Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Standardiserte metoder for måling av induksjon av varmesjokkresponsen i caenorhabditis elegans

Published: July 3, 2020 doi: 10.3791/61030
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical and Chemical Engineering and Sciences, Florida Institute of Technology

Summary

Her presenteres standardiserte protokoller for å vurdere induksjon av varmesjokkresponsen (HSR) i caenorhabditis elegans ved hjelp av RT-qPCR på molekylært nivå, fluorescerende reportere på cellenivå og thermorecovery på organismenivå.

Abstract

Varmesjokkresponsen (HSR) er en cellulær stressrespons indusert av cytosolisk protein som fungerer for å gjenopprette proteinfolding homeostase eller proteostase. Caenorhabditis elegans opptar en unik og kraftig nisje for HSR forskning fordi HSR kan vurderes på molekylære, cellulære, og organismenivåer. Derfor kan endringer på molekylært nivå visualiseres på cellenivå, og deres virkninger på fysiologi kan kvantiseres på organismenivå. Mens analyser for måling av HSR er enkle, gjør variasjoner i timing, temperatur og metodikk som er beskrevet i litteraturen det utfordrende å sammenligne resultater på tvers av studier. Videre fungerer disse problemene som en barriere for alle som ønsker å innlemme HSR-analyse i sin forskning. Her presenteres en rekke protokoller for måling av induksjon av HSR på en robust og reproduserbar måte med RT-qPCR, fluorescerende journalister og en organismetetemercovery analyse. I tillegg viser vi at en mye brukt termotoleransanalyse ikke er avhengig av den veletablerte masterregulatoren til HSR, HSF-1, og bør derfor ikke brukes til HSR-forskning. Til slutt, variasjoner i disse analysene funnet i litteraturen er diskutert og beste praksis er foreslått for å bidra til å standardisere resultater over hele feltet, til slutt legge til rette nevrodegenerativ sykdom, aldring, og HSR forskning.

Introduction

Varmesjokkresponsen (HSR) er en universell cellulær stressrespons forårsaket av cytosolisk proteinfeilfolding forårsaket av temperaturøkninger og andre protetotoksiske påkjenninger. Aktivering av HSR i Caenorhabditis elegans fører til transkripsjonell upregulering av varmesjokkgener som hsp-70 og hsp-16.2. Mange varmesjokkproteiner (HSPs) fungerer som molekylære chaperoner som gjenoppretter proteinfolding homeostase, eller proteostase, ved å samhandle direkte med feilfoldede eller skadede proteiner. Hovedregulatoren til HSR er transkripsjonsfaktoren Heat Shock Factor 1 (HSF-1), hvis aktivering er elegant kontrollert via flere mekanismer1.

Rollen til HSF-1 er ikke begrenset til stress. HSF-1 er nødvendig for normal vekst og utvikling, som sletting av hsf-1 fører til larval arrest2. HSF-1 er også viktig under aldring og aldersrelaterte nevrodegenerative sykdommer preget av akkumulering av proteinaggregater og manglende evne til å opprettholde proteostase. Knockdown av hsf-1 forårsaker akkumulering av proteinaggregater og en forkortet levetid, mens overuttrykk av hsf-1 reduserer proteinaggregasjon og forlengerlevetiden 3,4. Regulering av HSF-1 på molekylært nivå har derfor brede implikasjoner for organismefysiologi og sykdom.

C. elegans er en kraftig modell organisme for HSR forskning fordi HSR kan måles på molekylære, cellulære, og organismenivåer4,5,6. Fremhever kraften i denne modellen, viktige fremskritt i å avgrense HSR-banen, for eksempel vevsspesifikke forskjeller i HSR-regulering, har blitt oppdaget i C. elegans7,8. Videre er C. elegans mye brukt til aldring forskning og er et voksende system for modellering sykdommer knyttet til proteostase avbrudd.

Selv om varmesjokkeksperimenter med C. elegans kan være raske og reproduserbare, er det flere spørsmål å vurdere før du begynner. For eksempel hvilken temperatur bør brukes til induksjon av HSR og hvor lenge skal ormene bli utsatt? Er det bedre å bruke en tørr inkubator eller et vannbad? Hvilket utviklingsstadium bør brukes? Dessverre varierer metodene som brukes til å undersøke HSR mye fra laboratorium til laboratorium, noe som forårsaker forvirring når du velger de beste metodene og gjør det vanskelig å sammenligne resultater på tvers av feltet.

