Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Standardiserede metoder til måling af induktion af varmechokresponsen i Caenorhabditis elegans

Published: July 3, 2020 doi: 10.3791/61030
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical and Chemical Engineering and Sciences, Florida Institute of Technology

Summary

Her præsenteres standardiserede protokoller for at vurdere induktion af varmechokresponsen (HSR) i Caenorhabditis elegans ved hjælp af RT-qPCR på molekylært niveau, fluorescerende journalister på celleniveau og thermorecovery på organismalniveau.

Abstract

Den varme chok respons (HSR) er en cellulær stress respons induceret af cytosolic protein misfolding, der fungerer til at genoprette protein folde homøostase, eller proteostase. Caenorhabditis elegans indtager en unik og kraftfuld niche for HSR forskning, fordi HSR kan vurderes på molekylære, cellulære, og organismeniveau. Derfor kan ændringer på molekylært niveau visualiseres på celleniveau, og deres indvirkning på fysiologien kan kvantificeres på organismalniveau. Mens analyser til måling af HSR er ligetil, variationer i timing, temperatur og metode, der er beskrevet i litteraturen gør det udfordrende at sammenligne resultater på tværs af undersøgelser. Desuden fungerer disse spørgsmål som en barriere for alle, der ønsker at indarbejde HSR-analyse i deres forskning. Her præsenteres en række protokoller til måling af induktion af HSR på en robust og reproducerbar måde med RT-qPCR, fluorescerende reportere og en organismeorisk thermorecovery-analyse. Derudover viser vi, at en udbredt termosttoleranceanalyse ikke er afhængig af den veletablerede master regulator af HSR, HSF-1, og derfor ikke bør anvendes til HSR forskning. Endelig, variationer i disse analyser findes i litteraturen diskuteres og bedste praksis er foreslået for at hjælpe standardisere resultater på tværs af området, i sidste ende lette neurodegenerative sygdomme, aldring, og HSR forskning.

Introduction

Varmechokresponsen (HSR) er en universel cellulær stressrespons fremkaldt af cytosolic proteinfejlfolding forårsaget af temperaturstigninger og andre proteotoksiske belastninger. Aktivering af HSR i Caenorhabditis elegans fører til transskriptionel upregulation af varmechok gener såsom hsp-70 og hsp-16.2. Mange varmechok proteiner (HSP) fungerer som molekylære chaperoner, der genopretter protein folde homøostase, eller proteostase, ved direkte at interagere med fejlfoldede eller beskadigede proteiner. HSR's hovedregulator er transskriptionsfaktoren Heat Shock Factor 1 (HSF-1), hvis aktivering styres elegant via flere mekanismer1.

HSF-1's rolle er ikke begrænset til stress. HSF-1 er nødvendig for normal vækst og udvikling, som sletning af hsf-1 fører til larve anholdelse2. HSF-1 er også vigtigt under aldring og aldersrelaterede neurodegenerative sygdomme karakteriseret ved ophobning af protein aggregater og en manglende evne til at opretholde proteostase. Knockdown af hsf-1 forårsager ophobning af proteinaggregater og en forkortet levetid, mens overekspression af hsf-1 reducerer protein sammenlægning og forlængerlevetiden 3,4. Derfor har regulering af HSF-1 på molekylært niveau brede konsekvenser for organismal fysiologi og sygdom.

C. elegans er en kraftfuld model organisme for HSR forskning, fordi HSR kan måles på molekylære, cellulære, og organismeniveau4,,5,6. Fremhæve magt denne model, centrale fremskridt i delineating HSR vej, såsom væv-specifikke forskelle i HSR regulering, er blevet opdaget i C. elegans7,8. Desuden er C. elegans meget udbredt til aldrende forskning og er et nyt system til modellering af sygdomme forbundet med proteostase forstyrrelser.

Selvom varmechok eksperimenter med C. elegans kan være hurtig og reproducerbar, der er flere spørgsmål at overveje, før du begynder. For eksempel, hvilken temperatur skal anvendes til induktion af HSR og hvor længe skal ormene blive udsat? Er det bedre at bruge en tør inkubator eller et vandbad? Hvilken udviklingsfase skal anvendes? Desværre, de metoder, der anvendes til at undersøge HSR varierer meget fra laboratorium til laboratorium, forårsager forvirring, når du vælger de bedste metoder og gør det vanskeligt at sammenligne resultater på tværs af feltet.

