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कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में हीट शॉक रिस्पांस के प्रेरण को मापने के लिए मानकीकृत तरीके

Published: July 3, 2020 doi: 10.3791/61030
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical and Chemical Engineering and Sciences, Florida Institute of Technology

Summary

यहां, आणविक स्तर पर आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करके कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में हीट शॉक रिस्पांस (एचएसआर) के शामिल होने का आकलन करने के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए जाते हैं, सेलुलर स्तर पर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और ऑर्गेनमल स्तर पर थर्मो रिकवरी।

Abstract

हीट शॉक रिस्पांस (एचएसआर) साइटोसोलिक प्रोटीन द्वारा प्रेरित एक सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया है जो प्रोटीन फोल्डिंग होगोस्टेसिस, या प्रोटेओस्टेसिस को बहाल करने के लिए कार्य करता है। कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस एचएसआर अनुसंधान के लिए एक अद्वितीय और शक्तिशाली जगह है क्योंकि एचएसआर का मूल्यांकन आणविक, सेलुलर और संगठित स्तर पर किया जा सकता है। इसलिए, आणविक स्तर पर परिवर्तनों को सेलुलर स्तर पर कल्पना की जा सकती है और शरीर विज्ञान पर उनके प्रभावों को संगठय स्तर पर मात्रा में बताया जा सकता है। जबकि एचएसआर को मापने के लिए परख सरल हैं, साहित्य में वर्णित समय, तापमान और पद्धति में भिन्नता अध्ययनों में परिणामों की तुलना करना चुनौतीपूर्ण बनाती है। इसके अलावा, इन मुद्दों को अपने अनुसंधान में एचएसआर विश्लेषण को शामिल करने की मांग किसी के लिए एक बाधा के रूप में कार्य करते हैं । यहां, आरटी-क्यूपीसीआर, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और एक ऑर्गनाइज्ड थर्मो रिकवरी परख के साथ मजबूत और प्रजनन योग्य तरीके से एचएसआर के प्रडक्शन को मापने के लिए प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला प्रस्तुत की जाती है। इसके अतिरिक्त, हम बताते हैं कि एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया थर्मोटोलेंस परख एचएसआर, एचएसएफ-1 के अच्छी तरह से स्थापित मास्टर नियामक पर निर्भर नहीं है, और इसलिए एचएसआर अनुसंधान के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। अंत में, साहित्य में पाए जाने वाले इन परखों में भिन्नता पर चर्चा की जाती है और क्षेत्र में परिणामों को मानकीकृत करने में मदद करने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का प्रस्ताव किया जाता है, अंततः न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग, उम्र बढ़ने और एचएसआर अनुसंधान को सुविधाजनक बनाने के लिए।

Introduction

हीट शॉक रिस्पांस (एचएसआर) एक सार्वभौमिक सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया है जो तापमान वृद्धि और अन्य प्रोटोटॉक्सिक तनावों के कारण साइटोसोलिक प्रोटीन द्वारा प्रेरित होती है। कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस में एचएसआर की सक्रियता से एचपीएसपी-70 और एचएसपी-16.2 जैसे हीट शॉक जीन के ट्रांसक्रिप्शनल अप्रेगुलेशन हो जाते हैं। कई हीट शॉक प्रोटीन (एचएसपी) आणविक चैपरोन के रूप में कार्य करते हैं जो सीधे गलत मोड़ या क्षतिग्रस्त प्रोटीन के साथ बातचीत करके प्रोटीन फोल्डिंग होरोस्टेसिस, या प्रोटेओस्टेसिस को बहाल करते हैं। एचएसआर का मास्टर रेगुलेटर ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर हीट शॉक फैक्टर 1 (एचएसएफ-1) है, जिसकी सक्रियण सुंदर ढंग से कई तंत्र 1 के माध्यम सेनियंत्रितहै ।

एचएसएफ-1 की भूमिका तनाव तक ही सीमित नहीं है। सामान्य विकास और विकास के लिए एचएसएफ-1 की आवश्यकता होती है, क्योंकि एचएसएफ-1 को हटाने से लार्वा गिरफ्तारी2हो जाती है । उम्र बढ़ने और उम्र से संबंधित न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के दौरान एचएसएफ-1 भी महत्वपूर्ण है जो प्रोटीन समुच्चय के संचय और प्रोटेओस्टेसिस को बनाए रखने में असमर्थता की विशेषता है। एचएसएफ-1 के नॉकआउट से प्रोटीन समुच्चय और एक छोटी उम्र के संचय का कारण बनता है, जबकि एचएसएफ-1 की अधिकव्यक्तता प्रोटीन एकत्रीकरण को कम करती है और उम्र3, 4,4का विस्तार करती है। इसलिए, आणविक स्तर पर एचएसएफ-1 के विनियमन के संगठित शरीर विज्ञान और रोग के लिए व्यापक निहितार्थ हैं ।

C. Elegans एचएसआर अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव है क्योंकि एचएसआर आणविक,,सेलुलर, और संगठित स्तर4,,5,6पर मापा जा सकता है । इस मॉडल की शक्ति पर प्रकाश डालते हुए, एचएसआर मार्ग को चित्रित करने में महत्वपूर्ण प्रगति, जैसे एचएसआर विनियमन में ऊतक-विशिष्ट अंतर, सी एलिगेंस7,,8 मेंखोजागया है। इसके अलावा, सी एलिगेंस व्यापक रूप से उम्र बढ़ने अनुसंधान के लिए प्रयोग किया जाता है और प्रोटेओस्टेसिस व्यवधान से जुड़े रोगों मॉडलिंग के लिए एक उभरती हुई प्रणाली है।

