Summary
Décrit est un protocole pour effectuer la transplantation intratrachéale des cellules stromales mésenchymales (MSCs) par injection intratrachéale dans les rats néonatals terme. Cette technique est une option cliniquement viable pour l’administration de cellules souches et de médicaments dans les poumons néonatals de rat pour évaluer leur efficacité.
Abstract
L’exposition prolongée à des concentrations élevées d’oxygène conduit à l’inflammation et aux lésions pulmonaires aiguës, qui sont semblables à la dysplasie bronchopulmonaire humaine (BPD). Chez les nourrissons prématurés, le TPL est une complication majeure malgré l’utilisation précoce de la thérapie surfactante, des stratégies de ventilation optimales et de la ventilation à pression positive non invasive. Parce que l’inflammation pulmonaire joue un rôle crucial dans la pathogénie de la BPD, l’utilisation de corticostéroïdes est un traitement potentiel pour le prévenir. Néanmoins, le traitement systémique des corticostéroïdes n’est généralement pas recommandé pour les nouveau-nés prématurés en raison d’effets indésirables à long terme. Les études précliniques et les essais cliniques de phase I chez l’homme ont démontré que l’utilisation de cellules stromales mésenchymales (MSC) dans les lésions pulmonaires induites par l’hyperoxie et chez les nouveau-nés prématurés est sûre et faisable. La transplantation intratrachéale et intraveineuse de MSC a été montrée pour protéger contre des dommages hyperoxiques néonatals de poumon. Par conséquent, l’administration intratrachéale des cellules souches et du traitement combiné surfactant et glucocorticoïde est apparue comme une nouvelle stratégie pour traiter les nouveau-nés atteints de troubles respiratoires. Le stade de développement des poumons de rat à la naissance est équivalent à celui dans les poumons humains à 26−28 semaines de gestation. Par conséquent, les rats nouveau-nés sont appropriés pour étudier l’administration intratrachéale aux nouveau-nés prématurés présentant la détresse respiratoire pour évaluer son efficacité. Cette technique d’instillation intratrachéale est une option cliniquement viable pour la livraison de cellules souches et de médicaments dans les poumons.
Introduction
L’oxygène supplémentaire est souvent nécessaire pour traiter les nouveau-nés souffrant de détresse respiratoire1. Cependant, la thérapie d’hyperoxie chez les enfants en bas âge a des effets à long terme défavorables. L’exposition prolongée à des concentrations élevées d’oxygène conduit à l’inflammation et aux lésions pulmonaires aiguës, qui est semblable à la dysplasie bronchopulmonaire humaine (BPD)2. Le DBP est une complication majeure du traitement d’hyperoxie qui peut se produire en dépit de la thérapie de surfactant tôt, des procédures optimales de ventilation, et l’utilisation accrue de la ventilation positive non invasive de pression dans les enfants en bas âge prématurés. Alors que de nombreuses stratégies de traitement ont été rapportées pour bpd3, aucun traitement connu ne peut réduire cette complication.
L’utilisation de corticostéroïdes est un traitement potentiel pour prévenir le TPL, parce que l’inflammation pulmonaire joue un rôle crucial dans sa pathogénie. Cependant, la thérapie systémique de corticostéroïde n’est habituellement pas recommandée pour les nouveau-nés prématurés en raison des effets indésirables à long terme4,5.
Les cellules stromales mésenchymales (MSC) ont des caractéristiques pluripotentes et peuvent se différencier en différents types de cellules, y compris les os, le cartilage, les tissus adipeux, les muscles et les tendons6. Les MSC ont des effets immunomodulatoires, anti-inflammatoires et régénératifs7,et les études animales montrent les avantages thérapeutiques des MSC et de leurs composants sécrétés dans les lésions pulmonaires induites par l’hyperoxie chez les rongeurs8,9. La transplantation intratrachéale et intraveineuse de MSC a été montrée pour protéger contre des dommages hyperoxiques néonatals de poumon. Par conséquent, l’administration intratrachéale des cellules souches et la thérapie combinée de surfactant et de corticostéroïde pourrait être une stratégie potentielle de traitement pour traiter des nouveau-nés avec des désordres respiratoires. Des études précliniques ont utilisé l’administration intratrachéale des cellules souches et du virus adéno-associé chez les rats nouveau-nés10,11,12. Cependant, une présentation étape par étape de la technique et du suivi in vivo des cellules souches transplantées n’est pas disponible. Le rat nouveau-né est approprié pour étudier les effets de l’administration intratrachéale sur les nouveau-nés prématurés souffrant de détresse respiratoire parce que le stade saccular du poumon de rat à la naissance est équivalent à celui du poumon humain à 26−28 semaine de gestation13. Une méthode efficace d’administration dans la trachée de rat est cruciale pour la distribution pulmonaire réussie. La technique présentée ici permet l’étude de l’administration intratrachéale des cellules et/ou des médicaments pour le traitement des maladies pulmonaires néonatales utilisant des rats comme modèle pour l’homme.
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Protocol
Cette procédure a été approuvée par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Université médicale de Taipei.
REMARQUE : Les MSCs humains transfectés de protéines fluorescentes vertes (GFP) et de gènes de luciferase de lucferase de lucfly (Fluc) ont été obtenus auprès d’une société commerciale (Table of Materials).
1. Caractérisation des MSC humains avec luciferase de luciferase de lucfly et protéine fluorescente verte
- Maintenir les MSC humains transfectés avec GFP et Fluc dans des milieux complets (modification minimale essentielle de l’aigle-alpha [αMEM], complétés par 10−15% de sérum bovin fœtal [FBS], 2 mM L-glutamine, 1 ng/mL de base FGF, et PSF) à 37 °C avec humidité saturée et 5% CO2. Cellules de passage à ~70−90% confluence.
- Observez les MSC sous un microscope à contraste de phase de fluorescence (figure 1A)et analysez les niveaux d’expression de Fluc et GFP14.
- Caractériser les MSC en analysant l’expression des marqueurs CD, y compris CD44, CD73, CD90, CD105 à l’aide de cytométrie de flux (Figure 1B). Induire la différenciation du trilignement des cellules souches aux adipocytes, chondrocytes et ostéocytes, et confirmer la différenciation du triage (Figure 1C) par von Kossa, huile rouge O, et tache bleue alcaline suivant un protocole commercial15,16.
2. Anesthésiation des chiots de rat
- Laissez les rats Sprague-Dawley enceintes datés à temps accoucher par voie vaginale à terme.
- Retirer les chiots de rat de la cage le jour postnatal 5.
- Anesthésiez les chiots de rat à l’aide d’une anesthésie au gaz (c.-à-d. 2 % d’isoflurane) dans une chambre d’anesthésie.
- Confirmez l’anesthésie adéquate en vérifiant la respiration et les réflexes.
REMARQUE : La respiration doit devenir superficielle et les réflexes devraient diminuer. Les chiots de rat restent inconscients pendant au moins ~10 min avec cette concentration d’isoflurane.
3. Instillation intratrachéale
- Une fois anesthésiés, retenez les chiots de rat sur un peuplement d’intubation incliné à ~60° et maintenez les chiots en place avec du ruban adhésif de laboratoire sur les quatre membres.
- Appliquer du ruban sous le nez pour fixer la tête et identifier le cou pour la trachéotomie de perforation.
- Désinfecter la zone d’incision (c.-à-d. le cou) à l’aide d’un tampon de préparation à l’alcool à 75 %.
- Faire une incision verticale de 0,3 cm du cou intermédiaire au-dessus de la trachée avec des microscisants pour éviter d’endommager les artères carotides.
- Disséquer les couches de graisse et de muscle loin pour localiser la trachée avec la pointe courbée pince à épiler effilée sans crochet.
- Tenez la trachée à l’une de la pointe incurvée.
- Tenez une seringue de 100 μL verticale et injectez lentement 30 μL de solution saline normale (c.-à-d. contrôle) ou 30 μL de MSC étiqueté Fluc-GFP (1 x 105 cellules) dans la trachée par une seringue à aiguille de 30 G pendant la phase d’ipratoire.
- Fermez l’incision avec un point de soie 6-0, attachez le noeud aussi petit que possible, et coupez les extrémités aussi courtes que possible.
- Placez les rats sous la lumière infrarouge ou sur un coussin chauffant pour se tenir au chaud et leur permettre de se remettre de l’anesthésie.
- Confirmez que les rats sont chauds, roses et capables de mouvement spontané avant de ramener les rats dans la cage.
4. Surveillance de la distribution pulmonaire des MSC
- Pour suivre les MSC humains transplantés, intraperitoneally injecter les rats avec le sel de potassium de luciferine dans la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) à une dose de 125 mg/kg de poids corporel 15 min après l’injection de MSC.
- Anesthésier les rats à l’aide d’isoflurane à 2% à travers les cônes nasaux.
- Acquérir des images séquentielles à intervalles de 5 à 15 s 10 min après l’administration de luciferine avec binning moyen, 1 f/stop, et un champ de vision de 26 cm à l’aide d’un système d’imagerie pour petits animaux (Table des matériaux).
- Quantifier l’activité de luminescence des poumons en fonction des régions d’intérêt automatiques à l’aide d’un logiciel d’imagerie (Tableau des matériaux)17.
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Representative Results
La distribution pulmonaire de l’instillation intratrachéale des cellules souches dans le terme rats néonatals a été déterminée par des cellules souches étiquetées luciferase de luciferase de firefly (Fluc). Les MSC ont été étiquetés avec Fluc et étiquetés avec des protéines fluorescentes vertes par transduction lentiviral. La figure 1A montre un niveau élevé d’expression GFP dans les MSC humains, et 93,7 % de la population a montré l’expression positive de GFP détectée par cytométrie de flux. Les MSC ont été caractérisés par l’analyse de l’expression des marqueurs cd (c.-à-d. CD 44, CD73, CD90 et CD105) et de la capacité de différenciation du triage en ostéocytes, chondrocytes et adipocytes (figure 1B,C). Pour suivre les MSCs humains transplantés in vivo, l’imagerie de luminescence des rats a été réalisée à l’aide d’un système d’imagerie pour petits animaux. Les mesures ont été prises ventrally. Les rats ont été fixés avec du ruban adhésif et par la suite une injection intrapéritonéale de 30 mg/mL de sel de potassium de luciferine dans PBS à une dose de 125 mg/kg de poids corporel a été administrée. Luciferase se combine avec la luciferine, l’oxygène et l’ATP, et génère de la lumière par une réaction chimique, résultant en bioluminescence18. Pendant la procédure d’imagerie, les rats ont été anesthésiés utilisant 2% d’isoflurane administré par des cônes de nez. Des images de rat ont été acquises 10 min après l’administration de luciferin. Les images séquentielles ont été acquises à intervalles de 5 à 15 s (sans délai) pendant au moins 1 min, avec binning moyen, 1 f/stop et un champ de vision de 26 cm. À l’aide de données de mesure provenant d’une séquence d’images spectrales filtrées à différentes longueurs d’onde (560–660 nm), la profondeur et l’emplacement du journaliste bioluminescent a été déterminé. Les signaux de luminescence des poumons ont été calculés en fonction des régions automatiques d’intérêt dans le mode de sélection du cercle. L’intensité moyenne de luminescence chez les animaux traités en solution saline normale a reçu une valeur d’un, et les données pour chaque animal traité par le MSC ont été normalisées à celles des animaux traits salines normaux.
La figure 2A montre une image représentative de la luminescence dans les poumons des rats. Aucune luminescence n’a été observée dans les régions pulmonaires des rats traités avec la solution saline normale. Les rats traités avec des MSC ont montré la luminescence dans la trachée et les régions centrales de poumon. La quantification de l’intensité de la luminescence a révélé que les rats traités avec des MSC présentaient une augmentation d’environ 13 fois de l’activité de luminescence, comparativement aux rats traités uniquement avec la solution saline normale (figure 2B).
Figure 1 : Caractérisation des MSC humains.
(A) Expression de GFP dans les MSC humains après transduction de lentivirus. BB) Expression de marqueurs CD spécifiques au MSC humain (c.-à-d. CD 44, CD73, CD90, CD105). (C) Différenciation du triage des MSC humains. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Surveillance de la distribution pulmonaire de la luminescence à l’aide d’un système d’imagerie pour petits animaux.
(A) Une image représentative de la distribution pulmonaire des MSC étiquetés chez les rats. Aucune luminescence n’a été observée dans la région pulmonaire des rats traités avec la solution saline normale. Les rats traités avec des MSC humains ont montré la luminescence dans les régions trachéales et pulmonaires. (B) Quantification de l’activité de luminescence dans les poumons du rat (n = 4). Les barres d’erreur représentent l’écart type. L’échelle est photons/s/cm2/sr dans l’axe Y. **P < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les nouveau-nés souffrant de détresse respiratoire ont généralement besoin d’un surfactant intratrachéal et/ou d’un traitement corticostéroïde19. Les essais cliniques de phase I chez l’homme ont démontré l’innocuité des MSC intratrachéaux chez les nouveau-nés prématurés8. Ces études suggèrent que l’administration intratrachéale des médicaments est une option importante pour les nouveau-nés souffrant de détresse respiratoire. Les études sur les modèles animaux sont plus utiles si les caractéristiques du modèle sont directement pertinentes pour les humains. Les rats nouveau-nés à terme sont des modèles utiles pour les lésions pulmonaires prématurées et les études de développement. Cependant, les voies respiratoires supérieures des rats néonatals sont trop petites pour permettre l’intubation trachéale directe comme réalisée chez les rats adultes20. L’instillation intratrachéale par trachéotomie est une technique alternative faisable pour l’administration intratrachéale des cellules souches ou des médicaments aux poumons néonatals de rat.
L’imagerie in vivo bioluminescence est un outil précieux pour la surveillance in vitro et in vivo du sort de la cellule souche transplantée, accompli en étiquetant les cellules avec l’expression constitutive d’une protéine journaliste luciferase21. Les enzymes de luciferase catalysent l’oxydation d’un substrat (luciferine), et libèrent la lumière comme produit de la réaction. L’imagerie visuelle par bioluminescence permet une analyse non invasive et en temps réel des processus de la maladie chez les organismes vivants. L’imagerie de bioluminescence a été utilisée pour la surveillance in vivo de la migration, de la survie et de la différenciation morphologique des MSC22. Cette étude a évalué la distribution des cellules souches transplantées dans les poumons à l’aide d’un système d’imagerie in vivo. L’imagerie de bioluminescence in vivo repose sur la surveillance des particules contenues dans les cellules. Parce que ceux-ci peuvent être phagocytosed à la mort cellulaire, il pourrait conduire au suivi des macrophages d’hôte. Par conséquent, la luminescence a été mesurée moins de 10 min après l’administration de luciferin.
La limite de cette étude est que la variation interanimale a été perçue dans les images de l’IVIS. Par conséquent, les signaux de luminescence des poumons ont été calculés en fonction des régions d’intérêt automatiques et de la normalisation de l’intensité moyenne de luminescence à un chez les animaux traités par solution saline normale.
L’instillation intratrachéale correcte et efficace est essentielle pour l’évaluation de l’efficacité du MSC chez les rats néonatals, mais elle peut être utile pour tester d’autres traitements médicinaux aussi bien. Par conséquent, cette technique de modèle de rat peut être réglable à une variété d’applications pulmonaires. L’instillation intratrachéale de cellules souches ou de médicaments représente un traitement relativement facile et rentable des maladies pulmonaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été en partie soutenue par une subvention de Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan (A-109-008).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 silk | Ethicon | 1916G | |
| Alcohol Prep Pad | CSD | 3032 | |
| BD Stemflow hMSC Analysis Kit | BD Biosciences | 562245 | CD markers |
| CMV-Luciferase-EF1α-copGFP BLIV 2.0 Lentivector for In Vivo Imaging | SBI | BLIV511PA-1 | |
| CryoStor10 | BioLife Solutions | 640222 | |
| Human MSCs | Meridigen Biotech Co., Ltd. Taipei, Taiwan | ||
| Infrared light | JING SHANG | JS300T | |
| Isoflurane | Halocarbon | 26675-46-7 | |
| IVIS-200 small animal imaging system | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | ||
| Luciferin potassium salt | Promega, Madison, WI | ||
| Micro-scissors, straight | Vannas | H4240 | |
| Normal saline | TAIWAN BIOTECH CO., LTD. | 113531 | Isotonic Sodium Chloride Solution |
| Small Hub RN Needle, 30 gauge | Hamilton Company, Reno, NV | 7799-06 | |
| Syringe (100 µl) | Hamilton Company, Reno, NV | 81065 | |
| Xenogen Living Image 2.5 software | Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA | N/A |
References
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