Vi præsenterer robuste og standardiserede protokoller for brug af RT-qPCR, fluorescerende journalister, og thermorecovery at måle HSR. Mens disse tre tilgange er komplementære, de hver især har unikke fordele og ulemper. For eksempel er RT-qPCR den mest direkte og kvantitative måling af HSR, og denne analyse kan let udvides til at omfatte mange forskellige varmechok-inducerende gener. Men RT-qPCR er den dyreste, kan være teknisk vanskeligt, og kræver brug af specialiseret udstyr. I modsætning hertil har fluorescerende journalister den fordel at måle vævsspecifikke forskelle i HSR induktion. Men de er vanskelige at kvantificere præcist, kan kun måle induktion over en vis tærskel, og kræver brug af en fluorescens mikroskop. Derudover er de reporter stammer, der er beskrevet her, udviklingsmæssigt forsinket i forhold til standard N2-stammen. Selv om nyere reporter stammer, der indeholder enkelt-kopi transgener er tilgængelige, er de ikke blevet testet her9. Den tredje analyse, thermorecovery, har den fordel, at den giver en fysiologisk relevant udlæsning på organismeniveau. Men denne analyse er velsagtens den mindst følsomme og mest indirekte. Endelig diskuterer vi nogle fælles variationer, der findes i disse analyser, og foreslår en række bedste praksis for at lette forskningen på dette område.

Protocol

1. Vedligeholdelse og synkronisering af C. elegans

  1. Vedligehold orme ved 20 °C på Nematode Growth Medium (NGM) plader sået med OP50 Escherichia coli bakterier ved at overføre flere voksne til friske plader ca 2x per uge10. Der skal udvises forsigtighed for at forhindre orme i at løbe tør for mad, da dette kan påvirke deres fysiologi11.
    1. Forberedelse af NGM plader.
      1. Der blandes 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-peptone, 20 g agar og deioniseret (DI) H2O op til 1 L i en kolbe.
      2. Autoklave blandingen til sterilisering.
      3. Blandingen afkøles til ~50 °C.
      4. Der tilsættes 25 ml 1 M KH2PO4 (pH = 6), 1 ml 1 M CaCl2,1 ml 1 M MgSO4og 1 ml kolesterol (5 mg/ml i 100% ethanol).
      5. Ved hjælp af steril teknik, hæld blandingen i 6 cm plader til at give ca 100 plader. Hældeplader er lettere, hvis blandingen først overføres til en 300 ml sterilt bægerglas.
      6. Lad 1 dag størkne ved stuetemperatur (RT), før der sås med bakterier eller opbevares ved 4 °C.
    2. Såning af OP50 bakterier på NGM plader.
      1. Der dyrkes en mættet OP50-bakteriekultur natten over i LB ved 30 °C eller 37 °C.
      2. Placer ca. 300 μL af kulturen på midten af en 6 cm NGM plade.
      3. Lad pladerne tørre ved RT i 1-3 dage efter behov for, at bakteriegræsplænen klæber til pladen. Pladerne kan derefter anvendes eller opbevares ved 4 °C.
  2. Dyrk ormene synkront enten ved at isolere frisklagte æg (beskrevet her) eller alternativt ved at indsamle æg efter opløsning af orme med blegemiddel.
    1. Overfør ca. 10 voksne orme til en frisk plade ved hjælp af et platintrådspick. Æg-lå synkronisering fungerer bedst, hvis de voksne er i den første dag i voksenalderen.
    2. Efter ca. 1 time fjernes ormene fra pladen. Dette bør resultere i 40-60 æg pr plade, afhængigt af betingelserne og stammen.

