Summary
Hier worden gestandaardiseerde protocollen gepresenteerd om de inductie van de warmteschokrespons (HSR) in Caenorhabditis elegans te beoordelen met behulp van RT-qPCR op moleculair niveau, tl-verslaggevers op cellulair niveau en thermorecovery op organism niveau.
Abstract
De warmteschokrespons (HSR) is een cellulaire stressrespons veroorzaakt door cytosolische eiwitmisfolding die functies heeft om eiwitvouwende homeostase of proteostase te herstellen. Caenorhabditis elegans neemt een unieke en krachtige niche in voor HSR-onderzoek, omdat de HSR kan worden beoordeeld op moleculair, cellulair en organismaniveau. Daarom kunnen veranderingen op moleculair niveau op cellulair niveau worden gevisualiseerd en kunnen hun effecten op de fysiologie op organismaniveau worden gekwantificeerd. Terwijl de testen voor het meten van de HSR eenvoudig zijn, maken variaties in de timing, temperatuur en methodologie die in de literatuur worden beschreven het een uitdaging om resultaten over studies te vergelijken. Bovendien vormen deze kwesties een belemmering voor iedereen die HSR-analyse in zijn onderzoek wil opnemen. Hier wordt een reeks protocollen gepresenteerd voor het meten van de inductie van de HSR op een robuuste en reproduceerbare manier met RT-qPCR, tl-verslaggevers en een organismale thermorecovery test. Bovendien tonen we aan dat een veelgebruikte thermotolerancetest niet afhankelijk is van de gevestigde hoofdregulator van de HSR, HSF-1, en daarom niet mag worden gebruikt voor HSR-onderzoek. Ten slotte worden variaties in deze tests in de literatuur besproken en worden best practices voorgesteld om resultaten in het hele veld te standaardiseren, waardoor neurodegeneratieve ziekten, veroudering en HSR-onderzoek uiteindelijk worden vergemakkelijkt.
Introduction
De warmteschokrespons (HSR) is een universele cellulaire stressrespons veroorzaakt door cytosolische eiwitmisfolding veroorzaakt door temperatuurstijgingen en andere proteotoxische spanningen. Activering van de HSR in Caenorhabditis elegans leidt tot transcriptie upregulatie van hitteshock genen zoals hsp-70 en hsp-16.2. Veel warmteschok eiwitten (HSP's) functioneren als moleculaire chaperonnes die eiwit vouwen homeostase, of proteostase, te herstellen door direct interactie met verkeerd gevouwen of beschadigde eiwitten. De hoofdregulator van de HSR is de transcriptiefactor Heat Shock Factor 1 (HSF-1), waarvan de activering elegant wordt geregeld via meerdere mechanismen1.
De rol van HSF-1 is niet beperkt tot stress. HSF-1 is nodig voor normale groei en ontwikkeling, omdat verwijdering van hsf-1 leidt tot larve arrestatie2. HSF-1 is ook belangrijk tijdens veroudering en leeftijdsgebonden neurodegeneratieve ziekten die worden gekenmerkt door accumulatie van eiwitaggregaten en een onvermogen om proteostase te behouden. Knockdown van hsf-1 veroorzaakt ophoping van eiwitaggregaten en een kortere levensduur, terwijl overexpressie van hsf-1 eiwitaggregatie vermindert en de levensduurverlengt 3,4. Daarom heeft de regulering van HSF-1 op moleculair niveau brede implicaties voor de organismale fysiologie en ziekte.
C. elegans is een krachtig modelorganisme voor HSR-onderzoek omdat de HSR kan worden gemeten op moleculaire, cellulaire en organismale niveaus4,5,6. Wijzend op de kracht van dit model, zijn belangrijke vooruitgang geboekt bij het afbakenen van de HSR-route, zoals weefselspecifieke verschillen in HSR-regulatie, in C. elegans7,8. Bovendien wordt C. elegans veel gebruikt voor verouderingsonderzoek en is het een opkomend systeem voor het modelleren van ziekten die verband houden met proteostaseverstoring.
Hoewel hitteshockexperimenten met C. elegans snel en reproduceerbaar kunnen zijn, zijn er verschillende vragen om te overwegen voordat u begint. Bijvoorbeeld, welke temperatuur moet worden gebruikt voor inductie van de HSR en hoe lang moeten de wormen worden blootgesteld? Is het beter om een droge couveuse of een waterbad te gebruiken? Welke ontwikkelingsfase moet worden gebruikt? Helaas, de methoden die worden gebruikt om de HSR te onderzoeken variëren sterk van laboratorium tot laboratorium, waardoor verwarring bij het selecteren van de beste methoden en waardoor het moeilijk is om resultaten te vergelijken over het hele veld.
We presenteren robuuste en gestandaardiseerde protocollen voor het gebruik van RT-qPCR, tl-verslaggevers en thermorecovery om de HSR te meten. Hoewel deze drie benaderingen complementair zijn, hebben ze elk unieke voor- en nadelen. Rt-qPCR is bijvoorbeeld de meest directe en kwantitatieve meting van de HSR, en deze test kan gemakkelijk worden uitgebreid met veel verschillende warmteschok-induceerbare genen. Echter, RT-qPCR is de duurste, kan technisch moeilijk zijn, en vereist het gebruik van gespecialiseerde apparatuur. Fluorescerende verslaggevers hebben daarentegen het voordeel van het meten van weefselspecifieke verschillen in HSR-inductie. Ze zijn echter moeilijk nauwkeurig te kwantificeren, kunnen alleen inductie boven een bepaalde drempel meten en vereisen het gebruik van een fluorescentiemicroscoop. Bovendien, de verslaggever stammen hier beschreven zijn ontwikkelings vertraagd in vergelijking met de standaard N2 stam. Hoewel nieuwere reporter stammen met single-copy transgenes beschikbaar zijn, zijn ze hier niet getest9. De derde test, thermorecovery, heeft het voordeel dat het op organismaniveau fysiologisch relevante uitlezingen levert. Echter, deze test is misschien wel de minst gevoelige en meest indirecte. Tot slot bespreken we enkele veelvoorkomende variaties in deze tests en stellen we een reeks beste praktijken voor om onderzoek op dit gebied te vergemakkelijken.
Protocol
1. Onderhoud en synchronisatie van C. elegans
- Houd wormen op 20 °C op Nematode Growth Medium (NGM) platen gezaaid met OP50 Escherichia coli bacteriën door het overbrengen van meerdere volwassenen op verse platen ongeveer 2x per week10. Zorg moet worden genomen om te voorkomen dat wormen opraken van voedsel, want dit kan invloed hebben op hun fysiologie11.
- Bereiding van NGM platen.
- Meng 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-pepton, 20 g agar en gedeïsized (DI) H2O tot 1 L in een kolf.
- Autoclave het mengsel voor sterilisatie.
- Laat het mengsel afkoelen tot ~50 °C.
- Voeg 25 mL van 1 M KH2PO4 (pH = 6), 1 mL van 1 M CaCl2,1 mL van 1 M MgSO4en 1 mL cholesterol (5 mg/mL in 100% ethanol) toe.
- Giet het mengsel met behulp van steriele techniek in 6 cm platen om ongeveer 100 platen op te leveren. Gietplaten is gemakkelijker als het mengsel eerst wordt overgebracht naar een 300 mL steriel bekerglas.
- Laat 1 dag stollen bij kamertemperatuur (RT) voordat u met bacteriën zaait of opslaat bij 4 °C.
- Zaaien van OP50 bacteriën op NGM platen.
- Kweek een verzadigde op50-bacteriecultuur in LB bij 30 °C of 37 °C.
- Plaats ongeveer 300 μL van de cultuur op het centrum van een 6 cm NGM plaat.
- Laat platen drogen op RT voor 1-3 dagen als dat nodig is voor de bacteriële gazon te hechten aan de plaat. Platen kunnen dan worden gebruikt of opgeslagen bij 4 °C.
- Bereiding van NGM platen.
- Kweek de wormen synchroon door vers gelegde eieren te isoleren (hier beschreven) of als alternatief door eieren te verzamelen na het oplossen van wormen met bleekmiddel.
- Breng ongeveer 10 aangetrokken volwassen wormen naar een verse plaat met behulp van een platina draad te halen. Ei-lay synchronisatie werkt het beste als de volwassenen in de eerste dag van volwassenheid.
- Na ongeveer 1 uur, verwijder de wormen van de plaat. Dit moet resulteren in 40-60 eieren per bord, afhankelijk van de omstandigheden en de stam.
2. Fluorescerende beeldvorming van HSR verslaggevers
- Synchroniseer de wormen (punt 1.2) en houd op 20 °C tot de gewenste ontwikkelingsfase. Voor de AM446 (hsp-70p::gfp) en CL2070 (hsp-16.2p::gfp) fluorescerende reporter stammen, jong volwassen wormen die nog niet hebben bereikt reproductieve rijpheid worden gegenereerd 64 uur na de ei-leggen synchronisatie.
OPMERKING: De ontwikkelingstiming varieert per stam en de temperatuur waarbij de wormen worden verhoogd. Beide HSR reporter stammen vertonen een lichte ontwikkelingsvertraging ten opzichte van N2. Belangrijk is dat de omvang van HSR-inductie ongeveer 2-4x daalt na het begin van de reproductieve rijpheid (zie Discussie). - Verwarm schok de wormen door het verpakken van platen met paraffine film en onderdompelen in een circulerend water bad op 33 °C voor 1 h. Een dunne strook paraffine film moet worden gewikkeld 2x rond de plaat om de randen te verzegelen. Bedek de onderkant van de plaat niet of het kan de warmteoverdracht verstoren. Dompel de platen ondersteboven met behulp van een reageerbuis rek en een loodgewicht. Vergeet niet om een negatieve controle monster (geen warmteschok) indien nodig op te nemen.
LET OP: Als de paraffinefolie niet veilig is, komt er water in de plaat en mag de plaat niet worden gebruikt voor het verzamelen van gegevens. - Herstel de wormen door het verwijderen van de platen uit het waterbad en drogen met een papieren handdoek. Verwijder de paraffinefilm en ontcubeer de wormen bij 20 °C gedurende 6-24 uur. Deze herstelperiode biedt voldoende tijd voor GFP-synthese en vouwen voor beeldvorming.
- Maak dia's klaar voor beeldvorming. Glijbanen moeten vers worden bereid voor elk gebruik.
- Maak een 3% agarose oplossing in water en warmte met behulp van een magnetron totdat de agarose is opgelost.
- Plaats een microscoop dia voor beeldvorming tussen twee andere microscoop dia's die een strook van laboratorium tape op hen hebben om een spacer voor de agarose pad te creëren.
- Met behulp van een pipet van 1.000 μL plaatst u een druppel (~150 μL) van de verwarmde 3% in het midden van de microscoopdia.
- Bedek onmiddellijk de microscoopplaat met een lege microscoopplaat loodrecht op de eerste dia, zodat de bovenste schuif op de laboratoriumtape op de aangrenzende dia's rust. Dit verspreidt de druppel agarose om een pad van uniforme breedte te creëren.
- Verwijder voorzichtig de bovenste dia.
- Immobiliseer de wormen met behulp van een pipet van 200 μL om een kleine druppel (~5 μL) van 1 mM levamisole in M9-buffer toe te voegen aan het midden van het agarosepad. Breng vervolgens 10 wormen in de druppel levamisole met behulp van een platina draad pick. Dek af met een coverslip. Het afdichten van de coverslip is niet nodig voor een rechtopstaande microscoop. Optioneel kunnen de wormen worden uitgelijnd wanneer ze verlamd raken door de levamisole uit te spreiden, naar de buitenkant van het agarosepad en de wormen uit te lijnen met een platina draadpluk. Als alternatief kan de levamisole worden opgeslokt met behulp van een laboratoriumdoek.
OPMERKING: Beeld zo snel mogelijk, omdat langdurige incubatie in levamisole de fluorescentie kan veranderen. - Beeld de wormen met behulp van een fluorescentie microscoop. De details van beeldopname variëren per microscoop en software.
OPMERKING: Als u beeldintensiteiten rechtstreeks wilt vergelijken, gebruikt u identieke microscoopinstellingen in één beeldsessie. Vermijd oversaturatie van het beeld.
3. Meting van HSR-genexpressie met RT-qPCR
- Synchroniseer wormen (punt 1.2) en houd op 20 °C tot de gewenste ontwikkelingsfase. Voor N2-wormen worden jonge volwassen wormen die nog niet reproductieve rijpheid hebben bereikt, 60 uur na de synchronisatie van het leggen van eieren gegenereerd.
OPMERKING: De ontwikkelingstiming varieert per stam en de temperatuur waarbij de wormen worden verhoogd. Belangrijk is dat de omvang van HSR-inductie ongeveer 2-4x daalt na het begin van de reproductieve rijpheid (zie Discussie). - Hitteschokwormen zoals beschreven in stap 2.2.
- Haal de platen uit het waterbad, verwijder de paraffinefilm en verzamel onmiddellijk de wormen. De wormen kunnen worden verzameld door het wassen van de platen voorzichtig met 1 mL M9, het verzamelen van de vloeistof in een microcentrifuge buis, en vervolgens het verwijderen van de M9 na centrifugatie op 400 x g gedurende 1 min.
- Lyse de wormen en zuiveren van de RNA met behulp van organische extractie.
- Voeg 250 μL RNA isolatiereagens toe (zie Tabel met materialen).
- Vortex buizen met de hand voor 30 s.
- Vortex buizen gedurende 20 min bij 4 °C met behulp van een microcentrifuge buis bevestiging (zie Tabel van materialen).
- Voeg 50 μL chloroform toe.
- Vortex voor 30 s.
- Incubeer de monsters op RT voor 3 min.
- Centrifuge bij ≥14.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
- Breng de waterige laag (d.w.z. toplaag, ~125 μL) over naar een nieuwe microcentrifugebuis.
OPMERKING: Vermijd de organische laag en het materiaal in de interface. - Voeg 50 μL chloroform toe.
- Vortex voor 30 s.
- Incubeer de monsters op RT voor 3 min.
- Centrifuge bij ≥14.000 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
- Breng de waterige laag (~100 μL) over naar een nieuwe microcentrifugebuis.
OPMERKING: Vermijd de organische laag en het materiaal in de interface. - NeerslagRNA met een gelijk volume (d.w.z. 100 μL) isopropanol.
- Incubeer bij -20 °C gedurende ten minste 30 minuten, maar bij voorkeur 's nachts.
LET OP: Het experiment kan hier worden onderbroken en het RNA kan worden opgeslagen bij -20 °C. - Pellet het RNA door centrifugatie bij ≥14.000 x g gedurende ≥30 min bij 4 °C.
- Verwijder zoveel mogelijk van de supernatant mogelijk zonder verstoring van de pellet.
LET OP: De pellet is klein en mogelijk niet zichtbaar. De pellet kan niet strak hechten aan de zijkant van de buis, dus voorzichtigheid is noodzakelijk om te voorkomen dat los te maken. - Was de pellet met 250 μL 70% ijskoude ethanol gemaakt met RNase-vrije H2O.
- Centrifuge bij ≥14.000 x g gedurende ≥5 min bij 4 °C.
- Verwijder zoveel mogelijk supernatant zonder de pellet te storen.
- Voer een snelle spin uit bij RT om de resterende 70% ethanol te verwijderen.
- Droog de pellet door het verlaten van de buizen open op RT zo lang als nodig is; meestal ten minste 20 min. Buizen kunnen worden bedekt met een pluisvrij weefsel of aluminiumfolie om besmetting te voorkomen.
- Resuspend de pellet in 20 μL van RNase-vrij H2O.
- Bepaal de RNA-concentratie met behulp van een kleine volumespectrometer (2 μL).
LET OP: Het experiment kan hier worden onderbroken en het RNA kan tijdelijk worden opgeslagen op of onder -20 °C.
- Verwijder rest-DNA door uit te broeden met DNase I. Het wordt aanbevolen om een commercieel verkrijgbaar pakket (zie Tabel van materialen)te gebruiken en de instructies van de fabrikant op te volgen.
- Bereid met deze kit een 20 μL-reactie met 500 ng RNA en 1 μL DNase I voor in een waterbad van 37 °C gedurende 30 minuten.
- Voeg 2,5 μL DNase inactivatie reagens (inbegrepen in de kit) toe aan elk monster en broed gedurende 5 minuten in RT met af en toe vegen/vortexen.
- Spin naar beneden op 14.000 x g gedurende 2 minuten.
- Zonder de witte pellet te storen, breng je 15 μL supernatant over naar een verse microbuis voor cDNA-synthese.
- Voer cDNA synthese uit. Het wordt aanbevolen om een commercieel verkrijgbaar pakket (zie Tabel van materialen)te gebruiken en de instructies van de fabrikant op te volgen.
- Bereid met de kit een 20 μL-reactie met 15 μL DNase I-behandeld RNA uit de vorige stap en 1 μL omgekeerde transcriptase voor.
- Gebruik het volgende programma voor cDNA synthese: 25 °C voor 5 min, 46 °C voor 20 min, 95 °C voor 1 min, 4 °C hold.
- Verdun cDNA door 80 μL RNase-vrije H2O direct aan het monster toe te voegen.
- Kort vortex, dan spin naar beneden en op te slaan op -20 °C totdat dat nodig is.
- Voer qPCR uit. Het wordt aanbevolen om een commercieel verkrijgbaar pakket (zie Tabel van materialen)te gebruiken en de instructies van de fabrikant op te volgen.
- Bereid met de kit een 25 μL-reactie voor met 2 μL cDNA en 200 nM (elk) voorwaartse en omgekeerde primers in één put van een 96-putplaat.
- Primersequenties voor het meten van de warmteschokgenen, hsp-70 en hsp-16.2, en 18S rRNA (voor een normalisatiecontrole) zijn opgenomen in de tabel van materialen. Meerdere normalisatiebesturingselementen kunnen naar wens worden gebruikt.
- Verdun cDNA-monsters 50x voor de meting van 18S om ervoor te zorgen dat de test zich in het lineaire bereik bevindt. De juiste qPCR-voorwaarden variëren afhankelijk van de gebruikte kit en primers (zie Representatieve resultaten).
- Gebruik een real-time PCR-detectiesysteem (zie tabel met materialen)voor qPCR met 40 cycli van 95 °C voor 5 s denaturatie, 58 °C voor 30 s annealing en 72 °C voor 30 s extensie.
LET OP: Optimale temperaturen kunnen variëren per primers en omstandigheden. - Kwantificeren met behulp van de ΔΔCt of standaardcurve methode12.
4. Thermorecovery-test voor het meten van HSR op organismaniveau
- Synchroniseer de wormen (punt 1.2) en houd op 20 °C tot de gewenste ontwikkelingsfase. Voor N2-wormen worden jonge volwassen wormen die nog niet reproductieve rijpheid hebben bereikt, 60 uur na de synchronisatie van het leggen van eieren gegenereerd.
OPMERKING: De ontwikkelingstiming varieert per stam en de temperatuur waarbij de wormen worden verhoogd. Belangrijk is dat de omvang van HSR-inductie ongeveer 2-4x daalt na het begin van de reproductieve rijpheid (zie Discussie). - Hitte schok de wormen zoals beschreven in stap 2.2 voor 6 uur.
- Haal de platen uit het waterbad, verwijder de paraffinefilm en laat de wormen 48 uur bij incubatie bij 20 °C herstellen.
- Tel het aantal wormen dat onmiddellijk weg kan kruipen na mechanische stimulatie zonder schokkerige beweging of verlamming.
OPMERKING: De 6 uur incubatie is optimaal voor het onderzoeken van omstandigheden die thermorecovery verminderen, maar langere blootstellingstijden kunnen nodig zijn om te zoeken naar omstandigheden die de thermorecovery verbeteren.
Representative Results
Met behulp van de protocollen beschreven in dit manuscript, HSR inductie werd gemeten met behulp van fluorescerende verslaggevers, RT-qPCR, en thermorecovery testen. In elk geval werd de procedure in punt 1.2 gebruikt om gesynchroniseerde, jongvolwassen wormen te genereren die geen voortplantingsrijpheid hadden bereikt.
Om HSR-inductie op cellulair niveau te visualiseren, werden de AM446(hsp-70p::gfp)en CL2070(hsp-16.2p::gfp) fluorescerende reporterstammen geanalyseerd volgens sectie 2 van het protocol. In de negatieve controle monsters zonder hitteschok, de hsp-16.2 verslaggever toonde alleen normale autofluorescentie, maar de hsp-70 verslaggever had constitutieve fluorescentie in de anale depressor spier zoals eerder gemeld4 (Figuur 1A). Na 1 uur hitteshock bij 33 °C werd bij beide verslaggevers een robuuste fluorescentie waargenomen; het uitdrukkingspatroon was echter duidelijk, afhankelijk van welke verslaggever werd gebruikt(figuur 1B). De hsp-70 verslaggever was het helderst in de darm en spermatheca, terwijl de hsp-16.2 verslaggever het helderst was in de keelholte. Bovendien, de hsp-16.2 verslaggever had een hoge mate van worm-tot-worm variabiliteit in de hoeveelheid inductie zoals eerder beschreven, maar de hsp-70 verslaggever niet13.
Een veelgebruikte variatie van sectie 2 is het uitvoeren van de hitteschok in een droge couveuse in plaats van een circulerend waterbad. Daarom werd ook het verschil tussen de twee methoden getest. Het bleek dat beide protocollen resulteerden in een robuuste inductie van de twee tl-verslaggevers met behulp van onze voorwaarden, hoewel een circulerend waterbad wordt aanbevolen als een beste praktijk (zie Discussie) (Figuur 1B).
Om de afhankelijkheid van de verslaggevers op de transcriptiefactor HSF-1 te testen, werd het voeden RNAi gebruikt om hsf-1 knockdown alvorens de verslaggeverinductie werd gemeten. Het bleek dat fluorescentie van beide stammen ernstig werd verminderd op HSF-1 knockdown, wat aangeeft dat deze verslaggevers zijn HSF-1-afhankelijk zoals beschreven in de literatuur4 (Figuur 2). Echter, het werd ook opgemerkt dat faryngeale fluorescentie bleef bestaan in beide verslaggevers op hsf-1 knockdown, die in overeenstemming is met eerdere rapporten dat de faryngeale spier resistent is tegen RNAi door het voedenvan 14.
Om de gehele worminductie van de HSR op moleculair niveau te kwantificeren, werden twee endogene HSP's gemeten met RT-qPCR met behulp van sectie 3 van het protocol. Monsters werden gemeten in drievoud, een standaardcurve werd gegenereerd voor elk van de primers, en een smeltcurve werd geanalyseerd voor elk monster voor kwaliteitscontrole. Het bleek dat een 33 °C hitteschok voor 1 uur resulteerde in meer dan een toename van 2.000x in relatieve expressie voor twee hitteshockgenen, hsp-70 en hsp-16.2 (figuur 3). Deze resultaten tonen aan dat beide endogene genen geschikt zijn voor het meten van HSR-inductie en dat een 33 °C-warmteschok voor 1 h voldoende is om een substantiële respons te genereren. Voorzichtigheid moet echter worden gebruikt bij het interpreteren van de absolute mate van warmteschokinductie, omdat de mRNA-niveaus bij afwezigheid van een hitteschok zeer laag zijn.
Om een fysiologische reactie op hitteschok te analyseren, werd een organisale thermorecovery test getest met behulp van sectie 4 van het protocol. Er werd vastgesteld dat blootstelling van wormen aan een 6 uur warmteschok bij 33 °C leidde tot een daling van 20% van wormen met een normale beweging na een 48 uur herstel (figuur 4A). De afhankelijkheid van deze test op de HSF-1 transcriptie factor werd getest met behulp van voeding RNAi knockdown hsf-1 voor het blootstellen van wormen aan de stress. Het bleek dat knockdown van hsf-1 een dramatische afname van de normale beweging veroorzaakte, met >95% van de wormen die schokkerige beweging of verlamming vertonen nadat ze waren geprikt met een platina draadpluk.
We vergeleken deze thermorecovery-test met een veelgebruikte alternatieve organismale test die gewoonlijk aangeduid wordt als thermotolerance. In de thermotolerancetest worden wormen blootgesteld aan een continue temperatuur van 35 °C met behulp van een droge incubator, en het percentage wormen dat in leven is, wordt op verschillende tijdpunten gemeten. Met behulp van deze test bleek dat controlewormen die voortdurend aan 35 °C werden blootgesteld, stierven na ongeveer 8 uur blootstelling (figuur 4B). Echter, toen de afhankelijkheid van deze test op HSF-1 werd getest met behulp van RNAi knockdown, bleek dat remming van hsf-1 niet een afname van de thermotolerantie veroorzaakt. Vergelijkbare resultaten zijn eerder getoond met behulp van HSF-1 mutaties (zie Discussie). Daarom wordt het gebruik van de thermotolerancetest om de HSR te meten niet aanbevolen en thermorecovery is de voorkeursmethode voor het onderzoeken van de HSR op organismaniveau.
Figuur 1: HSR inductie gemeten met tl-verslaggevers. (A) De basale en (B) warmte-inducible expressie van hsp-70p:::gfp en hsp-16.2p:gfp reporter stammen na 1 uur van de hitteschok bij 33 °C in een waterbad of incubator. Wormen werden verhoogd op OP50 bacteriën voor 64 uur, warmte geschokt, en vervolgens hersteld op 20 °C voor 8 uur voor beeldvorming. Ter referentie, de geen warmte-shock wormen in (A) werden gehernormaliseerd in (B) aan het bereik en de verzadiging van de hitte-geschokt wormen wedstrijd. Representatieve afbeeldingen van twee experimentele replica's worden getoond. Schaalbalk = 250 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: HSR inductie gemeten met tl-verslaggevers is afhankelijk van HSF-1. Stammen met de hsp-70p::gfp en hsp-16.2p::gfp verslaggevers werden verhoogd op controle (L4440 lege vector) of hsf-1 RNAi platen voor 64 uur, blootgesteld aan een 1 h warmte schok bij 33 °C in een waterbad, en vervolgens hersteld op 20 °C voor 8 uur voor beeldvorming. Representatieve afbeeldingen van twee experimentele replica's worden getoond. Schaalbalk = 250 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: HSR-inductie gemeten met RT-qPCR. N2 wormen werden verhoogd op HT115 bacteriën voor 60 uur en vervolgens warmte geschokt voor 1 uur in een 33 °C waterbad. De relatieve mRNA-niveaus van hsp-70 (C12C8.1) en hsp-16.2 worden genormaliseerd weergegeven aan de no heat-shock control. In uitgezet waarden zijn het gemiddelde van vier biologische replicaties en foutbalken vertegenwoordigen ± SEM. Statistische significantie werd berekend met behulp van de t-test van een niet-gepaarde student. **p < 0,01. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Thermorecovery, maar niet thermotolerance, is afhankelijk van HSF-1. N2 wormen werden verhoogd op controle (L4440) of hsf-1 RNAi platen voor 60 uur en vervolgens verschoven naar: (A) A 33 °C waterbad voor 6 uur en hersteld bij 20 °C voor 48 uur alvorens te scoren voor normale beweging (thermorecovery), of (B) A 35 °C droge incubator en verwijderd om de 2 uur tot dood (thermotolerance). Elke test werd gedaan met n ≥ 30 individuen op 2 onafhankelijke dagen. Het gemiddelde wordt weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
In de literatuur een breed scala van temperaturen, tijden en apparatuur zijn gebruikt om te testen van de HSR, die onnodige kanttekeningen heeft geïntroduceerd en heeft geleid tot moeilijkheden bij het vergelijken van resultaten tussen laboratoria. Zo zijn temperaturen variërend van 32-37 °C en tijden van 15 min tot enkele uren gebruikt om de HSR15te induceren. Er wordt echter gemeld dat letaliteit al vanaf 37 °C voorkomt bij 37 °C voor alle stadia en 1,5 uur voor dag 1 volwassenen15. Bovendien tonen we aan dat blootstelling van wormen tot 35 °C dodelijkheid veroorzaakt die niet afhankelijk is van HSF-1, waardoor deze omstandigheden slecht geschikt zijn voor analyse van de HSR. Daarentegen is een hitteschok van 33 °C voor 1 h robuust genoeg om sterke inductie van hitteschokgenen uit te lokken, maar mild genoeg om de levensvatbaarheid van wormen niet te beïnvloeden. Blootstelling aan 33 °C gedurende 6 uur zorgt er namelijk voor dat 20% van de wormen abnormale bewegingen vertoont. Daarom stellen we voor om een temperatuur van 33 °C en een tijd van 1 uur te gebruiken als een gestandaardiseerde voorwaarde voor RT-qPCR en fluorescerende reportertesten.
Recente experimenten hebben aangetoond dat ontwikkelingssfasering van wormen voor HSR-experimenten bijzonder belangrijk is. Onlangs werd aangetoond dat in C. elegans de inductie van de HSR afneemt (d.w.z. instort) met >50% wanneer hermafrodieten beginnen met het leggen vaneieren 5. Enscenering van de wormen correct is van cruciaal belang omdat er vaak verschillen in ontwikkelingstiming in stammen die mutaties. Als temperatuurgevoelige mutanten worden gebruikt, zal dit ook gevolgen hebben voor de resultaten als ze niet worden gesynchroniseerd door hun reproductieve leeftijd. Daarom wordt aanbevolen om het begin van het leggen van eieren voor elke stam zorgvuldig te meten om te bepalen wanneer de instorting plaatsvindt. Het venster van de tijd na de L4 molt en vóór de aanvang van de reproductieve rijpheid is smal; daarom moet ervoor worden gezorgd dat de HSR-ineenstorting niet per ongeluk variabiliteit in de resultaten veroorzaakt.
Naast de ontwikkelingstiming kunnen verrassend kleine temperatuurwisselingen, zo weinig als 1 °C, aanzienlijke gevolgen hebben voor de HSR. Thermosensorische neuronen in C. elegans zijn bijvoorbeeld gevoelig voor temperatuurveranderingen zo klein als ±0,05 °C16. Het is dus noodzakelijk om een thermometer te gebruiken die de temperatuur nauwkeurig kan meten. Daarom stellen wij als beste praktijk het gebruik van een gekalibreerd apparaat voor temperatuurmeting voor dat nauwkeurig genoeg is om temperaturen binnen ±0.1 °C te meten. Bovendien moet een thermometer met een datalogboekingsfunctionaliteit worden gebruikt om temperatuurschommelingen in de tijd te meten. Veel incubators zijn gespecificeerd om thermische variaties van meer dan 1 °C in verschillende delen van de incubator en in de tijd, die aanzienlijke effecten op HSR experimenten kan hebben. Als beste praktijk raden we aan om couveuses te gebruiken die voldoende isolatie en circulatie hebben om temperatuurschommelingen te minimaliseren. Voor het uitvoeren van hitteshock experimenten, stellen we een beste praktijk van een circulerend water bad. De tijd die nodig is voor een agar plaat om een gewenste temperatuur te bereiken is ongeveer 6-7 min in een waterbad, maar veel langer in een droge incubator15,17. Als er echter geen circulerend waterbad beschikbaar is, hebben we aangetoond dat robuuste HSR-inductie ook voorkomt in een droge couveuse met behulp van onze omstandigheden. Als een droge couveuse wordt gebruikt, moet de opening van de couveuse voor de duur van de stress worden geminimaliseerd.
Het is algemeen vastgesteld dat inductie van warmteschokgenen afhankelijk is van de hoofdregelaar van de HSR, HSF-1. Hier presenteren we bewijs dat de twee meer indirecte testen, fluorescerende verslaggevers en thermorecovery, zijn ook afhankelijk van HSF-1. Opvallend is dat een veelgebruikte alternatieve organismale test, thermotolerance, niet HSF-1 afhankelijk is met behulp van hsf-1 RNAi (figuur 4). Vergelijkbare resultaten zijn eerder gerapporteerd met behulp van een hsf-1 mutant of een ttx-3 mutant, die de HSR18,19,20blokkeert . Samen geven deze resultaten aan dat de thermotolerancetest niet mag worden gebruikt voor HSR-onderzoek. Bovendien suggereert dit dat een beste praktijk is om de HSF-1 afhankelijkheid te testen op elke test die wordt gebruikt om de HSR te meten.
Samen presenteren we een reeks gestandaardiseerde protocollen en best practices voor robuuste en reproduceerbare meting van HSR-inductie in C. elegans. We hopen dat deze methoden de variabiliteit in HSR-experimenten zullen verminderen en de reproduceerbaarheid zullen vergroten. Het vergemakkelijken van directe vergelijkingen van HSR-onderzoek tussen laboratoria zal dienen om onderzoek op het gebied van HSR te versnellen. Bovendien zal standaardisatie ten goede komen aan onderzoek naar veroudering en neurodegeneratieve ziekten waarmee de HSR nauw verbonden is.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een donatie van Frank Leslie. Sommige stammen werden geleverd door de CGC, die wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18S-forward primer | TTGCGTCAACTGTGGTCGTG | ||
| 18S-reverse primer | CCAACAAAAAGAACCGAAGT CCTG |
||
| AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))] | Morimoto lab | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/ | |
| C12C8.1-forward primer | GTACTACGTACTCATGTGTCG GTATTT |
||
| C12C8.1-reverse primer | ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC | ||
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | Bio Rad | 1855200 | |
| CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
| EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD | Lascar | EL-USB-TP-LCD | |
| Greenough Stereo Microscope S9i Series | Leica | ||
| Hard Shell 96 Well PCR Plates | Bio Rad | HSS9601 | |
| hsp-16.2-forward primer | ACTTTACCACTATTTCCGTCC AGC |
||
| hsp-16.2-reverse primer | CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG | ||
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio Rad | 1708891 | |
| iTaq Universal Sybr Green Super Mix | Bio Rad | 1725121 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | Eclipse 90i | |
| MultiGene OptiMax Thermo Cycler | Labnet | TC9610 | |
| N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | https://cgc.umn.edu/ | |
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE | |
| Parafilm M Roll | Bemis | 5259-04LC | |
| RapidOut DNA Removal Kit | Thermo Scientific | K2981 | |
| Recirculating Heated Water Bath | Lauda Brinkmann | RE-206 | |
| Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer | Fisher Scientific | 15-081-103 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | RNA isolation reagent |
| TurboMix Attachment | Scientific Industries | SI-0564 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 |
References
- Guisbert, E., Morimoto, R. I. The regulation and function of the heat shock response. Protein Quality Control in Neurodegenerative Diseases. , 1-18 (2013).
- Li, J., Chauve, L., Phelps, G., Brielmann, R. M., Morimoto, R. I. E2F coregulates an essential HSF developmental program that is distinct from the heat-shock response. Genes and Development. 30 (18), 2062-2075 (2016).
- Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
- Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
- Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235 (1999).
- Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a Tissue-Selective Heat Shock Response Regulatory Network. PLoS Genetics. 9 (4), 1-12 (2013).
- Ma, J., et al. Cellular Proteomes Drive Tissue-Specific Regulation of the Heat Shock Response. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (3), 1011-1018 (2017).
- Mendenhall, A. R., et al. Expression of a single-copy hsp-16.2 reporter predicts life span. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (7), 726-733 (2012).
- Stiernagle, T.
- Avery, L., You, Y. J.
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Shiu, P. K., Hunter, C. P. Early Developmental Exposure to dsRNA Is Critical for Initiating Efficient Nuclear RNAi in C. elegans. Cell Reports. 18 (12), 2969-2978 (2017).
- Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), 450-457 (2014).
- Clark, D. A., Biron, D., Sengupta, P., Samuel, A. D. T. The AFD sensory neurons encode multiple functions underlying thermotactic behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 26 (28), 7444-7451 (2006).
- Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
- McColl, G., et al. Insulin-like signaling determines survival during stress via posttranscriptional mechanisms in C. elegans. Cell Metabolism. 12 (3), 260-272 (2010).
- Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
