고 제조업체의지침을 따르는 것이 좋습니다.
   1. 키트를 사용하면 2μL의 cDNA 와 200nM(각)의 전방 및 역 프라이머를 96웰 플레이트의 한 웰에 포함하는 25 μL 반응을 준비합니다.
   2. 열 충격 유전자, hsp-70 및 hsp-16.2및 18S rRNA(정규화 제어를 위한)를 측정하기 위한 프라이머 서열이 재료표에나열된다. 여러 정규화 컨트롤을 원하는 대로 사용할 수 있습니다.
   3. 분석이 선형 범위에 있는지 확인하기 위해 18S의 측정 전에 cDNA 샘플을 50배 희석합니다. 적절한 qPCR 조건은 사용되는 키트 및 프라이머에 따라 다릅니다(대표 결과 참조).
   4. 5s 데니션용 95°C의 40사이클, 30s 어닐링용 58°C, 30s 확장을 위한 72°C의 qPCR용 실시간 PCR 검출 시스템(재료 표참조)을 사용한다.
      참고: 최적의 어닐링 온도는 프라이머와 조건에 따라 다를 수 있습니다.
   5. ΔΔCt 또는 표준 곡선^{방법(12)을}사용하여 정량화한다.

4. 유기 수준에서 HSR을 측정하기위한 열회수 분석

1. 웜(섹션 1.2)을 동기화하고 원하는 발달 단계까지 20°C에서 유지합니다. N2 벌레의 경우, 아직 생식 성숙도에 도달하지 않은 젊은 성인 벌레는 계란 누워 동기화 후 60 h를 생성합니다.
   참고: 개발 타이밍은 각 변형과 웜이 발생하는 온도에 따라 다릅니다. 중요한 것은, HSR 유도의 크기는 생식 성숙의 개시 후에 대략 2-4 배 감소합니다 (토론 참조).
2. 6h에 대해 2.2 단계에서 설명된 바와 같이 벌레를 열 충격.
3. 수조에서 플레이트를 제거하고 파라핀 필름을 제거하고 웜이 48h에 대해 20°C에서 20°C에서 배양하여 회수할 수 있도록 합니다.
4. 육포 운동이나 마비없이 기계적 자극 후 즉시 기어 갈 수있는 웜의 수를 계산합니다.
   참고: 6h 인큐베이션은 열회수를 줄이는 조건을 검사하는 데 최적이지만 열회수를 향상시키는 조건을 찾기 위해 더 긴 노출 시간이 필요할 수 있습니다.

이 원고에 설명된 프로토콜을 사용하여 HSR 유도는 형광 기자, RT-qPCR 및 열회수 분석서를 사용하여 측정되었습니다. 각각의 경우에, 섹션 1.2의 절차는 생식 성숙에 도달하지 않은 동기화된, 젊은 성인 벌레를 생성하기 위하여 이용되었습니다.

세포 수준에서 HSR 유도를 시각화하기 위해AM446(hsp-70p:gfp)및 CL2070(hsp-16.2p::gfp) 형광 기자 균주는 프로토콜의 섹션 2에 따라 분석되었다.hsp-16.2p::gfp 열충격이 없는 음성대조군 시료에서 hsp-16.2 기자는 정상적인 자동형광만 보였지만, hsp-70 기자는 항문우울근내의 결산형 형광을 이전에보고한 4(도1A)였다.Figure 1 33°C에서 1h의 열 충격 후, 두 기자 모두에서 강력한 형광이 관찰되었다. 그러나, 표현의 패턴은 어떤 기자가 사용되었는지(그림1B)에따라 구별되었다. hsp-70 기자는 창자와 정자에서 가장 밝았고 hsp-16.2 기자는 인두에서 가장 밝습니다. 또한 hsp-16.2 기자는 이전에 설명한 대로 유도량이 높은 웜-투-웜 가변성을 보였지만 hsp-70 기자는13도되지 않았다.

섹션 2의 일반적으로 사용되는 변화는 순환 수조 대신 건조 인큐베이터에서 열 충격을 수행하는 것입니다. 따라서 두 방법론 간의 차이도 테스트되었습니다. 순환하는 수조가 모범 사례로 권장되지만 두 프로토콜 모두 우리의 조건을 사용하여 두 형광 기자의 강력한 유도를 초래한 것으로 나타났습니다 (토론 참조)(그림 1B).

전사 인자 HSF-1에 대한 기자들의 의존성을 테스트하기 위해, RNAi를 공급하는 것은 기자 유도를 측정하기 전에 hsf-1을 노크하는 데 사용되었다. 이 기자들이 문학4(도 2)에기재된 바와 같이 HSF-1 에 의존하는 것을 나타내는 HSF-1 녹다운시 두 균주의 형광이 심각하게 감소된 것으로 나타났다. 그러나, 또한 인두 형광이 hsf-1 녹다운시 두 기자모두에서 지속되는 것으로 관찰되었으며, 이는 인두 근육이14를공급하여 RNAi에 내성이 있다는 이전 보고서와 일치한다.