2. Fluorescerende billeddannelse af HSR-journalister

  1. Ormene (punkt 1.2) synkroniseres, og der holdes ved 20 °C indtil den ønskede udviklingsfase. For AM446 (hsp-70p::gfp) og CL2070 (hsp-16.2p::gfp) fluorescerende reporter stammer, unge voksne orme, der endnu ikke har nået reproduktiv modenhed genereres 64 h efter æglæggende synkronisering.
    BEMÆRK: Udviklingstiming varierer afhængigt af hver stamme og den temperatur, hvormed ormene hæves. Begge HSR reporter stammer udviser en lille udviklingsmæssige forsinkelse i forhold til N2. Det er vigtigt, at størrelsen af HSR induktion falder ca 2-4x efter udbrud af reproduktiv modenhed (se Diskussion).
  2. Ved opvarmningen afdæmpes ormene ved indpakning af plader med paraffinfilm og nedsænkning i et cirkulerende vandbad ved 33 °C i 1 h. En tynd strimmel paraffinfilm skal pakkes 2x rundt om pladen for at forsegle kanterne. Tildæk ikke bunden af pladen, da den kan forstyrre varmeoverførslen. Nedsænk pladerne på hovedet ved hjælp af en reagensglas rack og en blyvægt. Husk at inkludere en negativ kontrolprøve (ingen varmechok), hvis det er nødvendigt.
    BEMÆRK: Hvis paraffinfilmen ikke er sikker, kommer der vand ind i pladen, og pladen må ikke bruges til dataindsamling.
  3. Gendan ormene ved at fjerne pladerne fra vandbadet og tørring med en køkkenrulle. Paraffinfilmen fjernes, og ormene inkuberes ved 20 °C i 6-24 timer. Denne restitutionsperiode giver tilstrækkelig tid til GFP syntese og foldning før billeddannelse.
  4. Forbered dias til billedbehandling. Slides skal tilberedes frisk til hver brug.
    1. Lav en 3% agarose opløsning i vand og varme ved hjælp af en mikrobølgeovn, indtil agarose er opløst.
    2. Placer et mikroskop dias til billeddannelse mellem to andre mikroskop dias, der har en stribe af laboratorietape på dem for at skabe en afstandsstykke til agarose pad.
    3. Ved hjælp af en 1.000 μL pipette anbringes en dråbe (~150 μL) af den opvarmede 3% agarose i midten af mikroskopdiaset.
    4. Dæk straks mikroskopdiaset med et tomt mikroskop, der er vinkelret på det første objektglas, således at det øverste objektglas hviler på laboratorietape på de tilstødende objektglas. Dette spreder ud dråbe agarose at skabe en pude af ensartet bredde.
    5. Fjern forsigtigt den øverste slide.
  5. Immobiliser ormene ved hjælp af en 200 μL pipette til at tilføje en lille dråbe (~ 5 μL) på 1 mM levamisole i M9 buffer til midten af agarose pad. Derefter overføre 10 orme i dråbe levamisole ved hjælp af en platin wire pick. Dæk med en overtræk. Forsegling af dækslet er ikke nødvendig for et opretstående mikroskop. Eventuelt kan ormene justeres, når de bliver lammet ved at sprede levamisole ud, til ydersiden af agarose pad, og tilpasse orme med en platin wire pick. Alternativt kan levamisoleen opsuges ved hjælp af en laboratorieserviet.
    BEMÆRK: Billede så hurtigt som muligt, fordi langvarig inkubation i levamisole kan ændre fluorescens.
  6. Billede ormene ved hjælp af en fluorescens mikroskop. Detaljerne i billedoptagelse varierer efter mikroskop og software.
    BEMÆRK: Hvis du vil sammenligne billedintensiteter direkte, skal du bruge identiske mikroskopindstillinger i én billedsession. Undgå at overmætte billedet.

