Summary
Hier werden standardisierte Protokolle zur Beurteilung der Induktion der Wärmeschockreaktion (HSR) bei Caenorhabditis elegans mit RT-qPCR auf molekularer Ebene, fluoreszierenden Reportern auf zellulärer Ebene und Thermorecovery auf Organismusebene vorgestellt.
Abstract
Die Hitzeschock-Reaktion (HSR) ist eine zelluläre Stressreaktion, die durch zytosolische Proteinfehlfaltung induziert wird, die zur Wiederherstellung der Proteinfaltungshomöostase oder Proteostase dient. Caenorhabditis elegans nimmt eine einzigartige und leistungsfähige Nische für die HSR-Forschung ein, da die HSR auf molekularer, zellulärer und organismischer Ebene beurteilt werden kann. Daher können Veränderungen auf molekularer Ebene auf zellulärer Ebene visualisiert und ihre Auswirkungen auf die Physiologie auf der Organismusebene quantisiert werden. Während Assays zur Messung der HSR einfach sind, machen Es bei Variationen in Timing, Temperatur und Methodik, die in der Literatur beschrieben werden, schwierig, die Ergebnisse in den Studien zu vergleichen. Darüber hinaus stellen diese Fragen ein Hindernis für alle dar, die die HSR-Analyse in ihre Forschung einbeziehen möchten. Hier wird eine Reihe von Protokollen zur robusten und reproduzierbaren Messung der Induktion der HSR mit RT-qPCR, fluoreszierenden Reportern und einem organismusförmigen Thermorecovery-Assay vorgestellt. Darüber hinaus zeigen wir, dass ein weit verbreiteter Thermoverträglichkeitstest nicht vom etablierten Master-Regler der HSR, HSF-1, abhängig ist und daher nicht für die HSR-Forschung verwendet werden sollte. Schließlich werden Variationen in diesen Assays in der Literatur diskutiert und Best Practices vorgeschlagen, um die Ergebnisse auf dem gesamten Gebiet zu standardisieren und letztlich neurodegenerative Erkrankungen, Alterung und HSR-Forschung zu erleichtern.
Introduction
Die Hitzeschockreaktion (HSR) ist eine universelle zelluläre Stressreaktion, die durch zytosolische Proteinfehlfaltung verursacht wird, die durch Temperaturerhöhungen und andere proteotoxische Belastungen verursacht wird. Die Aktivierung der HSR in Caenorhabditis elegans führt zu einer transkriptionellen Upregulation von Hitzeschockgenen wie hsp-70 und hsp-16.2. Viele Hitzeschockproteine (HSPs) fungieren als molekulare Chaperone, die proteinfaltige Homöostase oder Proteostase wiederherstellen, indem sie direkt mit falsch gefalteten oder beschädigten Proteinen interagieren. Der Hauptregler der HSR ist der Transkriptionsfaktor Heat Shock Factor 1 (HSF-1), dessen Aktivierung elegant über mehrere Mechanismen gesteuert wird1.
Die Rolle von HSF-1 ist nicht auf Stress beschränkt. HSF-1 ist für normales Wachstum und Entwicklung erforderlich, da die Löschung von hsf-1 zu Larvenstillstandführt 2. HSF-1 ist auch wichtig während der Alterung und altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen durch Ansammlung von Proteinaggregaten und die Unfähigkeit, Proteostase zu halten gekennzeichnet. Knockdown von hsf-1 verursacht Akkumulation von Proteinaggregaten und eine verkürzte Lebensdauer, während überexpression von hsf-1 die Proteinaggregation reduziert und die Lebensdauer3,4verlängert. Daher hat die Regulierung von HSF-1 auf molekularer Ebene weitreichende Auswirkungen auf die Physiologie und Krankheit des Organismus.
C. elegans ist ein mächtiger Modellorganismus für die HSR-Forschung, da die HSR auf der Molekular-, Zell- und Organismusebene4,,5,6gemessen werden kann. Unter Hervorhebung der Leistungsfähigkeit dieses Modells wurden wichtige Fortschritte bei der Abgrenzung des HSR-Signalwegs, wie gewebespezifische Unterschiede in der HSR-Regulierung, in C. elegans7,8entdeckt. Darüber hinaus ist C. elegans weit verbreitet für die Alterungsforschung und ist ein aufstrebendes System zur Modellierung von Krankheiten im Zusammenhang mit Proteostase-Störungen.
Obwohl Hitzeschock-Experimente mit C. elegans schnell und reproduzierbar sein können, gibt es mehrere Fragen, die vor Beginn zu berücksichtigen sind. Welche Temperatur sollte beispielsweise für die Induktion der HSR verwendet werden und wie lange sollten die Würmer freigelegt werden? Ist es besser, einen trockenen Inkubator oder ein Wasserbad zu verwenden? Welche Entwicklungsstufe sollte genutzt werden? Leider sind die Methoden zur Untersuchung der HSR von Labor zu Labor sehr unterschiedlich, was bei der Auswahl der besten Methoden Verwirrung stiftet und es schwierig macht, die Ergebnisse im gesamten Feld zu vergleichen.