분자 수준에서 HSR의 전체 웜 유도를 양량화하기 위해, 2개의 내인성 HSP는 프로토콜의 섹션 3를 사용하여 RT-qPCR로 측정되었다. 샘플은 트리플리케이트로 측정되었고, 각 프라이머에 대해 표준 곡선이 생성되었고, 품질 관리를 위해 각 샘플에 대해 용융 곡선을 분석하였다. 1h에 대한 33°C 열 충격으로 2개의 열 충격 유전자, hsp-70 및 hsp-16.2(도 3)에대한 상대발현이 2,000배 이상 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 두 내인성 유전자가 HSR 유도를 측정하기에 적합하며 1h에 대한 33°C 열 충격이 상당한 반응을 생성하기에 충분하다는 것을 보여준다. 그러나 열 충격이 없는 mRNA 수준이 매우 낮기 때문에 절대 정도의 열 충격 유도를 해석하는 데 주의해야 한다.

열 충격에 대한 생리적 반응을 분석하기 위해, 유기체 열회수 분석은 프로토콜의 섹션 4를 사용하여 시험되었다. 33°C에서 6h 열 충격에 벌레의 노출이 48h 회복 후 정상적인 움직임을 가진 벌레의 20% 감소를 초래한 것으로나타났다(그림4A). HSF-1 전사 인자에 대한 이 분석법의 의존성은 스트레스에 벌레를 노출하기 전에 HSf-1을 노크하기 위해 RNAi를 먹이는 것으로 테스트되었습니다. hsf-1의 넉다운이 정상적인 움직임에 극적인 감소를 일으킨 것으로 나타났으며, 95%의 벌레가 백금 와이어 픽으로 튀어나온 후 육포 운동이나 마비를 보였습니다.

우리는 일반적으로 열성편성이라고 불리는 널리 사용되는 대체 유기체 분석과 이 열회수 분석체를 비교했습니다. 열편도 분석에서, 벌레는 건조한 인큐베이터를 사용하여 연속 35°C 온도에 노출되고, 살아있는 벌레의 백분율은 다양한 시점에서 측정된다. 이 분석기를 이용하여, 35°C에 지속적으로 노출된 제어 벌레가 약 8시간 노출 후 사망한 것으로나타났다(도 4B). 그러나, HSF-1에 대한 이 분석의 의존성이 RNAi 녹다운을 사용하여 시험되었을 때, hsf-1의 억제가 열성 편협의 감소를 일으키지 않는 것으로 나타났다. 유사한 결과는 이전에 HSF-1 돌연변이를 사용하여 표시되었습니다 (토론 참조). 따라서, HSR을 측정하기 위한 열편협의 분석법을 사용하는 것은 권장되지 않으며, 열회수는 유기체 수준에서 HSR을 검사하는 것이 바람직한 방법이다.

그림 1: 형광 기자로 측정된 HSR 유도. (A)기저 및(B) hsp-70p::gfp 및 hsp-16.2p::gfp 리포터균주는 수조 또는 인큐베이터에서 33°C에서 열 충격 1h 후 균주한다. 벌레는 OP50 박테리아에서 64h에 대해 제기되었고, 열은 충격을 받은 다음 이미징 전에 8 시간 동안 20 °C에서 회복되었습니다. 참고로, 열충격 웜(A)의 열충격 웜이(B)에서재정규화되지 않은 벌레는 열충격 웜의 범위 및 채도에 일치하도록 재정규화되었다.B 두 개의 실험 복제의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 스케일 바 = 250 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

그림 2: 형광 기자로 측정된 HSR 유도는 HSF-1에 의존한다. hsp-70p:gfp 및 hsp-16.2p::gfp 기자는 64h에 대한 제어(L4440 빈 벡터) 또는 hsf-1 RNAi 플레이트에 올려진 후, 수조에서 33°C에서 1h 열 충격에 노출된 다음 이미징 전에 8h에 대해 20°C에서 회수하였다. 두 개의 실험 복제의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 스케일 바 = 250 μm. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

그림 3: RT-qPCR로 측정된 HSR 유도. N2 벌레는 HT115 박테리아에서 60h를 위해 제기한 다음 33°C 수조에서 1h로 충격을 받았다. hsp-70(C12C8.1) 및 hsp-16.2의 상대적인 mRNA 수준은 열 충격 제어 없이 정규화된 것으로 나타났다. 플롯된 값은 4개의 생물학적 복제및 오류 막대의 평균이 ±SEM을 나타냅니다. 통계적 유의성은 짝이 없는 학생의 t-테스트를 사용하여 계산하였다. **p & 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 열성 편협이 아닌 열회수는 HSF-1에 의존합니다. N2 웜은 60시간 동안 제어(L4440) 또는 hsf-1 RNAi 플레이트에 올려진 다음 중 하나에 이동하였다: (A) A 33°C 수조6h에 대한 20°C에서 48시간 동안 회수한 후 정상적인 운동(열회수) 또는 (B) A 35°C 건조 인큐베이터(열)를 채점하고 모든 hh를 제거하였다. 각 분석은 2 독립적 인 일에 n ≥ 30 개인으로 수행되었다. 평균이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 공개 할 것이 없습니다.