3. Måling af HSR-genekspression ved hjælp af RT-qPCR

  1. Synkroniser orme (punkt 1.2) og hold ved 20 °C indtil den ønskede udviklingsfase. For N2 orme genereres unge voksne orme, der endnu ikke har nået reproduktionsmodenhed, 60 timer efter synkroniseringen af æglæggende æg.
    BEMÆRK: Udviklingstiming varierer afhængigt af hver stamme og den temperatur, hvormed ormene hæves. Det er vigtigt, at størrelsen af HSR induktion falder ca 2-4x efter udbrud af reproduktiv modenhed (se Diskussion).
  2. Varmechokorme som beskrevet i trin 2.2.
  3. Tag pladerne ud af vandbadet, fjern paraffinfilmen, og saml straks ormene. Ormene kan opsamles ved at vaske pladerne forsigtigt med 1 ml M9, opsamle væsken i et mikrocentrifugerør og derefter fjerne M9 efter centrifugering ved 400 x g i 1 min.
  4. Lyse ormene og rense RNA ved hjælp af organisk ekstraktion.
    1. Der tilsættes 250 μL RNA-isolationsreagens (se Tabel over Materialer).
    2. Vortex rør i hånden i 30 s.
    3. Vortex-rør i 20 min ved 4 °C ved hjælp af et mikrocentrifugerør (se Tabel over Materialer).
    4. Der tilsættes 50 μL chloroform.
    5. Vortex i 30 s.
    6. Prøverne inkuberes ved RT i 3 min.
    7. Centrifuge ved ≥14.000 x g i 15 min. ved 4 °C.
    8. Det vandige lag (dvs. det øverste lag, ~125 μL) overføres til et nyt mikrocentrifugerør.
      BEMÆRK: Undgå det organiske lag og materialet i grænsefladen.
    9. Der tilsættes 50 μL chloroform.
    10. Vortex i 30 s.
    11. Prøverne inkuberes ved RT i 3 min.
    12. Centrifuge ved ≥14.000 x g i 5 min ved 4 °C.
    13. Det vandige lag (~100 μL) overføres til et nyt mikrocentrifugerør.
      BEMÆRK: Undgå det organiske lag og materialet i grænsefladen.
    14. Bundfald af RNA med et ensartet volumen (dvs. 100 μL) af isopropanol.
    15. Inkuber ved -20 °C i mindst 30 min., men helst natten over.
      BEMÆRK: Forsøget kan sættes på pause her, og RNA'et kan opbevares ved -20 °C.
    16. Pellet RNA ved centrifugering ved ≥14.000 x g for ≥30 min ved 4 °C.
    17. Fjern så meget af supernatanten som muligt uden at forstyrre pelleten.
      BEMÆRK: Pelleten er lille og er muligvis ikke synlig. Pellet kan ikke holde tæt til siden af røret, så forsigtighed er nødvendig for at undgå at løsne den.
    18. Pellet vaskes med 250 μL 70% iskold ethanol fremstillet med RNase-fri H2O.
    19. Centrifuge ved ≥14.000 x g for ≥5 min ved 4 °C.
    20. Fjern så meget supernatant som muligt uden at forstyrre pellet.
    21. Udfør et hurtigt spin på RT for at fjerne eventuelle resterende 70% ethanol.
    22. Tør pellet ved at lade rørene åbne på RT, så længe det er nødvendigt; typisk mindst 20 min. Rør kan dækkes med en fnugfri væv eller aluminiumsfolie for at forhindre forurening.
    23. Opslæmm pellet i 20 μL RNase-fri H2O.
    24. RNA-koncentrationen bestemmes ved hjælp af et lille volumenspektrofotometer (2 μL).
      BEMÆRK: Forsøget kan sættes på pause her, og RNA'et kan opbevares midlertidigt ved eller under -20 °C.
  5. Fjern rest-DNA ved at inkubere med DNase I. Det anbefales at bruge et kommercielt tilgængeligt kit (se Tabel over Materialer) og at følge producentens anvisninger.
    1. Med dette sæt forberedes en 20 μL reaktion med 500 NG RNA og 1 μL DNase I i et 37 °C vandbad i 30 min.
    2. Der tilsættes 2,5 μL DNase-inaktiveringsreagens (inkluderet i sættet) til hver prøve og inkuberes ved RT i 5 minutter med lejlighedsvis svirpende/vortexing.
    3. Spin ned ved 14.000 x g i 2 min.
    4. Uden at forstyrre den hvide pellet overføres 15 μL supernatant til en frisk mikrorør til cDNA-syntese.
  6. Udfør cDNA syntese. Det anbefales at bruge et kommercielt tilgængeligt kit (se Tabel over Materialer) og at følge producentens anvisninger.
    1. Med sættet forberedes en 20 μL reaktion med 15 μL DNase I-behandlet RNA fra det foregående trin og 1 μL omvendt transskription.
    2. Brug følgende program for cDNA syntese: 25 °C i 5 min, 46 °C i 20 min, 95 °C i 1 min, 4 °C hold.
    3. CDNA fortyndes ved at tilsætte 80 μL RNase-fri H2O direkte til prøven.
    4. Kort vortex, derefter spin ned og opbevares ved -20 °C, indtil det er nødvendigt.
  7. Udfør qPCR. Det anbefales at bruge et kommercielt tilgængeligt kit (se Tabel over Materialer) og at følge producentens anvisninger.
    1. Med sættet fremstilles en 25 μL reaktion indeholdende 2 μL cDNA og 200 nM (hver) af frem- og bakprimere i en brønd af en 96-brøndsplade.
    2. Primersekvenser til måling af varmestøbegener, hsp-70 og hsp-16.2og 18S rRNA (til normaliseringskontrol) er anført i materialetabellen. Flere normaliseringskontrolelementer kan bruges som ønsket.
    3. CDNA-prøverne fortyndes 50x før måling af 18S for at sikre, at analysen er i det lineære område. Passende qPCR-betingelser varierer med det anvendte sæt og de anvendte primere (se Repræsentative resultater).
    4. Brug et PCR-detektionssystem i realtid (se Tabel over Materialer) til qPCR med 40 cyklusser på 95 °C til 5 s denaturering, 58 °C for 30 sglødning og 72 °C for 30 s forlængelse.
      BEMÆRK: Optimale glødetemperaturer kan variere afhængigt af primere og forhold.
    5. Kvantificer ved hjælp af enten ΔΔCt eller standardkurvemetode12.

4. Thermorecovery-analyse til måling af HSR på organismeniveau

  1. Ormene (punkt 1.2) synkroniseres, og der holdes ved 20 °C indtil den ønskede udviklingsfase. For N2 orme genereres unge voksne orme, der endnu ikke har nået reproduktionsmodenhed, 60 timer efter synkroniseringen af æglæggende æg.
    BEMÆRK: Udviklingstiming varierer afhængigt af hver stamme og den temperatur, hvormed ormene hæves. Det er vigtigt, at størrelsen af HSR induktion falder ca 2-4x efter udbrud af reproduktiv modenhed (se Diskussion).
  2. Varme stød ormene som beskrevet i trin 2.2 for 6 h.
  3. Pladerne fjernes fra vandbadet, paraffinfilmen fjernes, og ormene kommer sig ved inkubation ved 20 °C i 48 timer.
  4. Tæl antallet af orme, der straks kan kravle væk efter mekanisk stimulation uden rykvis bevægelse eller lammelse.
    BEMÆRK: Inkubationen på 6 timer er optimal til undersøgelse af forhold, der reducerer dækket, men der kan være behov for længere eksponeringstider for at finde frem til forhold, der forbedrer dig.

Representative Results

Ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet i dette manuskript, hsr induktion blev målt ved hjælp af fluorescerende journalister, RT-qPCR, og thermorecovery assays. I hvert tilfælde blev proceduren i afsnit 1.2 brugt til at generere synkroniserede, unge voksne orme, der ikke havde nået reproduktiv modenhed.

For at visualisere HSR induktion på celleniveau, AM446 (hsp-70p::gfp) og CL2070 (hsp-16.2p::gfp) fluorescerende reporter stammer blev analyseret efter afsnit 2 i protokollen. I de negative kontrolprøver uden varmechok viste hsp-16.2-reporteren kun normal autofluorescens, men hsp-70-reporteren havde konstituerende fluorescens i analdepressemimusklen som tidligere rapporteret4 (Figur 1A). Efter 1 time varmestød ved 33 °C blev der observeret robust fluorescens hos begge reportere. udtrykket var imidlertid forskelligt, alt efter hvilket journalisten blev anvendt (figur 1B). Den hsp-70 reporter var lyseste i tarmen og spermatheca, mens hsp-16,2 reporter var lyseste i svælget. Derudover hsp-16,2 reporter havde en høj grad af orm-til-orm variation i mængden af induktion som tidligere beskrevet, men hsp-70 reporter ikke13.

En almindeligt anvendt variation af afsnit 2 er at udføre varmechok i en tør inkubator i stedet for et cirkulerende vandbad. Derfor blev forskellen mellem de to metoder også afprøvet. Det blev konstateret, at begge protokoller resulterede i robust induktion af de to fluorescerende journalister ved hjælp af vores betingelser, selv om en cirkulerende vandbad anbefales som en bedste praksis (se Diskussion) (Figur 1B).

For at teste afhængigheden af journalister på transskription faktor HSF-1, fodring RNAi blev brugt til knockdown hsf-1 før reporter induktion blev målt. Det blev konstateret, at fluorescens af begge stammer blev alvorligt reduceret på HSF-1 knockdown, hvilket indikerer, at disse journalister er HSF-1-afhængige som beskrevet i litteraturen4 (Figur 2). Men det blev også bemærket, at svælg fluorescens fortsatte i begge journalister på hsf-1 knockdown, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter om, at svælg musklen er resistent over for RNAi ved fodring14.