हालांकि सी एलिगेंस के साथ हीट शॉक प्रयोग जल्दी और प्रजनन योग्य हो सकते हैं, लेकिन शुरुआत से पहले विचार करने के लिए कई सवाल हैं। उदाहरण के लिए, एचएसआर को शामिल करने के लिए किस तापमान का उपयोग किया जाना चाहिए और कीड़े कब तक उजागर होने चाहिए? क्या ड्राई इनक्यूबेटर या वॉटर बाथ का इस्तेमाल करना बेहतर है? किस विकास स्तर का उपयोग किया जाना चाहिए? दुर्भाग्य से, एचएसआर की जांच करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धतियां प्रयोगशाला से प्रयोगशाला तक व्यापक रूप से भिन्न होती हैं, जिससे सर्वोत्तम पद्धतियों का चयन करते समय भ्रम पैदा होता है और पूरे क्षेत्र में परिणामों की तुलना करना मुश्किल हो जाता है।

हम एचएसआर को मापने के लिए आरटी-क्यूपीसीआर, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और थर्मो रिकवरी का उपयोग करने के लिए मजबूत और मानकीकृत प्रोटोकॉल पेश करते हैं। जबकि ये तीन दृष्टिकोण पूरक हैं, उनमें से प्रत्येक के अद्वितीय फायदे और नुकसान हैं। उदाहरण के लिए, आरटी-क्यूपीसीआर एचएसआर का सबसे प्रत्यक्ष और मात्रात्मक माप है, और इस परख को आसानी से कई अलग-अलग गर्मी सदमे-अकांक्षित जीन को शामिल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, आरटी-क्यूपीसीआर सबसे महंगा है, तकनीकी रूप से मुश्किल हो सकता है, और विशेष उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स को एचएसआर इंडक्शन में ऊतक-विशिष्ट मतभेदों को मापने का लाभ होता है। हालांकि, उन्हें सही मात्रा में बताना मुश्किल है, केवल एक निश्चित सीमा से ऊपर प्रेरण को माप सकते हैं, और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के उपयोग की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, यहां वर्णित रिपोर्टर उपभेदों को मानक N2 तनाव की तुलना में विकास में देरी हो रही है । हालांकि नए रिपोर्टर एकल कॉपी ट्रांसजीन युक्त उपभेदों उपलब्ध हैं, वे यहां परीक्षण नहीं किया गया है9। तीसरी परख थर्मोरी, ऑर्गनाइज्ड लेवल पर फिजिकली प्रासंगिक रीडआउट देने का फायदा है। हालांकि, यह परख यकीनन सबसे कम संवेदनशील और सबसे अप्रत्यक्ष है । अंत में, हम इन परख में पाए जाने वाले कुछ सामान्य विविधताओं पर चर्चा करते हैं और इस क्षेत्र में अनुसंधान को सुगम बनाने के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं का एक सेट प्रस्तावित करते हैं।

Protocol

1. सी एलिगेंस का रखरखाव और समकालिकीकरण

  1. कई वयस्कों को लगभग 2x प्रति सप्ताह10ताजा प्लेटों में स्थानांतरित करके OP50 एस्चेरिचिया कोलाई बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त नेमाटोड ग्रोथ मीडियम (एनजीएम) प्लेटों पर 20 डिग्री सेल्सियस पर कीड़े बनाए रखें । कीड़े को भोजन से बाहर चलने से रोकने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि यह उनके शरीर विज्ञान11को प्रभावित कर सकता है।
    1. एनजीएम प्लेटों की तैयारी।
      1. एनएसीएल के 3 ग्राम, बैक्टो-पेप्टोन के 2.5 ग्राम, एगर के 20 ग्राम, और एक फ्लास्क में 1 एल तक डीओनाइज्ड(डीआई)एच 2 ओ मिलाएं।
      2. नसबंदी के लिए मिश्रण को ऑटोक्लेव करें।
      3. मिश्रण को ~ 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें।
      4. 1 एम केएच 2 पीओ4 (पीएच = 6), 1 एमसीएसीएल2का 1 एमएल, 1 एम एमजीएसओ 4 का 1 एमएल और कोलेस्ट्रॉल का1एमएल (100% इथेनॉल में 5 मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें।
      5. बाँझ तकनीक का उपयोग करके, मिश्रण को लगभग 100 प्लेटों को उपजने के लिए 6 सेमी प्लेटों में डालें। यदि मिश्रण को पहले 300 एमएल बाँझ बीकर में स्थानांतरित किया जाता है तो प्लेटें डालना आसान है।
      6. बैक्टीरिया के साथ बोने या 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले कमरे के तापमान (आरटी) पर जमना करने के लिए 1 दिन की अनुमति दें।
    2. एनजीएम प्लेटों पर OP50 बैक्टीरिया की सीडिंग।
      1. 30 डिग्री सेल्सियस या 37 डिग्री सेल्सियस पर पौंड में एक संतृप्त रातोंरात OP50 जीवाणु संस्कृति बढ़ें।
      2. एक 6 सेमी एनजीएम प्लेट के केंद्र पर संस्कृति के लगभग 300 μL रखें।
      3. प्लेटों को प्लेट का पालन करने के लिए बैक्टीरियल लॉन के लिए आवश्यक 1-3 दिनों के लिए आरटी पर सूखने दें। इसके बाद प्लेटों का उपयोग किया जा सकता है या 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. कीड़े को या तो ताजा रखे अंडे (यहां वर्णित) या वैकल्पिक रूप से ब्लीच के साथ कीड़े को भंग करने के बाद अंडे इकट्ठा करके अलग करके समकालिक रूप से उगाएं।
    1. प्लैटिनम वायर पिक का उपयोग करके लगभग 10 ग्रेविड वयस्क कीड़े को एक ताजा प्लेट में स्थानांतरित करें। यदि वयस्क वयस्क वयस्कता के पहले दिन में हैं तो अंडा-रखना सिंक्रोनाइजेशन सबसे अच्छा काम करता है।
    2. लगभग 1 घंटे के बाद, प्लेट से कीड़े निकालें। इसके परिणामस्वरूप शर्तों और तनाव के आधार पर प्रति प्लेट 40-60 अंडे होने चाहिए।

2. एचएसआर रिपोर्टर्स की फ्लोरोसेंट इमेजिंग

  1. कीड़े (धारा 1.2) को सिंक्रोनाइज़ करें और वांछित विकास चरण तक 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। AM446(hsp-70p::gfp)और CL2070(hsp-16.2 p:Gfp)फ्लोरोसेंट रिपोर्टर उपभेदों के लिए, युवा वयस्क कीड़े जो अभी तक प्रजनन परिपक्वता तक नहीं पहुंचे हैं, अंडे बिछाने सिंक्रोनाइजेशन के बाद 64 घंटे उत्पन्न होते हैं।
    नोट: विकास का समय प्रत्येक तनाव और तापमान के साथ भिन्न होता है जिस पर कीड़े उठाए जाते हैं। दोनों एचएसआर रिपोर्टर उपभेदों N2 के सापेक्ष एक मामूली विकास देरी प्रदर्शन । महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रजनन परिपक्वता की शुरुआत के बाद एचएसआर प्रेरण की तीव्रता में लगभग 2-4x की गिरावट आती है (चर्चा देखें)।
  2. गर्मी पैराफिन फिल्म के साथ प्लेटों लपेटकर और 1 घंटे के लिए ३३ डिग्री सेल्सियस पर एक परिसंचारी पानी स्नान में डूब द्वारा कीड़े सदमे । किनारों को सील करने के लिए प्लेट के चारों ओर पैराफिन फिल्म की एक पतली पट्टी 2x लपेटा जाना चाहिए। प्लेट के नीचे कवर न करें या यह गर्मी हस्तांतरण में हस्तक्षेप कर सकता है। एक टेस्ट ट्यूब रैक और एक सीसा वजन का उपयोग कर उल्टा प्लेटें जलमग्न । यदि आवश्यक हो तो नकारात्मक नियंत्रण नमूना (कोई गर्मी झटका) शामिल करना याद रखें।
    नोट: यदि पैराफिन फिल्म सुरक्षित नहीं है, तो पानी थाली में प्रवेश करेगा और प्लेट डेटा संग्रह के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए ।
  3. पानी के स्नान से प्लेटों को हटाकर और एक कागज तौलिया के साथ सूखने से कीड़े को ठीक करें। पैराफिन फिल्म निकालें और 6-24 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर कीड़े को इनक्यूबेट करें। यह वसूली अवधि इमेजिंग से पहले जीएफपी संश्लेषण और तह के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देती है।
  4. इमेजिंग के लिए स्लाइड तैयार करें। स्लाइड प्रत्येक उपयोग के लिए नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए।
    1. एक माइक्रोवेव का उपयोग करके पानी और गर्मी में 3% एगर उठे समाधान बनाएं जब तक कि एगर उठे न हो जाएं।
    2. दो अन्य माइक्रोस्कोप स्लाइड के बीच इमेजिंग के लिए एक माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें जिसमें एग्राजिंग पैड के लिए एक स्पेसर बनाने के लिए उन पर प्रयोगशाला टेप की एक पट्टी है।
    3. 1,000 माइक्रोल पिपेट का उपयोग करके, माइक्रोस्कोप स्लाइड के केंद्र में गर्म 3% एग्राम की एक बूंद (~ 150 माइक्रोन) रखें।
    4. तुरंत पहली स्लाइड के लिए लंबवत एक खाली माइक्रोस्कोप स्लाइड के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड को कवर इतना है कि शीर्ष स्लाइड आसन्न स्लाइड पर प्रयोगशाला टेप पर टिकी हुई है । यह एक समान चौड़ाई का पैड बनाने के लिए एगर उठे की बूंद को फैलाता है।
    5. ध्यान से शीर्ष स्लाइड हटा दें।
  5. एम 9 बफर में 1 एमएम लेविसोल की एक छोटी बूंद (~ 5 माइक्रोन) को एगर्राज पैड के केंद्र में जोड़ने के लिए 200 माइक्रोल पिपेट का उपयोग करके कीड़े को स्थिर करें। फिर प्लेटिनम तार लेने का उपयोग करके लेवामिसोल की बूंद में 10 कीड़े स्थानांतरित करें। कवरलिप के साथ कवर करें। एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के लिए कवरस्लिप को सील करना आवश्यक नहीं है। वैकल्पिक रूप से, कीड़े को तब संरेखित किया जा सकता है जब वे लेवेमिसोल को फैलाकर, एगर उठे पैड के बाहर, और प्लेटिनम तार लेने के साथ कीड़े को संरेखित करके लकवाग्रस्त हो जाते हैं। वैकल्पिक रूप से, लेवेमिसोल को प्रयोगशाला पोंछ का उपयोग करके भिगोया जा सकता है।
    नोट: छवि जितनी जल्दी हो सके, क्योंकि Levamisole में लंबे समय तक इनक्यूबेशन फ्लोरेसेंस बदल सकता है ।
  6. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कीड़े की छवि। छवि कैप्चर का विवरण माइक्रोस्कोप और सॉफ्टवेयर द्वारा भिन्न होता है।
    नोट: सीधे छवि तीव्रता की तुलना करने के लिए, एक इमेजिंग सत्र में समान माइक्रोस्कोप सेटिंग्स का उपयोग करें। छवि को अधिक परेशान करने से बचें।

3. आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करके एचएसआर जीन अभिव्यक्ति का मापन

  1. कीड़े (धारा 1.2) को सिंक्रोनाइज़ करें और वांछित विकास चरण तक 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। N2 कीड़े के लिए, युवा वयस्क कीड़े जो अभी तक प्रजनन परिपक्वता तक नहीं पहुंचे हैं, अंडे बिछाने सिंक्रोनाइजेशन के बाद 60 घंटे उत्पन्न होते हैं।
    नोट: विकास का समय प्रत्येक तनाव और तापमान के साथ भिन्न होता है जिस पर कीड़े उठाए जाते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रजनन परिपक्वता की शुरुआत के बाद एचएसआर प्रेरण की तीव्रता में लगभग 2-4x की गिरावट आती है (चर्चा देखें)।
  2. हीट शॉक कीड़े के रूप में चरण 2.2 में वर्णित है।
  3. प्लेटों को पानी के स्नान से बाहर निकालें, पैराफिन फिल्म को हटा दें, और तुरंत कीड़े इकट्ठा करें। कीड़े को प्लेटों को धीरे से M9 के 1 मिलील के साथ धोने, माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में तरल एकत्र करके एकत्र किया जा सकता है, और फिर 1 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र के बाद M9 को हटा दिया जा सकता है।
  4. कीड़े को Lyse और कार्बनिक निष्कर्षण का उपयोग कर आरएनए शुद्ध।
    1. आरएनए आइसोलेशन रिएजेंट के 250 माइक्रोन जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. 30 एस के लिए हाथ से भंवर ट्यूब।
    3. माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब अटैचमेंट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए भंवर ट्यूब।
    4. क्लोरोफॉर्म के 50 माइक्रोल जोड़ें।
    5. 30 एस के लिए भंवर ।
    6. आरटी में नमूनों को 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 14,000 x g पर सेंट्रलाइज।
    8. जलीय परत (यानी, शीर्ष परत, ~ 125 माइक्रोल) को एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: इंटरफ़ेस में कार्बनिक परत और सामग्री से बचें।
    9. क्लोरोफॉर्म के 50 माइक्रोल जोड़ें।
    10. 30 एस के लिए भंवर ।
    11. आरटी में नमूनों को 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें ।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    13. जलीय परत (~ 100 माइक्रोल) को एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
      नोट: इंटरफ़ेस में कार्बनिक परत और सामग्री से बचें।
    14. आइसोप्रोपैनॉल के बराबर वॉल्यूम (यानी 100 माइक्रोल) के साथ आरएनए को तेज़ करें।
    15. कम से कम 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, लेकिन अधिमानतः रात भर।
      नोट: प्रयोग यहां रोका जा सकता है और आरएनए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    16. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा आरएनए गोली मार।
    17. गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना सुपरनेट निकालें।
      नोट: गोली छोटी होगी और दिखाई नहीं दे सकती है। गोली ट्यूब के किनारे कसकर पालन नहीं कर सकती है, इसलिए इसे उखाड़ने से बचने के लिए सावधानी जरूरी है।
    18. आरएनएसई-मुक्त एच 2 ओ के साथ बने 70% बर्फ-ठंडे इथेनॉल के250 माइक्रोनके साथ गोली धोएं।
    19. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    20. गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना सुपरनेट निकालें।
    21. किसी भी शेष 70% इथेनॉल को हटाने के लिए आरटी पर एक त्वरित स्पिन करें।
    22. जब तक जरूरत हो, तब तक ट्यूबों को आरटी पर खुला छोड़कर गोली को सुखाएं; आम तौर पर कम से कम 20 मिनट ट्यूब संदूषण को रोकने के लिए एक लिंट-फ्री ऊतक या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया जा सकता है।
    23. RNase-मुक्तएच2 ओ के 20 μL में गोली को फिर से खर्च करें।
    24. एक छोटी मात्रा स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (2 माइक्रोन) का उपयोग करके आरएनए एकाग्रता का निर्धारण करें।
      नोट: प्रयोग यहां रोका जा सकता है और आरएनए को अस्थायी रूप से -20 डिग्री सेल्सियस पर या उससे नीचे संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. DNase I के साथ इनक्यूबेटिंग करके अवशिष्ट डीएनए निकालें । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करने और निर्माता के निर्देशों का पालन करने की सिफारिश की जाती है।
    1. इस किट के साथ, 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में आरएनए के 500 एनजी और DNase I के 1 माइक्रोन के साथ 20 माइक्रोल प्रतिक्रिया तैयार करें।
    2. प्रत्येक नमूने में DNase निष्क्रियता रिएजेंट (किट में शामिल) के 2.5 μL जोड़ें और कभी-कभी फ्लिकिंग/भंवर के साथ 5 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें।
    3. 2 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर नीचे स्पिन करें।
    4. सफेद गोली को परेशान किए बिना, सीडीएनए संश्लेषण के लिए एक ताजा माइक्रोट्यूब में सुपरनिटेंट के 15 माइक्रोनल को स्थानांतरित करें।
  6. सीडीएनए संश्लेषण का संचालन करें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करने और निर्माता के निर्देशों का पालन करने की सिफारिश की जाती है।
    1. किट के साथ, पिछले चरण से DNase I-इलाज आरएनए के 15 माइक्रोन के साथ 20 माइक्रोन प्रतिक्रिया तैयार करें और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज के 1 माइक्रोन करें।
    2. सीडीएनए संश्लेषण के लिए निम्नलिखित कार्यक्रम का उपयोग करें: 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट के लिए 46 डिग्री सेल्सियस, 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस होल्ड के लिए।
    3. नमूने के लिए सीधे RNase मुक्त एच2ओ के 80 μL जोड़कर पतला सीडीएनए।
    4. संक्षेप में भंवर, फिर नीचे स्पिन और जरूरत तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. क्यूपीसीआर करें। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करने और निर्माता के निर्देशों का पालन करने की सिफारिश की जाती है।
    1. किट के साथ, एक 96-अच्छी प्लेट के एक कुएं में सीडीएनए के 2 माइक्रोन और फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर के 200 एनएम (प्रत्येक) युक्त 25 माइक्रोन प्रतिक्रिया तैयार करें।
    2. हीट शॉक जीन, एचएसपी-70 और एचएसपी-16.2, और 18S आरआरएनए (सामान्यीकरण नियंत्रण के लिए) को मापने के लिए प्राइमर दृश्यों को सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध किया गया है। hsp-16.2 कई सामान्यीकरण नियंत्रण वांछित के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. तनु सीडीएनए नमूने 18S के माप से पहले 50x यह सुनिश्चित करने के लिए कि परख रैखिक रेंज में है । उपयुक्त क्यूपीसीआर की स्थिति किट और प्राइमर के साथ भिन्न होती है (प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
    4. क्यूपीसीआर के लिए 5 एस डेनैचेशन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्रों के साथ वास्तविक समय पीसीआर डिटेक्शन सिस्टम (सामग्रीकी तालिका देखें) का उपयोग करें, 30 एस एनीलिंग के लिए 58 डिग्री सेल्सियस और 30 एस विस्तार के लिए 72 डिग्री सेल्सियस।
      नोट: इष्टतम एनीलिंग तापमान प्राइमर और शर्तों के अनुसार भिन्न हो सकते हैं।
    5. या तो एकक्ट या मानक वक्र विधि12का उपयोग कर मात्रा निर्धारित करें ।

4. संगठित स्तर पर एचएसआर मापने के लिए थर्मो वसूली परख

  1. कीड़े (धारा 1.2) को सिंक्रोनाइज़ करें और वांछित विकास चरण तक 20 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें। N2 कीड़े के लिए, युवा वयस्क कीड़े जो अभी तक प्रजनन परिपक्वता तक नहीं पहुंचे हैं, अंडे बिछाने सिंक्रोनाइजेशन के बाद 60 घंटे उत्पन्न होते हैं।
    नोट: विकास का समय प्रत्येक तनाव और तापमान के साथ भिन्न होता है जिस पर कीड़े उठाए जाते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रजनन परिपक्वता की शुरुआत के बाद एचएसआर प्रेरण की तीव्रता में लगभग 2-4x की गिरावट आती है (चर्चा देखें)।
  2. गर्मी 6 घंटे के लिए चरण 2.2 में वर्णित कीड़े को झटका देती है।
  3. पानी के स्नान से प्लेटों को हटा दें, पैराफिन फिल्म को हटा दें, और कीड़े को 48 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन से ठीक होने दें।
  4. कीड़े की संख्या की गणना करें जो झटकेदार आंदोलन या पक्षाघात के बिना यांत्रिक उत्तेजना के बाद तुरंत क्रॉल कर सकते हैं।
    नोट: 6 एच इनक्यूबेशन थर्मो रिकवरी को कम करने वाली स्थितियों की जांच करने के लिए इष्टतम है, लेकिन थर्मो रिकवरी को बढ़ाने वाली स्थितियों की तलाश के लिए लंबे समय तक एक्सपोजर समय की आवश्यकता हो सकती है।

Representative Results

इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एचएसआर प्रेरण फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स, आरटी-क्यूपीसीआर, और थर्मो रिकवरी परख का उपयोग करके मापा गया था। प्रत्येक मामले में, धारा 1.2 में प्रक्रिया का उपयोग सिंक्रोनाइज्ड, युवा वयस्क कीड़े उत्पन्न करने के लिए किया गया था जो प्रजनन परिपक्वता तक नहीं पहुंचे थे।

सेलुलर स्तर पर एचएसआर प्रेरण की कल्पना करने के लिए, AM446(एचएसपी-70p::gfp)और CL2070(एचएसपी-16.2 पी:जीएफपी)फ्लोरोसेंट रिपोर्टर उपभेदों का प्रोटोकॉल की धारा 2 के बाद विश्लेषण किया गया। गर्मी के झटके के बिना नकारात्मक नियंत्रण नमूनों में, एचएसपी-१६.२ रिपोर्टर केवल सामांय autofluorescence दिखाया, लेकिन एचएसपी-७० रिपोर्टर गुदा अवसाद की मांसपेशी में संविलियन फ्लोरेसेंस था के रूप में पहले4 (चित्रा 1एक)की सूचना दी । 33 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी के झटके के 1 घंटे के बाद, दोनों संवाददाताओं में मजबूत फ्लोरेसेंस देखा गया; हालांकि, अभिव्यक्ति का पैटर्न अलग था जिसके आधार पर रिपोर्टर का इस्तेमाल किया गया था(चित्रा 1बी)। एचएसपी-70 रिपोर्टर आंत और शुक्राणुओं में मेधावी था, जबकि एचएसपी-16.2 रिपोर्टर फरीनेक्स में सबसे प्रतिभाशाली था। इसके अतिरिक्त, एचएसपी-16.2 रिपोर्टर के पास पहले वर्णित प्रेरण की मात्रा में कृमि-से-कृमि परिवर्तनशीलता की उच्च डिग्री थी, लेकिन एचएसपी-70 रिपोर्टर ने13नहीं किया।

धारा 2 का एक आमतौर पर उपयोग किया जाने वाला भिन्नता परिसंचारी पानी स्नान के बजाय सूखे इनक्यूबेटर में गर्मी के झटके को अंजाम देना है। इसलिए दोनों पद्धतियों के अंतर को भी परखा गया। यह पाया गया कि दोनों प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप हमारी स्थितियों का उपयोग करके दो फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स को मजबूत रूप से शामिल किया गया, हालांकि एक परिसंचारी जल स्नान को सर्वोत्तम अभ्यास (चर्चा देखें)(चित्रा 1बी)के रूप में अनुशंसित किया जाता है।

ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एचएसएफ-1 पर संवाददाताओं की निर्भरता का परीक्षण करने के लिए, रिपोर्टर इंडक्शन मापा गया था इससे पहले कि फीडिंग RNI को एचएसएफ-1 को नॉकआउट करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह पाया गया कि दोनों उपभेदों की फ्लोरेसेंस को एचएसएफ-1 नॉकडाउन पर गंभीर रूप से कम कर दिया गया था, यह दर्शाता है कि ये रिपोर्टर्स एचएसएफ-1-निर्भर हैं जैसा कि साहित्य4 (चित्रा 2)में वर्णित है । हालांकि, यह भी देखा गया कि फरेंगल फ्लोरेसेंस एचएसएफ-1 नॉकडाउन पर दोनों संवाददाताओं में कायम रहा, जो पिछली रिपोर्टों के अनुरूप है कि फरेंगल मांसपेशी14को खिलाकर आरएनएआई के लिए प्रतिरोधी है।

आणविक स्तर पर एचएसआर के पूरे कृमि प्रेरण की मात्रा निर्धारित करने के लिए, प्रोटोकॉल की धारा 3 का उपयोग करके दो अंतर्जात एचएसपी को आरटी-क्यूपीसीआर के साथ मापा गया था। नमूनों को ट्रिपलीकेट में मापा गया था, प्रत्येक प्राइमर के लिए एक मानक वक्र उत्पन्न किया गया था, और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए प्रत्येक नमूने के लिए एक पिघल वक्र का विश्लेषण किया गया था। यह पाया गया कि 1 घंटे के लिए 33 डिग्री सेल्सियस हीट शॉक के परिणामस्वरूप दो हीट शॉक जीन, एचएसपी-70 और एचएसपी-16.2 (चित्रा 3)के लिए सापेक्ष अभिव्यक्ति में 2,000x से अधिक की वृद्धि हुई। hsp-70 इन परिणामों से पता चलता है कि दोनों अंतर्जात जीन एचएसआर प्रेरण को मापने के लिए उपयुक्त हैं और 1 घंटे के लिए 33 डिग्री सेल्सियस गर्मी का झटका पर्याप्त प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, गर्मी शॉक इंडक्शन की पूर्ण डिग्री की व्याख्या करने में सावधानी का उपयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि गर्मी के झटके के अभाव में एमआरएनए का स्तर बहुत कम है।

हीट शॉक के लिए एक शारीरिक प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए, प्रोटोकॉल की धारा 4 का उपयोग करके एक ऑर्गनाइज्ड थर्मोरी परख का परीक्षण किया गया था। यह पाया गया कि 33 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के हीट शॉक के लिए कीड़े के संपर्क में आने से 48 घंटे की रिकवरी(चित्रा 4ए)के बाद सामान्य आंदोलन के साथ कीड़े में 20% की कमी आई। एचएसएफ-1 ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर पर इस परख की निर्भरता का परीक्षण तनाव के लिए कीड़े को उजागर करने से पहले एचएसएफ-1 को नॉकआउट करने के लिए आरएनएआई को खिलाने का उपयोग करके किया गया था। यह पाया गया कि एचएसएफ-1 के नॉकआउट के कारण सामान्य आंदोलन में नाटकीय कमी आई, जिसमें 95% कीड़े प्लेटिनम तार लेने के साथ उकसाने के बाद झटकेदार आंदोलन या पक्षाघात दिखाते हैं।

हमने इस थर्मोरिक्त वसूली परख की तुलना व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले वैकल्पिक ऑर्गेनाइज्ड परख से की है जिसे आमतौर पर थर्मोटॉलेंस के रूप में जाना जाता है। थर्मोटॉलेंस परख में, कीड़े एक सूखे इनक्यूबेटर का उपयोग करके निरंतर 35 डिग्री सेल्सियस तापमान के संपर्क में आते हैं, और जीवित कीड़े का प्रतिशत विभिन्न समय बिंदुओं पर मापा जाता है। इस परख का उपयोग करते हुए, यह पाया गया कि नियंत्रण कीड़े लगातार 35 डिग्री सेल्सियस के संपर्क में आने के बाद लगभग 8 घंटे के एक्सपोजर(चित्रा 4बी)के बाद मर गए। हालांकि, जब RNAi नॉकडाउन का उपयोग करके एचएसएफ-1 पर इस परख की निर्भरता का परीक्षण किया गया था, तो यह पाया गया कि एचएसएफ-1 के अवरोध के कारण थर्मोटुलेंस में कमी नहीं आई। इसी तरह के परिणाम पहले HSF-1 म्यूटेशन (चर्चा देखें) का उपयोग करके दिखाए गए हैं । इसलिए, एचएसआर को मापने के लिए थर्मोटोलेंस परख के उपयोग की सिफारिश नहीं की जाती है, और संगठित स्तर पर एचएसआर की जांच के लिए थर्मो रिकवरी पसंदीदा तरीका है।

Figure 1
चित्रा 1: एचएसआर प्रेरण फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के साथ मापा । (A)बेसल और(बी) एचएसपी-70पी की हीट-अकांक्षित अभिव्यक्ति::जीएफपी और एचएसपी-16.2 पी:: जीएफपी रिपोर्टर 1 घंटे के बाद हीट शॉक के 1 घंटे के बाद 33 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान या इनक्यूबेटर में । 64 घंटे के लिए OP50 बैक्टीरिया पर कीड़े उठाए गए थे, गर्मी हैरान, और फिर इमेजिंग से पहले 8 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर बरामद किया। संदर्भ के लिए,गर्मीसे सदमे वाले कीड़े की सीमा और संतृप्ति से मेल खाने के लिए(ए)में कोई गर्मी-शॉक कीड़े को फिर से सामान्य नहीं किया गया था। दो प्रयोगात्मक प्रतिकृति के प्रतिनिधि चित्र दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 250 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स के साथ मापा गया एचएसआर इंडक्शन एचएसएफ-1 पर निर्भर है। एचएसपी-70पी युक्त उपभेद:: जीएफपी और एचएसपी-16.2 पी:: जीएफपी रिपोर्टर्स को नियंत्रण (L4440 खाली वेक्टर) या 64 घंटे के लिए एचएसएफ-1 आरएनएआई प्लेटों पर उठाया गया था, जो पानी के स्नान में 33 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे गर्मी के झटके से अवगत कराया गया था, और फिर 8 एच इमेजिंग के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर बरामद किया गया था। दो प्रयोगात्मक प्रतिकृति के प्रतिनिधि चित्र दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 250 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एचएसआर प्रेरण आरटी-क्यूपीसीआर के साथ मापा गया। N2 कीड़े HT115 बैक्टीरिया पर ६० घंटे के लिए उठाया गया था और फिर गर्मी एक ३३ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में 1 घंटे के लिए सदमे में । एचएसपी-70 (C12C8.1) और एचएसपी-16.2 के सापेक्ष एमआरएनए स्तर को कोई गर्मी-सदमे नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत दिखाया गया है। प्लॉट किए गए मूल्य चार जैविक प्रतिकृति का मतलब हैं और त्रुटि सलाखों ± SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय महत्व की गणना एक अकर्ण छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग करके की गई थी। **p< 0.01। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: थर्मो रिकवरी, लेकिन थर्मोटॉलेंस नहीं, एचएसएफ-1 पर निर्भर है। N2 कीड़े नियंत्रण पर उठाया गया (L4440) या 60 घंटे के लिए एचएसएफ-1 RNAi प्लेटें और फिर या तो करने के लिए स्थानांतरित कर दिया: (ए) 6 घंटे के लिए एक 33 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान और सामान्य आंदोलन (थर्मो वसूली), या (बी) एक 35 डिग्री सेल्सियस सूखी इनक्यूबेटर के लिए स्कोरिंग से पहले 48 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर बरामद किया और मृत (थर्मोटोलर) के लिए स्कोरिंग से पहले हर 2 घंटे हटा दिया (थर्मोटोलर) । प्रत्येक परख 2 स्वतंत्र दिनों पर एन 30 व्यक्तियों के साथ किया गया था। औसत दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

साहित्य में एचएसआर को परखने के लिए विभिन्न प्रकार के तापमान, समय और उपकरणों का उपयोग किया गया है, जिसने अनावश्यक चेतावनी शुरू की है और प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों की तुलना करने में कठिनाई हुई है। उदाहरण के लिए, 32-37 डिग्री सेल्सियस से कहीं भी तापमान और 15 मिनट से कई घंटे तक के तापमान का उपयोग एचएसआर15को प्रेरित करने के लिए किया गया है। हालांकि, यह बताया गया है कि घातकता सभी चरणों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे और दिन 1 वयस्कों के लिए 1.5 घंटे के रूप में जल्दी होती है15वयस्कों। इसके अलावा, हम बताते हैं कि 35 डिग्री सेल्सियस तक कीड़े के जोखिम से घातकता होती है जो एचएसएफ-1 निर्भर नहीं है, जिससे ये स्थितियां एचएसआर के विश्लेषण के लिए खराब अनुकूल हो जाती हैं। इसके विपरीत, 1 घंटे के लिए 33 डिग्री सेल्सियस का गर्मी का झटका गर्मी सदमे जीन के मजबूत प्रेरण को प्रकाश में लाने के लिए पर्याप्त मजबूत है, फिर भी कृमि व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करने के लिए पर्याप्त हल्के है। दरअसल, 33 डिग्री सेल्सियस के संपर्क में आने के लिए जब तक 6 एच केवल 20% कीड़े असामान्य आंदोलन प्रदर्शित करने का कारण बनता है। इसलिए, हम आरटी-क्यूपीसीआर और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर परख के लिए मानकीकृत स्थिति के रूप में 33 डिग्री सेल्सियस के तापमान और 1 घंटे के समय का उपयोग करने का प्रस्ताव करते हैं।

हाल के प्रयोगों से पता चला है कि एचएसआर प्रयोगों के लिए कीड़े का विकासात्मक मंचन विशेष रूप से महत्वपूर्ण है । यह हाल ही में दिखाया गया था कि सी एलिगेंस में एचएसआर की अक्रूती में गिरावट आती है (यानी, गिर) द्वारा >50% जब hermaphrodites5अंडे बिछाने शुरू करते हैं । कीड़े सही ढंग से मंचन महत्वपूर्ण है क्योंकि वहां अक्सर उत्परिवर्तन ले जाने उपभेदों में विकास के समय में मतभेद हैं । यदि तापमान-संवेदनशील म्यूटेंट का उपयोग किया जाता है, तो यह परिणामों को भी प्रभावित करेगा यदि वे अपनी प्रजनन आयु से सिंक्रोनाइज्ड नहीं हैं। इसलिए, यह निर्धारित करने के लिए हर तनाव के लिए अंडे बिछाने की शुरुआत को ध्यान से मापने की सिफारिश की जाती है जब पतन होता है। एल 4 मोल्ट के बाद और प्रजनन परिपक्वता की शुरुआत से पहले समय की खिड़की संकीर्ण है; इसलिए, देखभाल की जानी चाहिए ताकि एचएसआर पतन अनजाने में परिणामों में परिवर्तनशीलता का कारण न बन सके।

विकास के समय के अलावा, तापमान में आश्चर्यजनक रूप से छोटे परिवर्तन, 1 डिग्री सेल्सियस के रूप में छोटे, एचएसआर पर पर्याप्त प्रभाव डाल सकते हैं। उदाहरण के लिए, सी एलिगेंस में थर्मोसेंसरी न्यूरॉन्स तापमान परिवर्तन के प्रति संवेदनशील होते हैं जो ± 0.05 डिग्री सेल्सियस16के रूप में छोटे होते हैं। इस प्रकार, थर्मामीटर का उपयोग करना अनिवार्य है जो तापमान को सटीक रूप से माप सकता है। इसलिए, हम तापमान माप के लिए एक अंशांकित डिवाइस के उपयोग का सबसे अच्छा अभ्यास करने का प्रस्ताव करते हैं जो ± 0.1 डिग्री सेल्सियस के भीतर तापमान को मापने के लिए पर्याप्त सटीक है। इसके अलावा, समय भर में तापमान में बदलाव को मापने के लिए डेटा-लॉगिंग कार्यक्षमता के साथ एक थर्मामीटर का उपयोग किया जाना चाहिए। कई इनक्यूबेटर को इनक्यूबेटर के विभिन्न हिस्सों में और समय के साथ 1 डिग्री सेल्सियस से अधिक की थर्मल विविधताओं के लिए निर्दिष्ट किया जाता है, जिसका एचएसआर प्रयोगों पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है। एक सर्वोत्तम अभ्यास के रूप में, हम उन इनक्यूबेटर का उपयोग करने का सुझाव देते हैं जिनमें तापमान में उतार-चढ़ाव को कम करने के लिए पर्याप्त इन्सुलेशन और परिसंचरण होता है। गर्मी सदमे प्रयोगों के संचालन के लिए, हम एक परिसंचारी पानी स्नान का एक सबसे अच्छा अभ्यास का प्रस्ताव है । आगर की थाली में वांछित तापमान तक पहुंचने में लगने वाला समय पानी के स्नान में लगभग 6-7 मिनट होता है लेकिन सूखे इनक्यूबेटर15,17में बहुत अधिक समय होता है । हालांकि, यदि परिसंचारी जल स्नान उपलब्ध नहीं है, तो हमने दिखाया है कि हमारी स्थितियों का उपयोग करके सूखे इनक्यूबेटर में मजबूत एचएसआर प्रेरण भी होता है। यदि एक सूखे इनक्यूबेटर का उपयोग किया जाता है, तो तनाव की अवधि के लिए इनक्यूबेटर खोलने को कम किया जाना चाहिए।

यह सर्वविदित है कि हीट शॉक जीन को शामिल करना एचएसआर, एचएसएफ-1 के मास्टर रेगुलेटर पर निर्भर करता है । यहां, हम सबूत पेश करते हैं कि दो और अप्रत्यक्ष परख, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स और थर्मो रिकवरी भी एचएसएफ-1 पर निर्भर हैं । गौरतलब है कि हमने पाया कि आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला वैकल्पिक ऑर्गेनमल परख थर्मोटॉलेंस, एचएसएफ-1 आरएनएआई(चित्रा 4)का उपयोग करके एचएसएफ-1 निर्भर नहीं है। इसी तरह के परिणाम पहले एक hsf-1 उत्परिवर्ती या एक ttx-3 ,उत्परिवर्ती, जो एचएसआर18, 19,,1920ब्लॉक का उपयोग कर सूचित किया गया है । साथ में, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि थर्मोटोलेंस परख एचएसआर अनुसंधान के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए। इसके अलावा, यह पता चलता है कि एक सबसे अच्छा अभ्यास एचएसआर को मापने के लिए इस्तेमाल किसी भी परख के लिए HSF-1 निर्भरता का परीक्षण करने के लिए है ।

एक साथ लिया, हम सी एलिगेंस में एचएसआर प्रेरण के मजबूत और प्रजनन योग्य माप के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल और सर्वोत्तम प्रथाओं की एक श्रृंखला प्रस्तुत करते हैं। हमें उम्मीद है कि इन पद्धतियों से एचएसआर प्रयोगों में परिवर्तनशीलता में कमी आएगी और प्रजनन क्षमता बढ़ेगी । प्रयोगशालाओं के बीच एचएसआर अनुसंधान की सीधी तुलना को सुविधाजनक बनाना एचएसआर क्षेत्र में अनुसंधान में तेजी लाने का काम करेगा । इसके अलावा, मानकीकरण से अनुसंधान को उम्र बढ़ने और न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों में लाभ होगा जिनके साथ एचएसआर घनिष्ठ रूप से जुड़ा हुआ है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को फ्रैंक लेस्ली के एक दान ने समर्थन दिया था। सीजीसी द्वारा कुछ उपभेद प्रदान किए गए थे, जिन्हें एनआईएच कार्यालय ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18S-forward primer TTGCGTCAACTGTGGTCGTG
18S-reverse primer CCAACAAAAAGAACCGAAGT
CCTG
AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))] Morimoto lab http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/
C12C8.1-forward primer GTACTACGTACTCATGTGTCG
GTATTT
C12C8.1-reverse primer ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC
CFX Connect Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855200
CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)] Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD Lascar EL-USB-TP-LCD
Greenough Stereo Microscope S9i Series Leica
Hard Shell 96 Well PCR Plates Bio Rad HSS9601
hsp-16.2-forward primer ACTTTACCACTATTTCCGTCC
AGC
hsp-16.2-reverse primer CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG
iScript cDNA Synthesis Kit Bio Rad 1708891
iTaq Universal Sybr Green Super Mix Bio Rad 1725121
Laser Scanning Confocal Microscope Nikon Eclipse 90i
MultiGene OptiMax Thermo Cycler Labnet TC9610
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo Scientific ND-LITE
Parafilm M Roll Bemis 5259-04LC
RapidOut DNA Removal Kit Thermo Scientific K2981
Recirculating Heated Water Bath Lauda Brinkmann RE-206
Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer Fisher Scientific 15-081-103
TRIzol Reagent Invitrogen 15596026 RNA isolation reagent
TurboMix Attachment Scientific Industries SI-0564
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236

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References

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पर्यावरण विज्ञान अंक 161 हीट शॉक हीट शॉक रिस्पांस एचएसएफ-1 सी एलिगेंस,एचएसपी-16.2 एचएसपी-70 चैपरोन्स थर्मोटोलेंस थर्मो रिकवरी
<em>कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस</em> में हीट शॉक रिस्पांस के प्रेरण को मापने के लिए मानकीकृत तरीके
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Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (161), e61030, doi:10.3791/61030 (2020).

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