Wir präsentieren robuste und standardisierte Protokolle für die Verwendung von RT-qPCR, fluoreszierenden Reportern und Thermorecovery zur Messung der HSR. Diese drei Ansätze ergänzen sich zwar, haben aber jeweils einzigartige Vor- und Nachteile. Zum Beispiel ist RT-qPCR die direkteste und quantitativste Messung der HSR, und dieser Test kann leicht erweitert werden, um viele verschiedene Wärmeschock-induzierbare Gene einzubeziehen. ALLERDINGS ist RT-qPCR der teuerste, kann technisch schwierig sein und erfordert den Einsatz von Spezialgeräten. Im Gegensatz dazu haben fluoreszierende Reporter den Vorteil, gewebespezifische Unterschiede in der HSR-Induktion zu messen. Sie sind jedoch schwer genau zu quantifizieren, können nur die Induktion über einer bestimmten Schwelle messen und erfordern die Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops. Zusätzlich sind die hier beschriebenen Reporterstämme im Vergleich zur Standard-N2-Sorte entwicklungsverzögert. Obwohl neuere Reporterstämme mit Single-Copy-Transgenes zur Verfügung stehen, wurden sie hier nicht getestet9. Der dritte Test, die Thermorecovery, hat den Vorteil, dass auf der Ebene des Organismus eine physiologisch relevante Auslesung erfolgt. Dieser Test ist jedoch wohl der am wenigsten empfindliche und indirekte. Schließlich diskutieren wir einige häufige Variationen, die in diesen Assays gefunden werden, und schlagen eine Reihe bewährter Verfahren vor, um die Forschung in diesem Bereich zu erleichtern.
Protocol
1. Wartung und Synchronisation von C. elegans
- Halten Sie Würmer bei 20 °C auf Nematode Growth Medium (NGM) Platten mit OP50 Escherichia coli Bakterien gesät, indem Sie mehrere Erwachsene auf frische Platten ca. 2x pro Woche10übertragen. Es sollte darauf geachtet werden, dass Würmer nicht mehr nahrung ausgehen, da dies ihre Physiologie beeinträchtigen kann11.
- Herstellung von NGM-Platten.
- 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-Pepton, 20 g Agar und deionisiert (DI) H2O bis 1 L in einem Kolben mischen.
- Autoklav die Mischung für die Sterilisation.
- Die Mischung auf 50 °C abkühlen lassen.
- 25 ml von 1 M KH2PO4 (pH = 6), 1 ml von 1 M CaCl2,1 ml 1 M MgSO4und 1 ml Cholesterin (5 mg/ml in 100% Ethanol) hinzufügen.
- Mit steriler Technik, gießen Sie die Mischung in 6 cm Platten, um etwa 100 Platten zu ergeben. Das Gießen von Platten ist einfacher, wenn die Mischung zuerst in ein 300 ml steriles Becherglas übertragen wird.
- 1 Tag bei Raumtemperatur (RT) erstarren lassen, bevor man mit Bakterien aussät oder bei 4 °C gelagert wird.
- Aussaat von OP50-Bakterien auf NGM-Platten.
- Wachsen Sie eine gesättigte OP50-Bakterienkultur über Nacht in LB bei 30 °C oder 37 °C.
- Legen Sie ca. 300 l der Kultur auf die Mitte einer 6 cm NGM-Platte.
- Lassen Sie die Platten bei RT für 1-3 Tage trocknen, je nach Bedarf, damit der bakterielle Rasen an der Platte haftet. Platten können dann bei 4 °C verwendet oder gelagert werden.
- Herstellung von NGM-Platten.
- Wachsen Sie die Würmer synchron, indem Sie frisch gelegte Eier isolieren (hier beschrieben) oder alternativ durch Das sammeln von Eiern nach dem Lösen von Würmern mit Bleichmittel.
- Übertragen Sie ca. 10 gravid adult würmer auf eine frische Platte mit einem Platindraht-Pick. Egg-Lay Synchronisation funktioniert am besten, wenn die Erwachsenen in den ersten Tag des Erwachsenenalters sind.
- Nach ca. 1 h die Würmer von der Platte entfernen. Dies sollte zu 40-60 Eiern pro Platte führen, abhängig von den Bedingungen und der Belastung.
2. Fluoreszierende Bildgebung von HSR-Reportern
- Synchronisieren Sie die Würmer (Abschnitt 1.2) und halten Sie bei 20 °C bis zur gewünschten Entwicklungsstufe. Für die fluoreszierenden Reporterstämme AM446 (hsp-70p::gfp) und CL2070 (hsp-16.2p::gfp) werden junge erwachsene Würmer, die noch keine Fortpflanzungsreife erreicht haben, 64 h nach der Eiverlegungssynchronisation erzeugt.
HINWEIS: Das Entwicklungszeitpunkt variiert je nach Sorte und Temperatur, bei der die Würmer angehoben werden. Beide HSR-Reporterstämme weisen eine leichte Entwicklungsverzögerung im Vergleich zu N2 auf. Wichtig ist, dass das Ausmaß der HSR-Induktion nach Beginn der Reproduktiven Reife etwa 2-4x abnimmt (siehe Diskussion). - Hitze schockieren die Würmer, indem sie Platten mit Paraffinfolie umwickelt und bei 33 °C für 1 h in ein zirkulierendes Wasserbad eintaucht. Ein dünner Streifen Paraffinfolie sollte 2x um die Platte gewickelt werden, um die Kanten zu versiegeln. Bedecken Sie nicht den Boden der Platte oder es könnte die Wärmeübertragung stören. Untertauchen Sie die Platten auf den Kopf mit einem Reagenzglasträger und einem Bleigewicht. Denken Sie daran, bei Bedarf eine negative Kontrollprobe (kein Hitzeschock) einzuschließen.
HINWEIS: Wenn die Paraffinfolie nicht sicher ist, gelangt Wasser in die Platte und die Platte sollte nicht für die Datenerfassung verwendet werden. - Stellen Sie die Würmer wieder her, indem Sie die Platten aus dem Wasserbad entfernen und mit einem Papiertuch trocknen. Entfernen Sie den Paraffinfilm und inkubieren Sie die Würmer bei 20 °C für 6-24 h. Diese Erholungsphase lässt genügend Zeit für die GFP-Synthese und Faltung vor der Bildgebung.
- Bereiten Sie Dias für die Bildgebung vor. Folien sollten für jeden Gebrauch frisch vorbereitet werden.
- Machen Sie eine 3% Agarose-Lösung in Wasser und Hitze mit einer Mikrowelle, bis die Agarose gelöst ist.
- Platzieren Sie ein Mikroskopschlitten für die Bildgebung zwischen zwei anderen Mikroskopdias, auf denen ein Streifen Laborband zu sehen ist, um einen Abstandsraum für das Agarose-Pad zu schaffen.
- Mit einer 1.000-L-Pipette legen Sie einen Tropfen (ca. 150 l) der erhitzten 3% Agarose in die Mitte des Mikroskopschlittens.
- Bedecken Sie das Mikroskopdia sofort mit einem leeren Mikroskopschlitten senkrecht zum ersten Dia, so dass der obere Schlitten auf dem Laborband auf den angrenzenden Dias ruht. Dies breitet den Tropfen der Agarose aus, um ein Pad von gleichmäßiger Breite zu schaffen.
- Entfernen Sie vorsichtig die obere Folie.
- Immobilisieren Sie die Würmer, indem Sie eine 200-L-Pipette verwenden, um einen kleinen Tropfen (ca. 5 l) von 1 mM Levamisol im M9-Puffer in die Mitte des Agarose-Pads hinzuzufügen. Dann übertragen Sie 10 Würmer in den Tropfen von Levamisol mit einem Platindraht-Pick. Abdeckung mit einem Deckelschlupf. Das Abdichten des Deckels ist für ein aufrechtes Mikroskop nicht erforderlich. Optional können die Würmer ausgerichtet werden, wenn sie gelähmt werden, indem sie die Levamisole ausbreiten, an der Außenseite des Agarose-Pads, und die Würmer mit einem Platindrahtpick ausrichten. Alternativ kann das Levamisol mit einem Labortuch aufgesogen werden.
HINWEIS: Bild so schnell wie möglich, da eine längere Inkubation in Levamisol die Fluoreszenz verändern könnte. - Bildnis der Würmer mit einem Fluoreszenzmikroskop. Die Details der Bildaufnahme variieren je nach Mikroskop und Software.
HINWEIS: Um die Bildintensitäten direkt zu vergleichen, verwenden Sie identische Mikroskopeinstellungen in einer Bildeinheit. Vermeiden Sie eine Überbestufung des Bildes.
3. Messung der HSR-Genexpression mit RT-qPCR
- Würmer (Abschnitt 1.2) synchronisieren und bei 20 °C bis zur gewünschten Entwicklungsstufe halten. Bei N2-Würmern werden junge erwachsene Würmer, die noch keine Fortpflanzungsreife erreicht haben, 60 h nach der Eiablagesynchronisation erzeugt.
HINWEIS: Das Entwicklungszeitpunkt variiert je nach Sorte und Temperatur, bei der die Würmer angehoben werden. Wichtig ist, dass das Ausmaß der HSR-Induktion nach Beginn der Reproduktiven Reife etwa 2-4x abnimmt (siehe Diskussion). - Hitzeschockwürmer, wie in Schritt 2.2 beschrieben.
- Nehmen Sie die Platten aus dem Wasserbad, entfernen Sie den Paraffinfilm und sammeln Sie sofort die Würmer. Die Würmer können gesammelt werden, indem die Platten vorsichtig mit 1 ml M9 gewaschen, die Flüssigkeit in einem Mikrozentrifugenrohr gesammelt und dann die M9 nach zentrifugieren bei 400 x g für 1 min entfernt werden.
- Lyse die Würmer und reinigen Sie die RNA mit organischer Extraktion.
- Fügen Sie 250 L RNA-Isolationsreagenz hinzu (siehe Tabelle der Materialien).
- Wirbelrohre von Hand für 30 s.
- Vortex-Rohre für 20 min bei 4 °C mit einem Mikrozentrifugenrohraufsatz (siehe Materialtabelle).
- Fügen Sie 50 l Chloroform hinzu.
- Wirbel für 30 s.
- Inkubieren Sie die Proben bei RT für 3 min.
- Zentrifuge bei 14.000 x g für 15 min bei 4 °C.
- Übertragen Sie die wässrige Schicht (d. h. die obere Schicht, 125 L) in ein neues Mikrozentrifugenrohr.
HINWEIS: Vermeiden Sie die organische Schicht und das Material in der Schnittstelle. - Fügen Sie 50 l Chloroform hinzu.
- Wirbel für 30 s.
- Inkubieren Sie die Proben bei RT für 3 min.
- Zentrifuge bei 14.000 x g für 5 min bei 4 °C.
- Übertragen Sie die wässrige Schicht (ca. 100 l) in ein neues Mikrozentrifugenrohr.
HINWEIS: Vermeiden Sie die organische Schicht und das Material in der Schnittstelle. - Ausfällung der RNA mit einem gleichen Volumen (d. h. 100 l) Isopropanol.
- Bei -20 °C mindestens 30 min, vorzugsweise aber über Nacht inkubieren.
HINWEIS: Das Experiment kann hier angehalten und die RNA bei -20 °C gespeichert werden. - Pellet der RNA durch Zentrifugation bei 14.000 x g für 30 min bei 4 °C.
- Entfernen Sie so viel vom Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören.
HINWEIS: Das Pellet ist klein und möglicherweise nicht sichtbar. Das Pellet kann nicht fest an der Seite des Rohres haften, so dass Vorsicht notwendig ist, um zu vermeiden, dass es sich verwirre. - Waschen Sie das Pellet mit 250 l 70% eiskaltem Ethanol aus RNase-freiemH2O.
- Zentrifuge bei 14.000 x g für 5 min bei 4 °C.
- Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören.
- Führen Sie eine schnelle Drehung bei RT durch, um alle verbleibenden 70% Ethanol zu entfernen.
- Trocknen Sie das Pellet, indem Sie die Rohre bei RT geöffnet lassen, so lange wie nötig; in der Regel mindestens 20 min. Rohre können mit einem fusselfreien Gewebe oder Aluminiumfolie abgedeckt werden, um eine Kontamination zu verhindern.
- Das Pellet in 20 l RNase-freiH2 Owieder aufhängen.
- Bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit einem kleinen Volumenspektrophotometer (2 l).
HINWEIS: Das Experiment kann hier angehalten und die RNA bei oder unter -20 °C temporär gespeichert werden.
- Entfernen Sie Die Rest-DNA durch Inkubation mit DNase I. Es wird empfohlen, ein handelsübliches Kit zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien) und den Anweisungen des Herstellers zu folgen.
- Bereiten Sie mit diesem Kit eine 20-L-Reaktion mit 500 ng RNA und 1 l DNase I in einem 37 °C-Wasserbad für 30 min vor.
- Fügen Sie jeder Probe 2,5 L DNase-Inaktivierungsreagenz hinzu (im Kit enthalten) und inkubieren Sie bei RT 5 min mit gelegentlichem Flicken/Wirbeln.
- Drehen Sie bei 14.000 x g für 2 min.
- Ohne das weiße Pellet zu stören, übertragen Sie 15 L Überstand auf ein frisches Mikrorohr für die cDNA-Synthese.
- Führen Sie cDNA-Synthese durch. Es wird empfohlen, ein handelsübliches Kit zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien) und den Anweisungen des Herstellers zu folgen.
- Bereiten Sie mit dem Kit eine 20-L-Reaktion mit 15 L DNase I-behandelter RNA aus dem vorherigen Schritt und 1 l Reverse-Transkriptase vor.
- Verwenden Sie das folgende Programm für die cDNA-Synthese: 25 °C für 5 min, 46 °C für 20 min, 95 °C für 1 min, 4 °C halten.
- Verdünnen Sie cDNA, indem Sie der Probe 80 l RNase-freiesH2O direkt hinzufügen.
- Kurz wirbeln, dann nach unten drehen und bei -20 °C lagern, bis nötig.
- Führen Sie qPCR aus. Es wird empfohlen, ein handelsübliches Kit zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien) und den Anweisungen des Herstellers zu folgen.
- Bereiten Sie mit dem Kit eine 25-L-Reaktion vor, die 2 l cDNA und 200 nM (jeweils) Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen in einem Brunnen einer 96-Well-Platte enthält.
- Primersequenzen zur Messung der Wärmeschockgene hsp-70 und hsp-16.2sowie 18S rRNA (für eine Normalisierungskontrolle) sind in der Tabelle der Materialienaufgeführt. Mehrere Normalisierungssteuerelemente können nach Belieben verwendet werden.
- Verdünnen Sie cDNA-Proben 50x vor der Messung von 18S, um sicherzustellen, dass sich der Test im linearen Bereich befindet. Die entsprechenden qPCR-Bedingungen variieren je nach verwendetem Kit und den verwendeten Primern (siehe Repräsentative Ergebnisse).
- Verwenden Sie ein Echtzeit-PCR-Erkennungssystem (siehe Materialtabelle) für qPCR mit 40 Zyklen von 95 °C für 5 s Denaturierung, 58 °C für 30 s Glühen und 72 °C für 30 s Verlängerung.
HINWEIS: Optimale Glühtemperaturen können je nach Grundierung und Bedingungen variieren. - Quantifizieren Sie entweder die Methode der "CT" oder "Standard-Kurven"12.
4. Thermorecovery-Assay zur Messung von HSR auf Organismusebene
- Synchronisieren Sie die Würmer (Abschnitt 1.2) und halten Sie bei 20 °C bis zur gewünschten Entwicklungsstufe. Bei N2-Würmern werden junge erwachsene Würmer, die noch keine Fortpflanzungsreife erreicht haben, 60 h nach der Eiablagesynchronisation erzeugt.
HINWEIS: Das Entwicklungszeitpunkt variiert je nach Sorte und Temperatur, bei der die Würmer angehoben werden. Wichtig ist, dass das Ausmaß der HSR-Induktion nach Beginn der Reproduktiven Reife etwa 2-4x abnimmt (siehe Diskussion). - Hitzeschock der Würmer, wie in Schritt 2.2 für 6 h beschrieben.
- Entfernen Sie die Platten aus dem Wasserbad, entfernen Sie den Paraffinfilm und lassen Sie die Würmer durch Inkubation bei 20 °C für 48 h erholen.
- Zählen Sie die Anzahl der Würmer, die nach mechanischer Stimulation sofort wegkriechen können, ohne ruckartige Bewegung oder Lähmung.
HINWEIS: Die 6-h-Inkubation ist optimal für die Untersuchung von Bedingungen, die die Thermorecovery reduzieren, aber längere Belichtungszeiten können erforderlich sein, um nach Bedingungen zu suchen, die die Thermorecovery verbessern.
Representative Results
Anhand der in diesem Manuskript beschriebenen Protokolle wurde die HSR-Induktion mit fluoreszierenden Reportern, RT-qPCR und Thermorecovery-Assays gemessen. In jedem Fall wurde das Verfahren in Abschnitt 1.2 verwendet, um synchronisierte, junge erwachsene Würmer zu erzeugen, die keine Fortpflanzungsreife erreicht hatten.
Um die HSR-Induktion auf zellulärer Ebene zu visualisieren, wurden die fluoreszierenden Reporterstämme AM446 (hsp-70p::gfp) und CL2070 (hsp-16.2p::gfp) nach Abschnitt 2 des Protokolls analysiert. In den Negativkontrollproben ohne Hitzeschock zeigte der hsp-16.2-Reporter nur eine normale Autofluoreszenz, aber der hsp-70-Reporter hatte konstitutive Fluoreszenz im analen Depressormuskel, wie zuvor berichtet4 (Abbildung 1A). Nach 1 h Hitzeschock bei 33 °C wurde bei beiden Reportern eine robuste Fluoreszenz beobachtet; Das Ausdrucksmuster war jedoch je nachdem, welcher Reporter verwendet wurde , unterschiedlich (Abbildung 1B). Der hsp-70 Reporter war am hellsten im Darm und Spermatheca, während der hsp-16.2 Reporter am hellsten im Rachen war. Zusätzlich hatte der hsp-16.2-Reporter eine hohe Wurm-zu-Wurm-Variabilität in der zuvor beschriebenen Induktionsmenge, aber der hsp-70-Reporter nicht13.
Eine häufig verwendete Variante von Abschnitt 2 besteht darin, den Hitzeschock in einem trockenen Inkubator anstelle eines zirkulierenden Wasserbades durchzuführen. Daher wurde auch der Unterschied zwischen den beiden Methoden getestet. Es wurde festgestellt, dass beide Protokolle zu einer robusten Induktion der beiden fluoreszierenden Reporter unter Verwendung unserer Bedingungen führten, obwohl ein zirkulierendes Wasserbad als bewährte Methode empfohlen wird (siehe Diskussion) (Abbildung 1B).
Um die Abhängigkeit der Reporter vom Transkriptionsfaktor HSF-1 zu testen, wurde die Fütterung von RNAi verwendet, um hsf-1 abzusenken, bevor die Induktion des Reporters gemessen wurde. Es wurde festgestellt, dass die Fluoreszenz beider Stämme bei HSF-1-Knockdown stark reduziert wurde, was darauf hindeutet, dass diese Reporter HSF-1-abhängig sind, wie in der Literatur4 (Abbildung 2) beschrieben. Es wurde jedoch auch beobachtet, dass die Pharyngealfluoreszenz bei beiden Reportern nach hsf-1-Knockdown fortbestand, was mit früheren Berichten übereinstimmt, dass der Rachenmuskel durch Füttern14gegen RNAi resistent ist.
Um die gesamte Wurminduktion der HSR auf molekularer Ebene zu quantitieren, wurden mit RT-qPCR zwei endogene HSPs mit Abschnitt 3 des Protokolls gemessen. Die Proben wurden in Dreifacharbeit gemessen, für jede Grundierung wurde eine Standardkurve erzeugt und für jede Probe eine Schmelzekurve für die Qualitätskontrolle analysiert. Es wurde festgestellt, dass ein 33 °C Hitzeschock für 1 h zu einer mehr als 2.000-fachen Zunahme der relativen Expression für zwei Hitzeschockgene, hsp-70 und hsp-16.2 (Abbildung 3) führte. Diese Ergebnisse zeigen, dass beide endogenen Gene zur Messung der HSR-Induktion geeignet sind und dass ein 33 °C-Wärmeschock für 1 h ausreicht, um eine wesentliche Reaktion zu erzeugen. Bei der Interpretation des absoluten Grades der Hitzeschock-Induktion ist jedoch Vorsicht geboten, da die mRNA-Werte in Abwesenheit eines Hitzeschocks sehr niedrig sind.
Um eine physiologische Reaktion auf Hitzeschock zu analysieren, wurde ein organismusher Thermorecovery-Test mit Abschnitt 4 des Protokolls getestet. Es wurde festgestellt, dass die Exposition von Würmern bei einem 6 h Hitzeschock bei 33 °C zu einer 20%igen Abnahme der Würmer mit normaler Bewegung nach einer 48 h Erholung führte (Abbildung 4A). Die Abhängigkeit dieses Tests vom HSF-1-Transkriptionsfaktor wurde mit Hilfe von FütterungRNAi getestet, um hsf-1 abzubauen, bevor Würmer dem Stress aussetzten. Es wurde festgestellt, dass der Knockdown von hsf-1 einen dramatischen Rückgang der normalen Bewegung verursachte, wobei >95% der Würmer ruckartige Bewegung oder Lähmung zeigten, nachdem sie mit einem Platindrahtpicker gesponnen wurden.
Wir verglichen diesen Thermorecovery-Assay mit einem weit verbreiteten alternativen Organismus-Assay, der gemeinhin als Thermotoleranz bezeichnet wird. Im Thermoverträglichkeitstest werden Würmer mit einem trockenen Inkubator einer kontinuierlichen Temperatur von 35 °C ausgesetzt, und der Anteil der lebenden Würmer wird zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen. Anhand dieses Testes wurde festgestellt, dass Kontrollwürmer, die kontinuierlich 35 °C ausgesetzt waren, nach etwa 8 h Exposition starben(Abbildung 4B). Als jedoch die Abhängigkeit dieses Tests von HSF-1 mit RNAi Knockdown getestet wurde, wurde festgestellt, dass die Hemmung von hsf-1 keine Abnahme der Thermoverträglichkeit verursachte. Ähnliche Ergebnisse wurden bereits mit HSF-1-Mutationen gezeigt (siehe Diskussion). Daher wird die Verwendung des Thermotoleranz-Assays zur Messung der HSR nicht empfohlen, und Thermorecovery ist die bevorzugte Methode zur Untersuchung der HSR auf Organismusebene.
Abbildung 1: HSR-Induktion mit fluoreszierenden Reportern gemessen. (A) Die basale und (B) hitzeinduzierbare Expression von hsp-70p::gfp und hsp-16.2p::gfp Reporterstämme nach 1 h Hitzeschock bei 33 °C in einem Wasserbad oder Inkubator. Würmer wurden auf OP50-Bakterien für 64 h aufgezogen, Hitze schockiert, und dann bei 20 °C für 8 h vor der Bildgebung erholt. Als Referenz wurden die keine Hitzeschockwürmer in (A) in (B) renormalisiert, um der Reichweite und Sättigung der hitzegeschockten Würmer zu entsprechen. Repräsentative Bilder von zwei experimentellen Repliken werden gezeigt. Maßstabsleiste = 250 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die mit Fluoreszenzreportern gemessene HSR-Induktion ist abhängig von HSF-1. Stämme, die die hsp-70p::gfp und hsp-16.2p::gfp-Reporter enthielten, wurden auf Kontrolle (L4440 leerer Vektor) oder hsf-1 RNAi-Platten für 64 h angehoben, einem 1 h Hitzeschock bei 33 °C in einem Wasserbad ausgesetzt und dann bei 20 °C für 8 h vor der Bildgebung wiederhergestellt. Repräsentative Bilder von zwei experimentellen Repliken werden gezeigt. Maßstabsleiste = 250 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: HSR-Induktion gemessen mit RT-qPCR. N2-Würmer wurden 60 h lang auf HT115-Bakterien aufgezogen und dann in einem 33 °C-Wasserbad 1 h geschockt. Die relativen mRNA-Werte von hsp-70 (C12C8.1) und hsp-16.2 werden normalisiert zur no heat-shock control angezeigt. Die dargestellten Werte sind der Mittelwert von vier biologischen Replikationen und Fehlerbalken stellen sem dar. Die statistische Signifikanz wurde mit einem ungepaarten Schüler-T-Test berechnet. **p < 0,01. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Thermorecovery, aber keine Thermoverträglichkeit, ist abhängig von HSF-1. N2-Würmer wurden bei Kontrolle (L4440) oder hsf-1 RNAi-Platten für 60 h angehoben und dann auf folgendes verschoben: (A) Ein 33 °C-Wasserbad für 6 h und bei 20 °C für 48 h zurückgewonnen, bevor er für normale Bewegungen (Thermorecovery) oder (B) einen 35 °C trockener Inkubator bewertete und alle 2 h bis tot (Thermoverträglichkeit) entferntwurde. Jeder Assay wurde mit n 30 Personen an 2 unabhängigen Tagen durchgeführt. Der Durchschnitt wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
In der Literatur wurden eine Vielzahl von Temperaturen, Zeiten und Geräten verwendet, um die HSR zu assayen, was unnötige Vorbehalte eingeführt hat und zu Schwierigkeiten beim Vergleich der Ergebnisse zwischen Laboratorien geführt hat. Zum Beispiel wurden Temperaturen zwischen 32-37 °C und Zeiten von 15 min bis mehrere Stunden verwendet, um den HSR15zu induzieren. Es wird jedoch berichtet, dass die Letalität bereits 3 h bei 37 °C für alle Stadien und 1,5 h für Erwachsene am 1. Tag15auftritt. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Exposition von Würmern bei 35 °C eine Letalität verursacht, die nicht HSF-1 abhängig ist, was diese Bedingungen für die Analyse der HSR schlecht geeignet macht. Im Gegensatz dazu ist ein Hitzeschock von 33 °C für 1 h robust genug, um eine starke Induktion von Hitzeschock-Genen auszulösen, aber mild genug, um die Wurmlebensfähigkeit nicht zu beeinträchtigen. Tatsächlich führt die Exposition gegenüber 33 °C für 6 h nur dazu, dass 20 % der Würmer eine abnormale Bewegung aufweisen. Daher schlagen wir vor, eine Temperatur von 33 °C und eine Zeit von 1 h als standardisierte Bedingung für RT-qPCR- und fluoreszierende Reporter-Assays zu verwenden.
Jüngste Experimente haben gezeigt, dass die Entwicklungsinszenierung von Würmern für HSR-Experimente besonders wichtig ist. Kürzlich wurde gezeigt, dass in C. elegans die Induzierbarkeit der HSR um >50% abnimmt (d.h. kollabiert), wenn Hermaphroditen mit der Eiablage beginnen5. Die korrekte Inszenierung der Würmer ist von entscheidender Bedeutung, da es oft Unterschiede im Entwicklungszeitpunkt in Stämmen gibt, die Mutationen tragen. Wenn temperaturempfindliche Mutanten verwendet werden, wirkt sich dies auch auf die Ergebnisse aus, wenn sie nicht durch ihr Fortpflanzungsalter synchronisiert werden. Daher wird empfohlen, den Beginn der Eiablage für jede Sorte sorgfältig zu messen, um zu bestimmen, wann der Kollaps auftritt. Das Zeitfenster nach dem L4-Molt und vor Beginn der Fortpflanzungsreife ist eng; Daher ist darauf zu achten, dass der HSR-Kollaps nicht versehentlich zu Variabilität der Ergebnisse führt.
Neben dem Entwicklungszeitpunkt können überraschend geringe Temperaturänderungen von nur 1 °C erhebliche Auswirkungen auf die HSR haben. Zum Beispiel sind thermosensorische Neuronen in C. Elegans empfindlich gegenüber Temperaturänderungen von bis zu 0,05 °C16. Daher ist es unerlässlich, ein Thermometer zu verwenden, das die Temperatur genau messen kann. Daher schlagen wir als bewährte Methode die Verwendung eines kalibrierten Geräts für die Temperaturmessung vor, das präzise genug ist, um Temperaturen innerhalb von 0,1 °C zu messen. Darüber hinaus sollte ein Thermometer mit einer Datenprotokollierungsfunktion verwendet werden, um Temperaturschwankungen über die Zeit hinweg zu messen. Viele Inkubatoren haben thermische Schwankungen von mehr als 1 °C in verschiedenen Teilen des Inkubators und im Laufe der Zeit, die erhebliche Auswirkungen auf HSR-Experimente haben können. Als bewährte Methode empfehlen wir die Verwendung von Inkubatoren mit ausreichender Isolierung und Zirkulation, um Temperaturschwankungen zu minimieren. Für die Durchführung von Hitzeschockexperimenten schlagen wir eine bewährte Praxis für ein zirkulierendes Wasserbad vor. Die Zeit, die eine Agarplatte benötigt, um eine gewünschte Temperatur zu erreichen, beträgt ca. 6-7 min in einem Wasserbad, aber viel länger in einem trockenen Inkubator15,17. Wenn jedoch kein zirkulierendes Wasserbad zur Verfügung steht, haben wir gezeigt, dass eine robuste HSR-Induktion auch in einem trockenen Inkubator unter unseren Bedingungen auftritt. Wenn ein trockener Inkubator verwendet wird, sollte das Öffnen des Inkubators für die Dauer der Spannung minimiert werden.
Es ist allgemein bekannt, dass die Induktion von Hitzeschockgenen vom Masterregulator der HSR, HSF-1, abhängt. Hier stellen wir Beweise dafür vor, dass die beiden weiteren indirekten Assays, fluoreszierende Reporter und Thermorecovery, ebenfalls von HSF-1 abhängig sind. Bezeichnenderweise fanden wir heraus, dass ein häufig verwendeter alternativer Organismus-Assay, Thermotoleranz, nicht HSF-1 abhängig ist, indem hsf-1 RNAi verwendet wird (Abbildung 4). Ähnliche Ergebnisse wurden bereits mit einem hsf-1 Mutant oder einem ttx-3 Mutant berichtet, der die HSR18,19,20blockiert. Zusammen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Thermoverträglichkeitstest nicht für die HSR-Forschung verwendet werden sollte. Darüber hinaus deutet dies darauf hin, dass es eine bewährte Methode ist, die HSF-1-Abhängigkeit für jeden Test zu testen, der zur Messung der HSR verwendet wird.
Zusammen stellen wir eine Reihe standardisierter Protokolle und Best Practices für die robuste und reproduzierbare Messung der HSR-Induktion in C. elegansvor. Wir hoffen, dass diese Methoden die Variabilität in HSR-Experimenten verringern und die Reproduzierbarkeit erhöhen werden. Die Erleichterung direkter Vergleiche der HSR-Forschung zwischen Laboratorien wird dazu beitragen, die Forschung im HSR-Bereich zu beschleunigen. Darüber hinaus wird die Standardisierung der Erforschung von Alterungs- und neurodegenerativen Erkrankungen zugute kommen, mit denen die HSR eng verbunden ist.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch eine Spende von Frank Leslie unterstützt. Einige Stämme wurden von der CGC bereitgestellt, die vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18S-forward primer | TTGCGTCAACTGTGGTCGTG | ||
| 18S-reverse primer | CCAACAAAAAGAACCGAAGT CCTG |
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| AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))] | Morimoto lab | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/ | |
| C12C8.1-forward primer | GTACTACGTACTCATGTGTCG GTATTT |
||
| C12C8.1-reverse primer | ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC | ||
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855200 | |
| CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
| EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD | Lascar | EL-USB-TP-LCD | |
| Greenough Stereo Microscope S9i Series | Leica | ||
| Hard Shell 96 Well PCR Plates | Bio Rad | HSS9601 | |
| hsp-16.2-forward primer | ACTTTACCACTATTTCCGTCC AGC |
||
| hsp-16.2-reverse primer | CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio Rad | 1708891 | |
| iTaq Universal Sybr Green Super Mix | Bio Rad | 1725121 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | Eclipse 90i | |
| MultiGene OptiMax Thermo Cycler | Labnet | TC9610 | |
| N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE | |
| Parafilm M Roll | Bemis | 5259-04LC | |
| RapidOut DNA Removal Kit | Thermo Scientific | K2981 | |
| Recirculating Heated Water Bath | Lauda Brinkmann | RE-206 | |
| Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer | Fisher Scientific | 15-081-103 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation reagent |
| TurboMix Attachment | Scientific Industries | SI-0564 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 |
References
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