For at kvantificere hele ormen induktion af HSR på molekylært niveau, to endogene HSP'er blev målt med RT-qPCR ved hjælp af afsnit 3 i protokollen. Prøverne blev målt i tre eksemplarer, der blev genereret en standardkurve for hver af primerne, og der blev analyseret en smeltekurve for hver prøve for kvalitetskontrol. Det blev konstateret, at et 33 °C varmechok i 1 time resulterede i mere end en stigning på 2.000 x i relativ ekspression for to varmechokgener, hsp-70 og hsp-16.2 (figur 3). Disse resultater viser, at begge endogene gener er egnede til måling af HSR-induktion, og at et varmechok på 33 °C i 1 time er tilstrækkeligt til at fremsantere en betydelig respons. Der bør dog udvises forsigtighed ved fortolkningen af den absolutte grad af varmechokinduktion, fordi mRNA-niveauerne i mangel af varmechok er meget lave.

For at analysere en fysiologisk reaktion på varmechok blev en organismeanalyse af rygfanget testet ved hjælp af punkt 4 i protokollen. Det blev konstateret, at eksponeringen af orme for et 6 timers varmechok ved 33 °C førte til et fald på 20 % i orme med normal bevægelse efter en restitution på 48 timer (figur 4A). Afhængigheden af denne analyse på HSF-1 transskription faktor blev testet ved hjælp af fodring RNAi til knockdown hsf-1 før udsætter orme til stress. Det blev konstateret, at knockdown af hsf-1 forårsaget et dramatisk fald i normal bevægelse, med > 95% af orme viser rykvise bevægelse eller lammelse efter at være blevet prodded med en platin wire pick.

Vi sammenlignede denne thermorecovery analyse til en udbredt alternativ organisme assay almindeligvis benævnt thermotolerance. I thermotolerance-analysen udsættes orme for en kontinuerlig temperatur på 35 °C ved hjælp af en tør inkubator, og procentdelen af levende orme måles på forskellige tidspunkter. Ved hjælp af denne analyse blev det konstateret, at kontrolorme, der kontinuerligt blev eksponeret for 35 °C, døde efter ca. 8 timer i eksponering (figur 4B). Men når afhængigheden af denne analyse på HSF-1 blev testet ved hjælp af RNAi knockdown, blev det konstateret, at hæmning af hsf-1 ikke forårsage et fald i thermotolerance. Lignende resultater er tidligere blevet vist ved hjælp af HSF-1 mutationer (se Diskussion). Derfor anbefales det ikke at anvende termostalanalysen til at måle HSR, og thermorecovery er den foretrukne metode til undersøgelse af HSR på organismalniveau.

Figure 1
Figur 1: HSR-induktion målt med fluorescerende reportere. (A) Det basale ogB) varmeindkaldende udtryk for hsp-70p::gfp og hsp-16.2p::gfp reporter stammer efter 1 time varmechok ved 33 °C i et vandbad eller en inkubator. Orme blev rejst på OP50 bakterier i 64 timer, varme chokeret, og derefter genvundet ved 20 °C i 8 timer før billeddannelse. Som reference blev ingen varmechokorme i (A) renormaliseret i (B) for at matche rækkevidden og mætninger af de varmechokerede orme. Repræsentative billeder af to eksperimentelle replikater vises. Skalabar = 250 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: HSR-induktion målt med fluorescerende reportere er afhængig af HSF-1. Stammer indeholdende hsp-70p::gfp og hsp-16.2p::gfp reportere blev rejst på kontrol (L4440 tom vektor) eller hsf-1 RNAi plader til 64 h før billeddannelse. Repræsentative billeder af to eksperimentelle replikater vises. Skalabar = 250 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: HSR-induktion målt med RT-qPCR. N2 orme blev rejst på HT115 bakterier i 60 h og derefter varme chokeret i 1 time i en 33 °C vandbad. De relative mRNA-niveauer af hsp-70 (C12C8.1) og hsp-16.2 vises normaliseret til ingen varmechokkontrol. Afbildede værdier er gennemsnit af fire biologiske replikater, og fejllinjer repræsenterer ± SEM. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af en ikke-parret Students t-test. **p < 0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Thermorecovery, men ikke termotolerance, er afhængig af HSF-1. N2 orme blev hævet på kontrol (L4440) eller hsf-1 RNAi plader til 60 h og derefter flyttet til enten: (A) A 33 °C vandbad i 6 h og inddrives ved 20 °C for 48 h før scoring for normal bevægelse (thermorecovery), eller (B) A 35 °C tør inkubator og fjernet hver 2 h indtil død (thermotoler). Hver analyse blev udført med n ≥ 30 personer på 2 uafhængige dage. Gennemsnittet vises. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I litteraturen er en bred vifte af temperaturer, tider og udstyr blevet brugt til at analysere HSR, som har indført unødvendige forbehold og ført til vanskeligheder med at sammenligne resultater mellem laboratorier. For eksempel, temperaturer spænder overalt fra 32-37 °C og gange fra 15 min til flere timer er blevet brugt til at fremkalde HSR15. Det forlyder dog, at dødeligheden forekommer så tidligt som 3 timer ved 37 °C for alle stadier og 1,5 timer for dag 1 voksne15. Desuden viser vi, at eksponering af orme til 35 °C forårsager dødelighed, der ikke er HSF-1 afhængige, hvilket gør disse betingelser dårligt egnet til analyse af HSR. I modsætning hertil er et varmechok på 33 °C i 1 time robust nok til at fremkalde stærk induktion af varmechokgener, men mildt nok til ikke at påvirke ormens levedygtighed. Faktisk, eksponering for 33 °C, så længe 6 h kun forårsager 20% af orme til at vise unormal bevægelse. Derfor foreslår vi at bruge en temperatur på 33 °C og en tid på 1 time som en standardiseret tilstand for RT-qPCR og fluorescerende reporter assays.

Nylige forsøg har vist, at udviklingsmæssige iscenesættelse af orme for HSR eksperimenter er særlig vigtig. Det blev for nylig vist, at i C. elegans den inducerende HSR falder (dvs. kollapser) med >50%, når hermafroditter begynder æglægning5. Iscenesættelse ormene korrekt er kritisk, fordi der ofte er forskelle i udviklingsmæssige timing i stammer transporterer mutationer. Hvis der anvendes temperaturfølsomme mutanter, vil det også påvirke resultaterne, hvis de ikke synkroniseres efter deres fødealder. Derfor anbefales det omhyggeligt at måle starten af æglægning for hver stamme for at afgøre, hvornår sammenbruddet opstår. Tidens vindue efter L4 molt og før påbegyndelse af reproduktiv modenhed er smal; Der skal derfor udvises forsigtighed, så HSR-kollapset ikke utilsigtet forårsager variabilitet i resultaterne.

Ud over udviklingsmæssige timing, overraskende små ændringer i temperaturen, så lidt som 1 °C, kan have betydelige virkninger på HSR. For eksempel er termosensoriske neuroner i C. elegans følsomme over for temperaturændringer så små som ±0,05 °C16. Derfor er det bydende nødvendigt at bruge et termometer, der præcist kan måle temperaturen. Derfor foreslår vi som bedste praksis brugen af en kalibreret anordning til temperaturmåling, der er præcis nok til at måle temperaturer inden for ±0,1 °C. Desuden bør et termometer med datalogningsfunktion anvendes til at måle temperaturvariationer over tid. Mange væksthuse er specificeret til at have termiske variationer på mere end 1 °C i forskellige dele af inkubatoren og på tværs af tid, hvilket kan have betydelige virkninger på HSR-eksperimenter. Som en bedste praksis foreslår vi at bruge væksthuse, der har tilstrækkelig isolering og cirkulation til at minimere temperaturudsving. For at gennemføre varmechok eksperimenter, foreslår vi en bedste praksis for en cirkulerende vandbad. Den tid, det tager for en agarplade at nå en ønsket temperatur er ca. 6-7 min i et vandbad, men meget længere i en tør inkubator15,17. Men hvis en cirkulerende vandbad ikke er tilgængelig, har vi vist, at robust HSR induktion også forekommer i en tør inkubator ved hjælp af vores betingelser. Hvis der anvendes en tør inkubator, skal inkubatorens åbning under hele belastningen minimeres.

Det er veletableret, at induktion af varmechok gener er afhængig af master regulator af HSR, HSF-1. Her fremlægger vi beviser for, at de to mere indirekte analyser, fluorescerende journalister og thermorecovery, er også afhængige af HSF-1. Betydeligt, fandt vi, at en almindeligt anvendt alternativ organismeanalyse, thermotolerance, er ikke HSF-1 afhængig ved hjælp af hsf-1 RNAi (Figur 4). Lignende resultater er tidligere blevet rapporteret ved hjælp af en hsf-1 mutant eller en ttx-3 mutant, som blokerer HSR18,,19,20. Tilsammen tyder disse resultater på, at termostanceanalysen ikke bør anvendes til HSR-forskning. Desuden tyder dette på, at en bedste praksis er at teste HSF-1 afhængighed for enhver analyse, der anvendes til at måle HSR.

Samlet set præsenterer vi en række standardiserede protokoller og bedste praksis for robust og reproducerbar måling af HSR induktion i C. elegans. Vi håber, at disse metoder vil mindske variabiliteten i HSR-eksperimenter og øge reproducerbarheden. Fremme af direkte sammenligninger af HSR-forskning mellem laboratorier vil bidrage til at fremskynde forskningen på HSR-området. Desuden vil standardisering gavne forskning i aldring og neurodegenerative sygdomme, som HSR er tæt forbundet med.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en donation fra Frank Leslie. Nogle stammer blev leveret af CGC, som er finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18S-forward primer TTGCGTCAACTGTGGTCGTG
18S-reverse primer CCAACAAAAAGAACCGAAGT
CCTG
AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))] Morimoto lab http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/
C12C8.1-forward primer GTACTACGTACTCATGTGTCG
GTATTT
C12C8.1-reverse primer ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC
CFX Connect Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855200
CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)] Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD Lascar EL-USB-TP-LCD
Greenough Stereo Microscope S9i Series Leica
Hard Shell 96 Well PCR Plates Bio Rad HSS9601
hsp-16.2-forward primer ACTTTACCACTATTTCCGTCC
AGC
hsp-16.2-reverse primer CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG
iScript cDNA Synthesis Kit Bio Rad 1708891
iTaq Universal Sybr Green Super Mix Bio Rad 1725121
Laser Scanning Confocal Microscope Nikon Eclipse 90i
MultiGene OptiMax Thermo Cycler Labnet TC9610
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo Scientific ND-LITE
Parafilm M Roll Bemis 5259-04LC
RapidOut DNA Removal Kit Thermo Scientific K2981
Recirculating Heated Water Bath Lauda Brinkmann RE-206
Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer Fisher Scientific 15-081-103
TRIzol Reagent Invitrogen 15596026 RNA isolation reagent
TurboMix Attachment Scientific Industries SI-0564
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guisbert, E., Morimoto, R. I. The regulation and function of the heat shock response. Protein Quality Control in Neurodegenerative Diseases. , 1-18 (2013).
  2. Li, J., Chauve, L., Phelps, G., Brielmann, R. M., Morimoto, R. I. E2F coregulates an essential HSF developmental program that is distinct from the heat-shock response. Genes and Development. 30 (18), 2062-2075 (2016).
  3. Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
  4. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  5. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  6. Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235 (1999).
  7. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a Tissue-Selective Heat Shock Response Regulatory Network. PLoS Genetics. 9 (4), 1-12 (2013).
  8. Ma, J., et al. Cellular Proteomes Drive Tissue-Specific Regulation of the Heat Shock Response. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (3), 1011-1018 (2017).
  9. Mendenhall, A. R., et al. Expression of a single-copy hsp-16.2 reporter predicts life span. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (7), 726-733 (2012).
  10. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. (1999), 1-11 (2006).
  11. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-23 (2012).
  12. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  14. Shiu, P. K., Hunter, C. P. Early Developmental Exposure to dsRNA Is Critical for Initiating Efficient Nuclear RNAi in C. elegans. Cell Reports. 18 (12), 2969-2978 (2017).
  15. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), 450-457 (2014).
  16. Clark, D. A., Biron, D., Sengupta, P., Samuel, A. D. T. The AFD sensory neurons encode multiple functions underlying thermotactic behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 26 (28), 7444-7451 (2006).
  17. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
  18. McColl, G., et al. Insulin-like signaling determines survival during stress via posttranscriptional mechanisms in C. elegans. Cell Metabolism. 12 (3), 260-272 (2010).
  19. Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
  20. Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).

Tags

Environmental Sciences varmechok varmechok respons HSF-1 C. elegans,HSP-16.2 HSP-70 chaperones thermotolerance thermorecovery
Standardiserede metoder til måling af induktion af varmechokresponsen i <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim… More

Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (161), e61030, doi:10.3791/61030 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter