Un modèle murin induit par la doxorubicine de la cardiomyopathie dilatée in vivo

Summary

Décrit est un protocole visant à établir un modèle de cardiomyopathie dilatée (DCM) induite par la doxorubicine chez la souris par injection intrapéritonéale à long terme de doxorubicine.

Abstract

La cardiomyopathie dilatée (DCM) fait référence à un spectre de troubles myocardiques hétérogènes caractérisés par une dilatation ventriculaire et une performance cardiaque déprimée en l’absence d’hypertension, de valvulopathies, congénitales ou ischémiques, et qui peuvent être liés à une infection, à des anomalies auto-immunes ou métaboliques ou à une hérédité familiale. Il peut évoluer vers une insuffisance cardiaque congestive avec un mauvais pronostic. La doxorubicine (Dox) est largement utilisée comme médicament chimiothérapeutique, mais son utilisation est limitée car elle provoque des changements du myocarde de type DCM. Sa toxicité myocardique est attribuée au stress oxydatif, à l’inflammation chronique et à l’apoptose cardiomyocytaire. Aucun modèle de DCM exploitant ces symptômes de DCM induits par Dox n’a été établi.

Introduction

L’une des causes les plus courantes d’insuffisance cardiaque, le DCM se caractérise par une dilatation ventriculaire et une diminution de la fonction cardiaque et est la raison la plus courante de transplantation cardiaque dans le monde¹. Afin d’étudier plus avant sa pathogenèse et de trouver des traitements efficaces, l’accès à des modèles animaux matures est particulièrement important. Le but des expériences décrites est d’établir un modèle murin stable de DCM qui ressemble à un DCM humain.

En raison de la pathogenèse complexe du DCM, il existe de nombreuses méthodes différentes pour créer des modèles animaux correspondants. Les modèles DCM^{spontanés 2} sont relativement stables, mais ils sont coûteux et difficiles à trouver. Les modèles animaux génétiquement modifiés³ ne sont pas bien établis et nécessitent une utilisation plus expérimentale. Les modèles animaux DCM induits par une infection virale⁴ ou des défauts auto-immuns⁵ sont faciles à obtenir, mais ils ne sont pas entièrement représentatifs du DCM. Les modèles associés à la toxicité myocardique comprennent les modèles DCM induits par l’alcool et les modèles animaux DCM induits par Dox.

Le modèle de cardiomyopathie induite par Dox est obtenu par injection intrapéritonéale de Dox^6. Le modèle exploite l’effet secondaire chronique le plus grave de Dox: après une exposition à Dox, les patients développent des symptômes de DCM tardifs avec une uniformité clinique⁷. Le stress oxydatif induit par Dox⁸ et les dommages mitochondriaux⁹, qui conduisent à l’apoptose cardiomyocytaire, sont des symptômes de la pathogenèse du DCM. Il existe des modèles de traitement Dox aigu et chronique: une seule dose élevée de Dox (15 mg / kg) induit un modèle à court terme pour la cardiomyopathie¹⁰, tandis que les injections répétitives de Dox à faible dose (six hebdomadaires, 3 mg / kg) induisent un modèle à long terme pour la cardiomyopathie¹¹. Sur la base de l’étude présentée, les souris de type sauvage injectées par voie intrapéritonéale une fois par semaine pendant un mois à une dose de 5 mg / kg présentent une morphologie et une histologie du cœur compatibles avec les caractéristiques du DCM à la fin du traitement, offrant un moyen idéal d’établir un modèle DCM.

Protocol

Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’hôpital Drum Tower de Nanjing.

1. Préparation des réactifs et des animaux

1. Dissoudre le chlorhydrate de doxorubicine (Pfizer, Usa) dans de l’eau stérilisée. Vortex pour obtenir une solution Dox de 1 mg/mL et conserver à 4 °C.
2. Utilisez des souris C57BL/6 (âgées de 8 à 10 semaines; poids de 25 à 30 g). Pour cette étude, des souris ont été achetées au Centre de recherche sur les animaux modèles de l’Université de Nanjing et gardées dans la salle des animaux de l’hôpital de la tour du tambour de Nanjing.
3. Les cages de souris exemptes d’agents pathogènes ont été maintenues sous un cycle lumière/obscurité de 12 h à une température constante de 23 °C. Tous les animaux ont été nourris avec un régime chow normal et ont reçu de la nourriture et de l’eau ad libitum.

2. Mise en place d’un modèle animal DCM

1. Randomiser les souris dans un groupe normal (n = 5) et un groupe Dox (n = 5).
2. Administrer la solution Dox par voie intrapéritonéale à une dose de 5 mg/kg à l’aide d’une seringue stérilisée de 1 mL 1 fois par semaine pour le groupe Dox. Traitez les souris témoins de la même manière avec la même quantité de solution saline.
3. Mesurez le poids corporel des deux groupes chaque semaine. En conséquence, ajuster la dose d’injection en fonction du poids corporel hebdomadaire pendant un total de 4 semaines, avec une dose cumulative de 20 mg / kg (Figure 1).
   NOTE: Une période de 4 semaines a été choisie parce que l’échocardiographie à 4 semaines a montré une différence significative dans la fonction cardiaque entre les deux groupes.

3. Examen échocardiographique

1. À la fin de la quatrième semaine, effectuez un examen échocardiographique des souris.
2. Anesthésier les souris avec 2% d’isoflurane par voie intranasale. Si les souris ne répondent pas à une pincée de la peau avec une pince à dents ou en stimulant les orteils et la queue, continuez avec le protocole.
3. Placez la souris sur une plate-forme de manipulation d’animaux en position couchée. Pour maintenir l’anesthésie, couvrez le nez et la bouche de l’animal avec un cône nasal et délivrez 2% d’isoflurane.
   REMARQUE: Pour l’anesthésie IP, injecter 4% d’hydrate de chloral à une dose de 0,2 mL / 20 g.
4. Retirez soigneusement la fourrure de la poitrine avec un rasoir électrique. Évaluer la fonction cardiaque in vivo à l’aide de l’échocardiographie transthoracique.
5. Effectuer l’échocardiogramme BT dans les vues parasternales à axe long et à axe court à une fréquence d’images de 233 Hz. Les dimensions systoliques et diastoliques finales ont été définies comme les phases correspondant respectivement à l’onde T de l’ECG et à l’onde R.
6. Sur les tracés en mode M, mesurez le diamètre systolique final LV (LVIDd), le diamètre diastolique terminal LV (LVID), l’épaisseur septale interventriculaire (IVS) et l’épaisseur de paroi postérieure LV (LVPW) à partir de 3 à 5 battements cardiaques. Calculez également la fraction d’éjection (EF) et le raccourcissement de fraction (FS) en fonction de l’échocardiographie.

4. Coloration histologique

1. Après l’analyse échocardiographique, sacrifier les souris par injection intraventriculaire de chlorure de potassium à 10%.
2. Perfuser le cœur avec environ 30 mL de solution saline après dissection jusqu’à ce que le foie et les poumons deviennent pâles.
3. Excisez le cœur et lavez-le soigneusement dans une solution tampon de phosphate pour extruder le sang.
4. Fixez le cœur dans du formol à 4% à température ambiante pendant 24 h et traitez le tissu dans une boîte de paraffine afin que la cire de paraffine refroidisse et se solidifie.
5. Coupez les cœurs en tranches de 5 μm d’épaisseur pour une coloration pathologique.
6. Décolorer et réhydrater les sections contenant du muscle papillaire.
   1. Incuber les lames à 55 °C pendant 30 min. Ensuite, incuber dans du xylène 2x pendant 2 min chacun; 100% éthanol 2x pendant 2 min chacun; 95% d’éthanol 2x pendant 2 min chacun; 80% d’éthanol pendant 2 min; 75% d’éthanol pendant 2 min; et 50% d’éthanol pendant 2 min.
7. Coloration à l’aide d’hématoxyline et d’éosine (H&E) ainsi que de la coloration de Masson.

Representative Results

Fonction cardiaque
La cardiomyopathie dilatée est caractérisée par une dilatation ventriculaire progressive et un dysfonctionnement contractile. La figure 2 montre des images échocardiographiques représentatives des deux groupes. Les souris traitées dox ont montré une réduction marquée de la fraction d’éjection ventriculaire gauche et du raccourcissement fractionnel ventriculaire gauche(Figure 3A, B). Le diamètre LV a également augmenté dans les phases diastolique et systolique(Figure 3C,D). Cela a révélé que les souris traitées par Dox avaient une fonction cardiaque altérée.

Coloration histologique
Une coloration pathologique a été effectuée pour observer les changements pathologiques des souris traitées à la solution saline et des souris traitées par Dox. Les fibres myocardiques des souris du groupe témoin ont été soigneusement disposées, sans infiltrer les leucocytes. Dans le groupe Dox, les myofibres myocardiques étaient désordonnés et cassés, et les cardiomyocytes étaient plus petits et plus minces(Figure 4A). La coloration masson a montré que les souris traitées par Dox présentaient plus de fibrose interstitielle(Figure 4B).

Figure 1 : Schéma d’une cardiomyopathie dilatée induite par Dox. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : L’échocardiographie des deux groupes. A) Groupe témoin; (B) Groupe Dox. À gauche est la section à axe long et à droite est la section à axe court. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Les variables de la fonction cardiaque entre les groupes. a) FE; b) FS; C) LVEDd; (D) LES VULD. *P < 0,05, Test t deStudent. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Coloration histologique. (A) coloration H&E; (B) Coloration masson. La gauche est le groupe témoin et la droite est le groupe Dox. La flèche supérieure montre que les cardiomyocytes traités par Dox étaient plus petits et plus minces et que les myofibres étaient désordonnés et cassés. La flèche inférieure indique la présence d’une fibrose interstitielle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dox est un médicament de chimiothérapie antitumorale périodique non spécifique couramment utilisé dans la pratique clinique¹². Son principal effet secondaire est la cardiotoxicité, caractérisée par une cardiomyopathie et une insuffisance cardiaque ultérieure¹³. Le mécanisme sous-jacent comprend des dommages à la peroxydation lipidique myocardique, l’inhibition de l’activité du réticulum sarcoplasmique myocardique Ca²⁺-ATPase et l’activation du système rénine-angiotensine local myocardique, entraînant une augmentation de la production d’AT II et une surcharge intracellulaire en calcium¹⁴. En raison de l’effet létal d’une forte dose d’injection intrapéritonéale de Dox, un autre moyen d’établir un modèle fiable a été utilisé dans ce protocole.

Le modèle DCM établi par cette méthode est très similaire à la pathogenèse du DCM humain. En plus de l’insuffisance cardiaque, la complication la plus fréquente de Dox, l’ascite a été observée chez les souris DCM. Par conséquent, lors du développement du modèle, il convient de prêter attention au fonctionnement stérile et au remplacement rapide des seringues. En outre, pour la dose de Dox, deux méthodes d’administration ont été comparées: un traitement à long terme utilisant une faible dose et un traitement à court terme avec une dose élevée. Les résultats montrent que l’injection continue de Dox à 5 mg / kg pendant quatre semaines peut entraîner un modèle précis de DCM, une mortalité des souris plus faible et un temps plus court pour l’établissement du modèle.

En résumé, un modèle animal DCM de souris stable, fiable et économique peut être établi avec succès par injection intrapéritonéale de Dox. Cette recherche fournit un modèle idéal pour étudier le DCM. Il contribuera à révéler la pathogenèse de la cardiomyopathie dilatée ou de l’insuffisance cardiaque chronique et à explorer de nouveaux médicaments ou traitements pour de futures applications cliniques.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% paraformaldehyde	servicebio	CAS30525-89-4
C57BL/6 mice	Model Animal Research Center of Nanjing University	\
Doxorubicin hydrochloride	Pfizer	CAS25316-40-9
echocardiography	Visualsonics	\
Hematoxylin and Eosin staining kit	Solarbio	G1120
Masson staining kit	Solarbio	G1343
phosphate buffer solution	Sigma	P5368
potassium chloride	Sigma	CAS7447-40-7
sterilized syringe	Millipore	SLGP033RB