Vi presenterer robuste og standardiserte protokoller for bruk av RT-qPCR, fluorescerende reportere og thermorecovery for å måle HSR. Mens disse tre tilnærmingene er komplementære, har de hver unike fordeler og ulemper. For eksempel er RT-qPCR den mest direkte og kvantitative målingen av HSR, og denne analysen kan enkelt utvides til å omfatte mange forskjellige varmesjokkfremkallende gener. RT-qPCR er imidlertid den dyreste, kan teknisk sett være vanskelig, og krever bruk av spesialisert utstyr. I motsetning har fluorescerende journalister fordelen av å måle vevsspesifikke forskjeller i HSR-induksjon. De er imidlertid vanskelige å kvantumate nøyaktig, kan bare måle induksjon over en viss terskel, og krever bruk av et fluorescensmikroskop. I tillegg er reporterstammene som er beskrevet her, utviklingsmessig forsinket i forhold til standard N2-belastning. Selv om nyere reporter stammer som inneholder single-copy transgenes er tilgjengelige, har de ikke blitt testet her9. Den tredje analysen, thermorecovery, har fordelen av å gi en fysiologisk relevant avlesning på organismenivå. Denne analysen er imidlertid uten tvil den minst følsomme og mest indirekte. Til slutt diskuterer vi noen vanlige variasjoner som finnes i disse analysene og foreslår et sett med beste praksis for å lette forskningen på dette feltet.

Protocol

1. Vedlikehold og synkronisering av C. elegans

  1. Opprettholde ormer ved 20 °C på Nematode Growth Medium (NGM) plater seeded med OP50 Escherichia coli bakterier ved å overføre flere voksne til ferske plater ca 2x per uke10. Det bør utvises forsiktighet for å hindre at ormer går tom for mat, fordi dette kan påvirke deres fysiologi11.
    1. Tilberedning av NGM-plater.
      1. Bland 3 g NaCl, 2,5 g Bacto-pepton, 20 g agar og deionisert (DI) H2O opptil 1 L i en kolbe.
      2. Autoklaver blandingen for sterilisering.
      3. La blandingen avkjøles til ~50 °C.
      4. Tilsett 25 ml 1 M KH2PO4 (pH = 6), 1 ml 1 M CaCl2,1 ml 1 M MgSO4og 1 ml kolesterol (5 mg/ml i 100 % etanol).
      5. Bruk steril teknikk til å helle blandingen i 6 cm plater for å gi ca. 100 plater. Helle plater er lettere hvis blandingen først overføres til en 300 ml steril beger.
      6. La 1 dag stivne ved romtemperatur (RT) før seeding med bakterier eller lagring ved 4 °C.
    2. Seeding av OP50 bakterier på NGM plater.
      1. Vokse en mettet over natten OP50 bakteriell kultur i LB ved 30 ° C eller 37 ° C.
      2. Plasser ca 300 μL av kulturen på midten av en 6 cm NGM plate.
      3. La platene tørke ved RT i 1-3 dager etter behov for at bakterieplenen holder seg til platen. Plater kan deretter brukes eller oppbevares ved 4 °C.
  2. Dyrke ormene synkront enten ved å isolere nylagte egg (beskrevet her) eller alternativt ved å samle egg etter oppløsning ormer med blekemiddel.
    1. Overfør ca 10 gravid voksen ormer til en frisk plate ved hjelp av en platina wire plukke. Egg-lay synkronisering fungerer best hvis de voksne er i den første dagen i voksen alder.
    2. Etter ca. 1 time, fjern ormene fra platen. Dette bør resultere i 40-60 egg per tallerken, avhengig av forholdene og belastningen.

2. Fluorescerende avbildning av HSR-reportere

  1. Synkroniser ormene (pkt. 1.2) og vedlikehold ved 20 °C til ønsket utviklingsstadium. For AM446 (hsp-70p::gfp) og CL2070 (hsp-16.2p::gfp) fluorescerende reporter stammer, unge voksne ormer som ennå ikke har nådd reproduktiv modenhet genereres 64 timer etter egg-legging synkronisering.
    MERK: Utviklingstidspunktet varierer med hver belastning og temperaturen der ormene heves. Begge HSR-reporterstammene viser en liten utviklingsforsinkelse i forhold til N2. Viktigere, omfanget av HSR induksjon avtar ca 2-4x etter utbruddet av reproduktiv modenhet (se Diskusjon).
  2. Varmesjokk ormene ved å pakke plater med parafinfilm og nedsenke i et sirkulerende vannbad ved 33 °C i 1 time. En tynn stripe av parafinfilm skal pakkes 2x rundt platen for å forsegle kantene. Ikke dekk til bunnen av platen, eller det kan forstyrre varmeoverføringen. Senk platene opp ned med et reagensrørstativ og en blyvekt. Husk å ta med en negativ kontrollprøve (ingen varmesjokk) om nødvendig.
    MERK: Hvis parafinfilmen ikke er sikker, vil vann komme inn i platen, og platen skal ikke brukes til datainnsamling.
  3. Gjenopprett ormene ved å fjerne platene fra vannbadet og tørking med et papirhåndkle. Fjern parafinfilmen og inkuber ormene ved 20 °C i 6-24 timer. Denne gjenopprettingsperioden gir tilstrekkelig tid til GFP-syntese og folding før avbildning.
  4. Klargjør lysbilder for bildebehandling. Lysbilder skal tilberedes friskt for hver bruk.
    1. Lag en 3% agarose løsning i vann og varme ved hjelp av en mikrobølgeovn til agarose er oppløst.
    2. Plasser et mikroskop lysbilde for avbildning mellom to andre mikroskop lysbilder som har en stripe av laboratorietape på dem for å skape en avstandsstykke for agarose pad.
    3. Bruk en pipette på 1000 μL, plasser en dråpe (~ 150 μL) av den oppvarmede 3% agarose i midten av mikroskopet lysbildet.
    4. Dekk umiddelbart mikroskopet med et tomt mikroskop lysbilde vinkelrett på det første lysbildet slik at det øverste lysbildet hviler på laboratoriebåndet på de tilstøtende lysbildene. Dette sprer ut dråpen av agarose for å skape en pute av ensartet bredde.
    5. Fjern forsiktig det øverste lysbildet.
  5. Immobiliser ormene ved hjelp av en 200 μL pipette for å legge til en liten dråpe (~ 5 μL) på 1 mM levamisole i M9-bufferen til midten av agarose-puten. Overfør deretter 10 ormer til dråpe levamisole ved hjelp av en platinatrådplukking. Dekk med en coverslip. Tetting av dekkslippen er ikke nødvendig for et oppreist mikroskop. Eventuelt kan ormene justeres når de blir lammet ved å spre levamisole av, til utsiden av agarose-puten og justere ormene med en platinatrådplukking. Alternativt kan levamisoleen bli gjennomvåt ved hjelp av en laboratorieserviett.
    MERK: Bildet så snart som mulig, fordi langvarig inkubasjon i levamisole kan endre fluorescens.
  6. Bilde ormene ved hjelp av et fluorescensmikroskop. Detaljene for bildeopptak varierer etter mikroskop og programvare.
    MERK: Hvis du vil sammenligne bildeintensiteter direkte, bruker du identiske mikroskopinnstillinger i én bildeøkt. Unngå å oversløre bildet.

3. Måling av HSR-genuttrykk ved hjelp av RT-qPCR

  1. Synkroniser ormer (pkt. 1.2) og vedlikehold ved 20 °C til ønsket utviklingsstadium. For N2 ormer genereres unge voksne ormer som ennå ikke har nådd reproduktiv modenhet 60 timer etter eggleggingssynkroniseringen.
    MERK: Utviklingstidspunktet varierer med hver belastning og temperaturen der ormene heves. Viktigere, omfanget av HSR induksjon avtar ca 2-4x etter utbruddet av reproduktiv modenhet (se Diskusjon).
  2. Varmesjokkormer som beskrevet i trinn 2.2.
  3. Ta platene ut av vannbadet, fjern parafinfilmen, og samle umiddelbart ormene. Ormene kan samles ved å vaske platene forsiktig med 1 ml M9, samle væsken i et mikrosytrifuvør, og deretter fjerne M9 etter sentrifugering ved 400 x g i 1 min.
  4. Lyse ormene og rense RNA ved hjelp av organisk ekstraksjon.
    1. Tilsett 250 μL RNA isolasjonsreansag (se Tabell over materialer).
    2. Vortex rør for hånd i 30 s.
    3. Vortex rør i 20 min ved 4 °C ved hjelp avet mikrosytrifusrør (se tabell over materialer ).
    4. Tilsett 50 μL kloroform.
    5. Vortex for 30 s.
    6. Inkuber prøvene ved RT i 3 min.
    7. Sentrifuge ved ≥14 000 x g i 15 min ved 4 °C.
    8. Overfør det vandige laget (dvs. topplag, ~125 μL) til et nytt mikrosytrifusrør.
      MERK: Unngå det organiske laget og materialet i grensesnittet.
    9. Tilsett 50 μL kloroform.
    10. Vortex for 30 s.
    11. Inkuber prøvene ved RT i 3 min.
    12. Sentrifuge ved ≥14 000 x g i 5 min ved 4 °C.
    13. Overfør det vandige laget (~ 100 μL) til et nytt mikrocentrifugerør.
      MERK: Unngå det organiske laget og materialet i grensesnittet.
    14. Utfell RNA med like volum (dvs. 100 μL) isopropanol.
    15. Inkuber ved -20 °C i minst 30 min, men helst over natten.
      MERK: Eksperimentet kan settes på pause her, og RNA kan oppbevares ved -20 °C.
    16. Pellet RNA ved sentrifugering ved ≥14 000 x g i ≥ 30 min ved 4 °C.
    17. Fjern så mye av supernatanten som mulig uten å forstyrre pelleten.
      MERK: Pelleten vil være liten og er kanskje ikke synlig. Pelleten kan ikke holde seg tett til siden av røret, så forsiktighet er nødvendig for å unngå å løsne den.
    18. Vask pelleten med 250 μL av 70% iskald etanol laget med RNase-fri H2O.
    19. Sentrifuge ved ≥14 000 x g i ≥ 5 min ved 4 °C.
    20. Fjern så mye supernatant som mulig uten å forstyrre pelleten.
    21. Utfør et raskt spinn ved RT for å fjerne eventuelle gjenværende 70% etanol.
    22. Tørk pelleten ved å la rørene åpne ved RT så lenge som nødvendig; vanligvis minst 20 min. Rør kan dekkes med en lofri vev eller aluminiumsfolie for å hindre forurensning.
    23. Resuspend pellet i 20 μL av RNase-fri H2O.
    24. Bestem RNA-konsentrasjonen ved hjelp av et lite volumspektrofotometer (2 μL).
      MERK: Eksperimentet kan settes på pause her, og RNA kan lagres midlertidig ved eller under -20 °C.
  5. Fjern gjenværende DNA ved å inkubere med DNase I. Det anbefales å bruke et kommersielt tilgjengelig sett (se Tabell over materialer) og for å følge produsentens instruksjoner.
    1. Med dette settet, lag en 20 μL reaksjon med 500 ng RNA og 1 μL DNase I i et 37 °C vannbad i 30 min.
    2. Tilsett 2,5 μL DNase inaktiveringsreagens (inkludert i settet) i hver prøve og inkuber ved RT i 5 min med sporadisk flikking/virvlende.
    3. Spinn ned ved 14 000 x g i 2 min.
    4. Uten å forstyrre den hvite pelleten, overfør 15 μL supernatant til et friskt mikrorør for cDNA-syntese.
  6. Utfør cDNA syntese. Det anbefales å bruke et kommersielt tilgjengelig sett (se Tabell over materialer) og for å følge produsentens instruksjoner.
    1. Med settet, lag en 20 μL-reaksjon med 15 μL DNase I-behandlet RNA fra forrige trinn og 1 μL omvendt transkripsjonase.
    2. Bruk følgende program for cDNA syntese: 25 °C i 5 min, 46 °C i 20 min, 95 °C i 1 min, 4 °C hold.
    3. Fortynn cDNA ved å tilsette 80 μL RNase-fri H2O direkte til prøven.
    4. Kort vortex, deretter spinne ned og lagre ved -20 °C til det er nødvendig.
  7. Utfør qPCR. Det anbefales å bruke et kommersielt tilgjengelig sett (se Tabell over materialer) og for å følge produsentens instruksjoner.
    1. Med settet, forberede en 25 μL reaksjon som inneholder 2 μL cDNA og 200 nM (hver) av fremover og revers primere i en brønn av en 96-brønn plate.
    2. Primer sekvenser for måling av varme sjokk gener, hsp-70 og hsp-16.2,og 18S rRNA (for en normalisering kontroll) er oppført i Tabell over materialer. Flere normaliseringskontroller kan brukes etter ønske.
    3. Fortynn cDNA-prøver 50x før måling av 18S for å sikre at analysen er i det lineære området. Passende qPCR-forhold varierer med settet og primere som brukes (se representative resultater).
    4. Bruk et PCR-deteksjonssystem i sanntid (se tabell over materialer) for qPCR med 40 sykluser på 95 °C i 5 s denaturasjon, 58 °C for 30 s annealing og 72 °C for 30 s forlengelse.
      MERK: Optimale glødetemperaturer kan variere etter primere og forhold.
    5. Kvantifiser ved hjelp av ΔΔCt- eller standardkurvemetoden12.

4. Thermorecovery analyse for måling av HSR på organismenivå

  1. Synkroniser ormene (pkt. 1.2) og vedlikehold ved 20 °C til ønsket utviklingsstadium. For N2 ormer genereres unge voksne ormer som ennå ikke har nådd reproduktiv modenhet 60 timer etter eggleggingssynkroniseringen.
    MERK: Utviklingstidspunktet varierer med hver belastning og temperaturen der ormene heves. Viktigere, omfanget av HSR induksjon avtar ca 2-4x etter utbruddet av reproduktiv modenhet (se Diskusjon).
  2. Varmesjokk ormene som beskrevet i trinn 2.2 for 6 timer.
  3. Fjern platene fra vannbadet, fjern parafinfilmen og la ormene komme seg ved inkubasjon ved 20 °C i 48 timer.
  4. Telle antall ormer som umiddelbart kan krype bort etter mekanisk stimulering uten jerky bevegelse eller lammelse.
    MERK: 6 h inkubasjonen er optimal for å undersøke forhold som reduserer det meroppdekking, men lengre eksponeringstid kan være nødvendig for å se etter forhold som forbedrer thermorecovery.

Representative Results

Ved hjelp av protokollene som er beskrevet i dette manuskriptet, ble HSR induksjon målt ved hjelp av fluorescerende reportere, RT-qPCR, og thermorecovery analyser. I hvert tilfelle ble prosedyren i pkt. 1.2 brukt til å generere synkroniserte, unge voksne ormer som ikke hadde nådd reproduktiv modenhet.

For å visualisere HSR induksjon på cellenivå, ble AM446 (hsp-70p::gfp)og CL2070 (hsp-16.2p::gfp) fluorescerende reporter stammer analysert etter avsnitt 2 av protokollen. I de negative kontrollprøvene uten varmesjokk viste hsp-16.2-reporteren bare normal autofluorescens, men hsp-70-reporteren hadde konstituerende fluorescens i analdepressormuskelen som tidligere rapportert4 (Figur 1A). Etter 1 t varmesjokk ved 33 °C ble det observert robust fluorescens hos begge reporterne. Uttrykkets mønster var imidlertid tydelig avhengig av hvilken reporter som ble brukt (Figur 1B). Hsp-70 reporteren var lyseste i tarmen og spermatheca, mens hsp-16.2 reporter var lyseste i svelget. I tillegg hadde hsp-16.2 reporter en høy grad av orm-til-orm variasjon i mengden induksjon som tidligere beskrevet, men hsp-70 reporteren ikke13.

En vanlig variant av seksjon 2 er å utføre varmesjokket i en tørr inkubator i stedet for et sirkulerende vannbad. Derfor ble forskjellen mellom de to metodene også testet. Det ble funnet at begge protokollene resulterte i robust induksjon av de to fluorescerende journalistene ved hjelp av våre forhold, selv om et sirkulerende vannbad anbefales som en beste praksis (se Diskusjon) (Figur 1B).

For å teste avhengigheten av journalistene på transkripsjonsfaktoren HSF-1, ble fôring RNAi brukt til å slå ned hsf-1 før reporter induksjon ble målt. Det ble funnet at fluorescens av begge stammene ble sterkt redusert ved HSF-1 knockdown, noe som indikerer at disse journalistene er HSF-1-avhengige som beskrevet i litteraturen4 (Figur 2). Det ble imidlertid også observert at pharyngeal fluorescens vedvarte i begge reportere ved hsf-1 knockdown, som er i samsvar med tidligere rapporter om at pharyngeal muskelen er motstandsdyktig mot RNAi ved å mate14.

For å kvantisere hele orminduksjon av HSR på molekylært nivå, ble to endogene HSPs målt med RT-qPCR ved hjelp av avsnitt 3 i protokollen. Prøver ble målt i triplicate, en standard kurve ble generert for hver av primers, og en smeltekurve ble analysert for hver prøve for kvalitetskontroll. Det ble funnet at et 33 °C varmesjokk i 1 timer resulterte i mer enn en 2000x økning i relativ uttrykk for to varmesjokkgener, hsp-70 og hsp-16.2 (Figur 3). Disse resultatene viser at begge endogene gener er egnet for måling av HSR induksjon og at et 33 °C varmesjokk i 1 time er tilstrekkelig til å generere en betydelig respons. Forsiktighet bør imidlertid brukes til å tolke den absolutte graden av varmesjokkinduksjon, fordi mRNA-nivåene i fravær av varmesjokk er svært lave.

For å analysere en fysiologisk respons på varmesjokk, ble en organismal thermorecovery analyse testet ved hjelp av § 4 av protokollen. Det ble funnet at eksponering av ormer til en 6 h varmesjokk ved 33 °C førte til en 20% reduksjon i ormer med normal bevegelse etter en 48 h utvinning (figur 4A). Avhengigheten av denne analysen på HSF-1 transkripsjonsfaktoren ble testet ved hjelp av fôring RNAi til knockdown hsf-1 før utsette ormer for stress. Det ble funnet at knockdown av hsf-1 forårsaket en dramatisk reduksjon i normal bevegelse, med > 95% av ormer som viser jerky bevegelse eller lammelse etter å ha blitt prodded med en platina wire pick.

Vi sammenlignet denne termoanalysen med en mye brukt alternativ organismeanalyse ofte referert til som termotolerance. I termotoleransanalysen blir ormer utsatt for en kontinuerlig 35 °C-temperatur ved hjelp av en tørr inkubator, og prosentandelen av ormer i live måles på ulike tidspunkter. Ved hjelp av denne analysen ble det funnet at kontrollormer kontinuerlig eksponert for 35 °C døde etter ca. 8 timers eksponering (figur 4B). Men da avhengigheten av denne analysen på HSF-1 ble testet ved hjelp av RNAi knockdown, ble det funnet at hemming av hsf-1 ikke forårsaket en reduksjon i termotolerance. Lignende resultater har tidligere blitt vist ved hjelp av HSF-1 mutasjoner (se Diskusjon). Derfor anbefales ikke bruk av termotolerance-analysen for å måle HSR, og thermorecovery er den foretrukne metoden for å undersøke HSR på organismenivå.

Figure 1
Figur 1: HSR induksjon målt med fluorescerende reportere. (A)Basalen og (B) varmeindusible uttrykk for hsp-70p::gfp og hsp-16.2p::gfp reporter stammer etter 1 t varmesjokk ved 33 °C i et vannbad eller inkubator. Ormer ble hevet på OP50 bakterier i 64 timer, varmesjokkert, og deretter gjenopprettet ved 20 °C i 8 timer før avbildning. For referanse ble ingen varmesjokkormer i (A) renormalisert i (B) for å matche rekkevidden og metningen av varmesjokkerte ormer. Representative bilder av to eksperimentelle replikeringer vises. Skala bar = 250 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: HSR induksjon målt med fluorescerende reportere er avhengig av HSF-1. Stammer som inneholder hsp-70p::gfp og hsp-16.2p::gfp reportere ble hevet på kontroll (L4440 tom vektor) eller hsf-1 RNAi plater for 64 h, utsatt for en 1 h varmesjokk ved 33 ° C i et vannbad, og deretter gjenopprettet ved 20 ° C for 8 h før avbildning. Representative bilder av to eksperimentelle replikeringer vises. Skala bar = 250 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: HSR induksjon målt med RT-qPCR. N2 ormer ble hevet på HT115 bakterier i 60 timer og deretter varme sjokkert i 1 t i en 33 ° C vannbad. De relative mRNA-nivåene av hsp-70 (C12C8.1) og hsp-16.2 er vist normalisert til ingen varmesjokkkontroll. Verdier som er plottet er gjennomsnittet av fire biologiske replikeringer og feilfelt representerer ± SEM. Statistisk signifikans ble beregnet ved hjelp av en ulønnet student t-test. **p < 0,01. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Thermorecovery, men ikke termotolerans, er avhengig av HSF-1. N2 ormer ble hevet på kontroll (L4440) eller hsf-1 RNAi plater for 60 h og deretter flyttet til enten: (A) A 33 ° C vannbad for 6 h og gjenvunnet ved 20 °C i 48 timer før scoring for normal bevegelse (thermorecovery), eller (B) A 35 °C tørr inkubator og fjernet hver 2. Hver analyse ble gjort med n ≥ 30 individer på 2 uavhengige dager. Gjennomsnittet vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I litteraturen har et bredt spekter av temperaturer, tider og utstyr blitt brukt til å analysere HSR, som har innført unødvendige advarsler og ført til vanskeligheter med å sammenligne resultater mellom laboratorier. For eksempel har temperaturer fra 32-37 °C og ganger fra 15 min til flere timer blitt brukt til å indusere HSR15. Det er imidlertid rapportert at dødelighet oppstår så tidlig som 3 timer ved 37 °C for alle stadier og 1,5 timer for dag 1 voksne15. Videre viser vi at eksponering av ormer til 35 °C forårsaker dødelighet som ikke er HSF-1 avhengig, noe som gjør disse forholdene dårlig egnet for analyse av HSR. I motsetning er et varmesjokk på 33 °C i 1 timer robust nok til å fremkalle sterk induksjon av varmesjokkgener, men mild nok til ikke å påvirke orm levedyktighet. Faktisk, eksponering for 33 ° C så lenge 6 h bare fører 20% av ormer til å vise unormal bevegelse. Derfor foreslår vi å bruke en temperatur på 33 °C og en tid på 1 timer som standardisert tilstand for RT-qPCR og fluorescerende reporteranalyser.

Nylige eksperimenter har vist at utviklingsoppsamling av ormer for HSR-eksperimenter er spesielt viktig. Det ble nylig vist at i C. elegans inducibility av HSR avtar (dvs. kollapser) med > 50% når hermafroditter begynner egg legging5. Iscenesettelse av ormene riktig er kritisk fordi det ofte er forskjeller i utviklingstidspunktet i stammer som bærer mutasjoner. Hvis temperaturfølsomme mutanter brukes, vil dette også påvirke resultatene hvis de ikke synkroniseres etter deres reproduktive alder. Derfor anbefales det å nøye måle utbruddet av egglegging for hver belastning for å bestemme når kollapsen oppstår. Tidsvinduet etter L4-smeltet og før initiering av reproduktiv modenhet er smal; Derfor må det utvises forsiktighet slik at HSR-kollapsen ikke utilsiktet forårsaker variasjon i resultatene.

I tillegg til utviklingstid kan overraskende små temperaturendringer, så lite som 1 °C, ha betydelige effekter på HSR. For eksempel er termosensoriske nevroner i C. elegans følsomme for temperaturendringer så små som ± 0,05 °C16. Dermed er det viktig å bruke et termometer som nøyaktig kan måle temperaturen. Derfor foreslår vi som beste praksis bruk av en kalibrert enhet for temperaturmåling som er nøyaktig nok til å måle temperaturer innen ± 0,1 °C. Videre bør et termometer med dataloggingsfunksjonalitet brukes til å måle temperaturvariasjoner over tid. Mange inkubatorer er spesifisert å ha termiske variasjoner på mer enn 1 °C i ulike deler av inkubatoren og over tid, noe som kan ha betydelige effekter på HSR-eksperimenter. Som en beste praksis foreslår vi å bruke inkubatorer som har tilstrekkelig isolasjon og sirkulasjon for å minimere temperatursvingninger. For å gjennomføre varmesjokkeksperimenter foreslår vi en beste praksis med et sirkulerende vannbad. Tiden det tar for en agar plate å nå en ønsket temperatur er ca 6-7 min i et vannbad, men mye lenger i en tørr inkubator15,17. Men hvis et sirkulerende vannbad ikke er tilgjengelig, har vi vist at robust HSR induksjon også forekommer i en tørr inkubator ved hjelp av våre forhold. Hvis en tørr inkubator brukes, bør åpning av inkubatoren for varigheten av stresset minimeres.

Det er veletablert at induksjon av varmesjokkgener er avhengig av hovedregulatoren til HSR, HSF-1. Her presenterer vi bevis for at de to indirekte analysene, fluorescerende journalister og thermorecovery, også er avhengige av HSF-1. Betydelig fant vi at en vanlig alternativ organismeanalyse, termotolerans, ikke er HSF-1 avhengig ved hjelp av hsf-1 RNAi (Figur 4). Lignende resultater har tidligere blitt rapportert ved hjelp av en hsf-1 mutant eller en ttx-3 mutant, som blokkerer HSR18,19,20. Sammen indikerer disse resultatene at termotolerance analysen ikke skal brukes til HSR-forskning. Videre tyder dette på at en beste praksis er å teste HSF-1 avhengighet for enhver analyse som brukes til å måle HSR.

Samlet presenterer vi en rekke standardiserte protokoller og beste praksis for robust og reproduserbar måling av HSR-induksjon i C. elegans. Vi håper at disse metodene vil redusere variasjonen i HSR-eksperimenter og øke reproduserbarheten. Å legge til rette for direkte sammenligninger av HSR-forskning mellom laboratorier vil bidra til å akselerere forskningen på HSR-feltet. Videre vil standardisering være til nytte for forskning på aldring og nevrodegenerative sykdommer som HSR er nært forbundet med.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en donasjon fra Frank Leslie. Noen stammer ble levert av CGC, som er finansiert av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18S-forward primer TTGCGTCAACTGTGGTCGTG
18S-reverse primer CCAACAAAAAGAACCGAAGT
CCTG
AM446 rmIs223[phsp70::gfp; pRF4(rol-6(su1006))] Morimoto lab http://groups.molbiosci.northwestern.edu/morimoto/
C12C8.1-forward primer GTACTACGTACTCATGTGTCG
GTATTT
C12C8.1-reverse primer ACGGGCTTTCCTTGTTTTCC
CFX Connect Real-Time PCR Detection System Bio Rad 1855200
CL2070 dvIs70 [hsp-16.2p::GFP + rol-6(su1006)] Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
EasyLog Thermistor Probe Data Logger with LCD Lascar EL-USB-TP-LCD
Greenough Stereo Microscope S9i Series Leica
Hard Shell 96 Well PCR Plates Bio Rad HSS9601
hsp-16.2-forward primer ACTTTACCACTATTTCCGTCC
AGC
hsp-16.2-reverse primer CCTTGAACCGCTTCTTTCTTTG
iScript cDNA Synthesis Kit Bio Rad 1708891
iTaq Universal Sybr Green Super Mix Bio Rad 1725121
Laser Scanning Confocal Microscope Nikon Eclipse 90i
MultiGene OptiMax Thermo Cycler Labnet TC9610
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) https://cgc.umn.edu/
Nanodrop Lite Spectrophotometer Thermo Scientific ND-LITE
Parafilm M Roll Bemis 5259-04LC
RapidOut DNA Removal Kit Thermo Scientific K2981
Recirculating Heated Water Bath Lauda Brinkmann RE-206
Traceable Platinum Ultra-Accurate Digital Thermometer Fisher Scientific 15-081-103
TRIzol Reagent Invitrogen 15596026 RNA isolation reagent
TurboMix Attachment Scientific Industries SI-0564
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-0236

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Guisbert, E., Morimoto, R. I. The regulation and function of the heat shock response. Protein Quality Control in Neurodegenerative Diseases. , 1-18 (2013).
  2. Li, J., Chauve, L., Phelps, G., Brielmann, R. M., Morimoto, R. I. E2F coregulates an essential HSF developmental program that is distinct from the heat-shock response. Genes and Development. 30 (18), 2062-2075 (2016).
  3. Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300 (5622), 1142-1145 (2003).
  4. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Molecular Biology of the Cell. 15 (2), 657-664 (2004).
  5. Labbadia, J., Morimoto, R. I. Repression of the Heat Shock Response Is a Programmed Event at the Onset of Reproduction. Molecular Cell. 59 (4), 639-650 (2015).
  6. Link, C. D., Cypser, J. R., Johnson, C. J., Johnson, T. E. Direct observation of stress response in Caenorhabditis elegans using a reporter transgene. Cell Stress & Chaperones. 4 (4), 235 (1999).
  7. Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a Tissue-Selective Heat Shock Response Regulatory Network. PLoS Genetics. 9 (4), 1-12 (2013).
  8. Ma, J., et al. Cellular Proteomes Drive Tissue-Specific Regulation of the Heat Shock Response. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (3), 1011-1018 (2017).
  9. Mendenhall, A. R., et al. Expression of a single-copy hsp-16.2 reporter predicts life span. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (7), 726-733 (2012).
  10. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. (1999), 1-11 (2006).
  11. Avery, L., You, Y. J. C. elegans feeding. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-23 (2012).
  12. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  14. Shiu, P. K., Hunter, C. P. Early Developmental Exposure to dsRNA Is Critical for Initiating Efficient Nuclear RNAi in C. elegans. Cell Reports. 18 (12), 2969-2978 (2017).
  15. Zevian, S. C., Yanowitz, J. L. Methodological considerations for heat shock of the nematode Caenorhabditis elegans. Methods. 68 (3), 450-457 (2014).
  16. Clark, D. A., Biron, D., Sengupta, P., Samuel, A. D. T. The AFD sensory neurons encode multiple functions underlying thermotactic behavior in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 26 (28), 7444-7451 (2006).
  17. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons. Science. 320 (5877), 811-814 (2008).
  18. McColl, G., et al. Insulin-like signaling determines survival during stress via posttranscriptional mechanisms in C. elegans. Cell Metabolism. 12 (3), 260-272 (2010).
  19. Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
  20. Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).

Tags

Miljøvitenskap Utgave 161 varmesjokk varmesjokkrespons HSF-1 C. elegans,HSP-16.2 HSP-70 chaperones termotolerance thermorecovery
Standardiserte metoder for måling av induksjon av varmesjokkresponsen i <em>caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim… More

Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Standardized Methods for Measuring Induction of the Heat Shock Response in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (161), e61030, doi:10.3791/61030 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter