Summary
このプロトコルは、クラ ミジア・トラコマティスの発生変異体を同定および単離するための指向的な前方遺伝的アプローチにおける蛍光プロモーター−レポーター、生細胞顕微鏡、および個々の包含抽出を利用する。
Abstract
細胞内細菌病原体 クラミジア・トラコマティス は、形態学的に離散的な2つの発達形態からなる発達周期を受ける。非複製性の初等体(EB)は宿主の感染を開始する。中に入ると、EBはレチク体(RB)に分化する。RBは、感染性のEBフォームに再び区別する前に、複製の複数のラウンドを受けます。このサイクルは、細胞タイプ間の切り替えの失敗が宿主の侵入または複製を妨げるため、クラミジア生存に不可欠である。
クラミジアの細胞内の性質に起因する遺伝的手法の限界は、細胞型の発達に関与する分子機構の同定を妨げている。我々は、生細胞顕微鏡と組み合わせて、リアルタイムで細胞型切替を可視化することを可能にする新しいデュアルプロモーターレポータープラスミドシステムを設計した。細胞型発達の調節に関与する遺伝子を同定するために、生細胞プロモーターレポーターシステムは、二重レポーター株の化学突然変異誘発、クラミジアのイメージングおよび追跡を突然変異体のクローン分離と組み合わせることで、前方遺伝的アプローチの開発に活用された。この前方遺伝的ワークフローは、幅広い遺伝的経路への指示された尋問のために変更することができる柔軟なツールです。
Introduction
クラミジア・トラコマティス (Ctr)は、その生存および増殖に不可欠な二ファシズム発達サイクルを経て進行する細胞内病原体である。このサイクルは、2つの発達形態、初等体(EB)とレチク体(RB)で構成されています。EBは、レプリケーション無能であるが、エフェクター誘発性エンドサイトーシス2を介して細胞の侵入を仲介する。ホストに入ると、EB は複製 RB に成熟します。RBは、感染の後続のラウンドを開始するために、EBに戻って変換する前に、複製の複数のラウンドを実行します。
遺伝的ツールの限られた配列は、生化学的研究または代理システムの使用にクラミジア研究のほとんどを制限しています。その結果、遺伝子調節の解明と発達周期の制御は困難であった3,4.4クラミジアの分野でより重要な課題の1つは、クラミジア発生周期の高分解能時間追跡とその調節に関与するタンパク質の同定である。クラミジア発育サイクル中の遺伝子発現は、従来、RNAEq、qPCR、および固定細胞顕微鏡55,66を含む破壊的な「終点」法によって行われてきた。これらの方法は貴重な情報を提供してきましたが、採用されている技術は面倒で、時間的解像度が低い5,66です。
過去10年の間に、Ctrの遺伝子操作は、プラスミド変換と変異生成77、8、98,の方法の導入と共に進んでいる。この研究では、感染の過程で個々のインクルージョンにおけるクラミジアの発達をリアルタイムで監視するプラスミドベースのシステムが開発された。RBとEB細胞型特異的プロモーターレポーターの両方を発現するクラミジア形転換体を作成した。RB特異的レポーターを、蛍光タンパク質クローバーの初期RB遺伝子ユーオ上流のプロモーターを融合させることにより構築した。EUOは、後期EB関連遺伝子10のサブセットを抑制する転写調節因子である。HCtBのプロモーターは、EBヌクレオイド縮合に関与するヒストン様タンパク質をコードし、mKate2(RFP)の上流に直接クローン化し、EB特異的レポーター11を作成した。hctBプロムmKate2/ユーオプロムクローバーのバックボーンはp2TK2SW27でした.hctBおよびeuoプロモーターを、Ctr-L2ゲノムDNAから増幅した。各プロモーター配列は、指定されたクラミジア遺伝子に対する予測転写開始部位の上流の約100塩基対と、各ORFの最初の30ヌクレオチド(10個のアミノ酸)から構成された。蛍光FP変異体を、Ctrコドン最適化遺伝子ブロックとして商業的に得られ、各クラミジア遺伝子およびプロモーターの最初の30ヌクレオチドを有するフレームでクローニングした。incDターミネーターはmKate2の直接下流にクローン化されました。第2プロモーターレポーターは、incDターミネーターの下流に挿入した。p2TK2SW2のアンピシリン耐性遺伝子(bla)をpBam4からaadA遺伝子(スペクチノマイシン耐性)に置換した。これにより、Ctr-L2 7 に変換された最終的な構築 p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-クローバー (図 1A)が生まれました。このRB/EBレポーター株は、生細胞顕微鏡を用いた単一インクルージョン内の発達サイクルの観察を可能にした(図1B,C)。
化学変異誘発と組み合わせてプロモーターレポーター構築物を採用し、Ctr血清膜L2の変異原性集団から発達異常を示した個々のクローンを追跡および分離するためのプロトコルが考案されました。このプロトコルは、個々のクラミジアインクルージョンの直接モニタリング、時間の経過に関する遺伝子発現プロファイルの追跡、変化した発生遺伝子発現パターンを発現するクラミジアクローンの同定、およびクラミジアの個々のインクルージョンからの クラミジア のクローン分離を可能にする。
このプロトコルはクラミジアの発達に関与する遺伝子の同定のために特別に作成されたが、クラミジア遺伝的経路の任意の数を尋問するために容易に適応することができる。
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Protocol
このプロトコルで使用されるすべての Python スクリプトは Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing
1. ムタゲニズ・レポーター ・クラミジア
注: Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EBs は、このメディアが EB の代謝と EB 感染性12の維持をサポートしているので、アキセニック培地 CIP-1 でエチルメタンスルホン酸 (EMS) を使用して直接変異体化しました。
- p2TK2-hctB prom-mKate2/euo prom-CloverレポータープラスミドとペレットhctBで変換された氷上のクラミジアeuoストックを氷上で解凍し、4°Cで30分間>14,000 x gでペレットを使用します。7
注:これらの実験に使用された クラミジア 生物は、精製された30%レノグラフィン密度を1xスクロース-リン酸-グルタミン酸緩衝液(SPG)において-80°Cで凍結した。 - 上清を捨て、10 sの10%のパワーで氷上で超音波処理を行って、CIP-1バッファーの100 μLでEBペレットを再中断します。100 μLの EB 懸濁液を、変異体化および模擬処理サンプル用の 2 つの 50 μL アリコートに分割します。
- 20 mg/mL の EMS-CIP-1 溶液を別の 1.5 mL マイクロ遠心分離チューブに用意します。これを行うには、合計375 μLの合計容量で6.8 μLのEMSを追加します。
- EMS-CIP-1溶液の50 μLを変異発生のためのクラミジアアリコートの1つに加え、CIP-1の50 μLを他のクラミジアアリコートに加え、模擬突然変異誘発に対してのみ追加します。
注意: 最終EMS濃度は10 mg/mLです。クラミジア力素、EMS濃度、およびこのプロトコルで使用される暴露時間は、感染性子孫の約60〜80%の減少をもたらす。このレベルの減少は、クラミジアゲノム8当たり〜5〜20個のDNA病変に相当する。 - 室温で20分間インキュベートします。変異体化されたEBは、セクション2の単層に直接感染するために使用されます。
注意:EMSは既知の発がん性物質です。EMSに接触するすべての機器および材料は、廃棄前に24時間1 M NaOHに浸漬する必要があり、手袋は、EMS材料のプロトコルとクリーンアップ中に常に使用する必要があります。
2. 変異型Ctrのイメージング
- 変異原化Ctrのイメージングおよび単離のための宿主細胞培養
- 完全な培地の2 mLで6 x 105 Cos-7細胞(ATCC)を持つ6ウェルガラス底板を完全な培地(RPMI-1640は10%の胎児ウシ血清と10mg/mLゲンタマイシンで補う)。このガラス底板を使用して、変異原化Ctrのイメージングを行います。
- 1 mL 完全な培地で1 x 105 Cos-7 細胞 (ATCC) を使用して 24 ウェルポリスチレンプレートをシードします。目的の分離クラ ミジア の再感染のために、このポリスチレンプレートを使用してください。
- 5%CO2、37°Cで2プレートを約18時間インキュベートします。細胞が合流したら、培地を1μg/mLのシクロヘキシミドで補った完全な培地に置き換え、一晩インキュベートします。
- 変異原性Ctrで宿主細胞培養物を感染させる
- ガラス底板の5つのウェルを、1.5 mL/ウェル氷冷HBSSで変異原化したEBの〜6 x 105 で感染させる。これは、突然変異誘発により〜70%の死亡率が予想される〜0.3のMOIをもたらす。
- 残りの井戸に~2 x 105 モック変異原性EBを1.5 mL/well氷冷HBSSで感染させる。突然変異誘発がなければ、死亡率が少ないと予想され、したがって、接種の3分の1が〜0.3のMOIを達成するために使用される。
注:〜0.3のMOIは、ホスト細胞が単一のEBによって感染していることを保証し、クローン分離のために感染細胞間で十分に分離することを可能にする。 - 37 °Cで、揺れでプレートを15分間インキュベートします。
- 感染した宿主細胞を、1 mg/mLヘパリンを含むHBSSを1mg/mLのHBSSで洗浄し、その後すぐにHBSSリンスを洗います。ヘパリン洗浄を繰り返し、HBSSで2倍速くリンスし、ヘパリンが除去されるようにします。
注意:ヘパリンは、ホストセルとEB13との間の初期の静電相互作用を阻害し、逆転させることができます。ヘパリンをすすると、まだ宿主細胞に入っていないEBが除去され、感染が同期する。細胞を洗浄する場合は、ウェルの表面から細胞を取り除くことを防ぐために穏やかに行います。HBSSおよびヘパリン溶液は残留EMSを含み、廃棄前に24時間1 M NaOHを含むビーカーに入れるべきである。 - HBSSを4 mL/wellのプリウォーム(37°C)画像メディア(完全な媒体、1 μg/mLシクロヘキシミド、20 mM HEPES、フェノールレッドなし)に交換してください。
- 温暖(37°C)脱イオン化されたH2Oでインターウェルスペースを充填し、温度制御を助け、蒸発を減らします。37°Cインキュベーターでプレートを5%CO2で102時間インキュベートします。
- 顕微鏡の設置とイメージング
注:多色多重配置の自動ライブセル蛍光イメージングは、発生遺伝子発現ダイナミクスで異なるクラミジア変異体を同定するためにタイムラプス画像を収集するために使用されます。このプロトコルは、自動顕微鏡制御用のオープンソースμManagerソフトウェアパッケージを利用します14.- 顕微鏡セットアップ10時間ポスト感染を開始します。顕微鏡ステージインキュベーターを5%CO2、37°Cに設定します。2感染した6ウェルガラス底板をステージインキュベーターに入れ、サンプルサーミスタをインターウェルH2Oに挿入します。
- ハイコンテンツスクリーニング(HCS)プラグインを使用して XY ステージを調整します。 プラグインをクリックして |取得ツール |μManager 顕微鏡制御ソフトウェア(JoVE61365_screenfile1、JoVE61365_screenfile2)におけるHCSサイトジェネレータ
- 6 ウェルプレートテンプレートを選択し 、HCS プラグイン(JoVE61365_screenfile3、 JoVE61365_screenfile4)内のウェルあたり 12 の視野 (FOV) からなるイメージング位置リストを生成します。 ステージポジションリスト を開き、ステージコントロールプラグイン(JoVE61365_screenfile5、JoVE61365_screenfile6)を使用して、各FOVの初期Z位置に手動でフォーカスを設定します。セルが欠落しているか、または均一な単層を含まない任意の FOV の XY 座標を調整します。
注: 各画像のキャプチャにかかる時間のため、30 分間隔あたり最大 72 FOV を取ることができます。 - イメージングには 20x 対物レンズを使用します。この倍率により、~8個のインクルージョンをFOV当たりに画像化しながら、望ましい解像度を提供することができます。
- データ分析後に対象の包含を見つけるために使用されるように、位置リストを保存します (JoVE61365_screenfile7)。
- イメージングソフトウェアの [自動フォーカス ]オプションを使用して、自動イメージング(JoVE61365_screenfile8)のフォーカスを設定します。
- μManagerで画像ベースのオートフォーカスを使用して最も一貫したフォーカス結果を生成するには、次の選択と値を使用します。[自動フォーカスのプロパティ] ウィンドウで、ドロップダウン メニューから [OughtaFocus] を選択し、次の設定を使用します。オタフォーカス-SearchRange_μm: 350, OughtaFocus-Tolerance_μm: 0.3, OughtaFocus-エクスポージャー: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff(%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff(%): 14, OughtaFocus-ShowImages: はい, OughtaFocus-最大化: シャープエッジス,
注: クロップファクターを減らすことで自動焦点のイメージングウィンドウを小さくすると、オートフォーカスの一貫性が高くなります。「は い 」を選択すると、ユーザーは自動フォーカス画像を表示できます。 - 30分の時間間隔(JoVE61365_screenfile9)で24時間のイメージングによって発達サイクルの運動を捕捉する。12-36 HPIの間のイメージングは クラミジア が発達周期を完了することを保障するが、宿主細胞をライゼしない。
- GFPチャンネルとRFPチャンネルでそれぞれ4%と18%の強度で250 msの露出を持つセル単層を画像化する(JoVE61365_screenfile10)。514/30 nmバンドパスエミッションフィルタを使用して470 nmで励起してクローバー(GFP)信号を検出します。595 nm で、641/75 nm のバンドパスエミッション フィルタを使用して、mKate2(RFP)信号を検出します。
注:励起強度を最小限に抑えることは、 クラミジアへのフルオロフォア光化と光毒性を最小限に抑えるために重要です。200~300 ms露光で解決された画像を生成するための最小励起強度は、パイロット研究において経験的に決定されるべきである。 - フォーカス範囲がフォーカスの範囲で複数の Z スライスをキャプチャします。この実験では、20倍の倍率で、10 μmのステップ(JoVE61365_screenfile11)で4つのスライスで達成した。
- 集録ウィンドウで複数のスライスをイメージングする場合は、[相対 Z]を選択します。相対 Z オプションでは、イメージング位置リストに保存されている Z 平面の位置を、次の時間間隔の開始点として使用します。蛍光イメージングチャンネルに適切なZオフセット値を入力します(JoVE61365_screenfile12)。
注:画像ベースの焦点合わせシステムは不完全であり、24時間のイメージング期間にわたって、フォーカスドリフトにつながります。各時間ポイントに対して3~4Zの焦点面を撮影することで、焦点を合わせる画像が維持されていることがわかった。蛍光画像チャンネルとDICチャンネルの焦点面の違いを補正するには、Zオフセットが必要です。このZオフセットの経験的決定が必要になります。 - ルート ディレクトリを選択し、実験に名前を付けて画像を保存します。μManagerイメージスタックファイルオプションを使用して、イメージを tiff スタックファイルとして保存します(JoVE61365_screenfile13)。
- [マルチ D 取得] ウィンドウの [ 取得コメント ] ボックスに実験の詳細を記録します(JoVE61365_screenfile13)。すなわち、まあA1:未処理のコントロール。まあA2-3とB1-3:EMSミュータント。イメージング:12-36HPI。12 HPIで画像取得を開始します。
メモ:μManagerを使用している場合は、実験完了後にプログラム、実験用セットアップ、および顕微鏡ハードウェアを実行したままにしておきます。突然変異体化された集団の分析が完了すると、イメージングサイトは包含隔離のために再検討される。
3. 変異型クラミジア を同定し、発育性の異型を持つ分離
- フォーカス内イメージ スタックの作成
- タイム ポイントごとに 4 Z スライスを含む保存済みイメージ データを使用して、Z スタックから最もフォーカスの多い画像を抽出します。尖度測定オプションを使用する (分析 |ImageJ/FIJIで測定を行い、最もフォーカスが多い Z スライス(最高の尖度スコア)を自動的に特定し、フォーカス中の画像だけで新しいイメージスタックを作成します。Python スクリプトは、このプロセスを自動化するための補助ファイル (Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py) として含まれています。
- 個々のインクルージョンにおける蛍光発現の定量
注:2人のレポーターの発現キネティクスを定量化するには、オープンソース画像解析アプリケーションImageJ / FIJIとプラグインTrackmate15を使用します。Trackmateは「スポット」(この場合は包含に対応)を識別し、時間の経過に伴う各包含のX、Y位置および信号強度を記録するタイムラプス画像スタックを介してそれらを追跡する(JoVE61365_screenfile14)。この情報は CSV ファイルとして保存され、分析用にカスタム Python ノートブックにインポートされます。- プラグインをクリックして、バイオフォーマットインポーターを使用してImageJ / FIJIでフォーカスZ縮小画像スタックを開く |バイオフォーマット |バイオフォーマット輸入者. [ハイパースタック と コンポジット (JoVE61365_screenfile15、JoVE61365_screenfile16)]を選択します。
- プロセスをクリックして画像の背景を減算 | ローリングボール半径50.0ピクセルを使用して背景を引き、彩度ピクセルのコントラストを0.3%に引き上げます(プロセス |コントラストを強調する。イメージ値に 10.0 を掛ける (プロセス |数学 |乗算) (JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22)。
- トラックメイト (プラグイン |トラッキング |Trackmate)を選択し、48 ピクセルの推定ブロブ直径を選択します(イメージング終了時の包含のサイズに基づいて経験的に決定されます)。[ 最大距離のリンク] と [ギャップを閉じる最大距離 ] を 8.0 ピクセルに設定し、 ギャップを閉じる最大フレーム ギャップ を 1(JoVE61365_screenfile23 - JoVE61365_screenfile25) に設定して、フラグメント化されていない包含トラックを作成します。
注:トラックメイトがサイクル全体にわたってインクルージョンを識別して追跡する能力を向上させるために、ImageJ / FIJIの画像数学関数を使用して euopromと hctBプロムチャンネルを一緒に追加することで、別の画像チャンネルが作成されます。このチャネルは、トラックメイトによって、一定期間にわたって包含を識別してフォローするために使用されます。 次に、euoprom および hctBプロム チャネルの蛍光値がチャネル 2 および 3 に記録されます。 - 最小継続時間を満たすレコード トラック: トラックの継続時間: 20 (JoVE61365_screenfile26)。トラックを分析し、 トラック統計のスポット を CSV ファイルとして保存します (JoVE61365_screenfile27)。
注: このプロセスは、補足データ (TrackMate_Zreduced_JOVE.py) に用意されているカスタム Python スクリプトを使用して自動化されています。
- 開発プロファイルの変更を含むインクルージョントラックの識別
注: 含まれる包含を識別するには Chlamydia 開発プロファイルが変更された場合、各インクルージョントラックはPythonノートブックを使用して視覚化されました。これらの可視化により、モック処理された集団とは異なる運動遺伝子発現プロファイルを持つインクルージョンの同定が可能になる。変更された開発プログラミングとの包含の識別に使用されるPythonノートブックは、補足データ(EMS_Screenマークダウン).- EMS_Screenマークダウン Python ノートブックの[インポート] セルを使用して、追跡対象のCSV ファイルの [スポット] からパンダ データ フレームに含めるトラック データをインポートします。
- ベースラインは、ベースライン減算セルを使用して、トラックの残りの値から各トラックの最小値を 減算 することで、各トラックを補正します。[Pickle として保存] セルを使用して、結果の値を ピクルス ファイルとして保存 します。これにより、ベースライン減算後にチャネル値が永久に保存され、後で取得されます。
注: ベースライン減算では、すべての包含の開始蛍光強度がゼロに設定されます。 - 蛍光プロファイルが完全にキャプチャされない可能性があるため、 フィルタエッジ セルを使用して、FOVの端付近のインクルージョンから痕跡を排除します。これらのトレースは、偽陽性の発達プロファイルを生成する可能性があります。
- 実験の開始時間とイメージング時間間隔を使用して、イメージスライスから時間(開始時間、間隔)の値にフレーム(totalFrames)値をタイムラプスキャリブレーションセルでキャリブレーションします。[トラック期間フィルター] セルを使用して、実験の最後の 20 時間 (16 -36 HPI) に及んでいないトレースを除外して、部分的な包含読み込みを除外します。
- [処理を割り当て]セルを使用して、実験条件によって個々のデータ フレームにトラックを分割します。[成長フィルタ]セルを使用して十分な成長を示すインクルージョン用のフィルタ。[増殖フィルタ]セルでは、コードの最後の2行内の値を変更して、ユーオウエディングチャネルの蛍光強度しきい値を経験的に設定します。これは成長しなかったクラミジアを除外します。
注: しきい値フィルターを設定する際は注意が必要ですが、フィルタが低すぎると、結果として得られる散布図は騒がしくなり、フィルタリングが高すぎると重要な変異体が排除される可能性があります。 - EMS によって引き起こされる死亡率の割合を計算する場合、変異体化されたトラックの数/井戸をモック処理されたトラック/ウェルの数で割ります。モック処理されたトラックの数に初期希釈係数 3 を掛けて、モック処理されたトラック/ウェルの数を計算します。このタスクを実行するには、[ 含めるトラックのカウント ] と [ 死亡率のパーセント ] セルを使用します。
- [計算]セルを使用して、各トラックの早期および後期の両方のレポーターの半最大式までの時間を 計算 します。これらの値は、変異体化された集団と模擬母集団を比較して発達変異体を同定するために使用される。
- [ハーフマックスプロット]セル内では、ボケプロットパッケージを使用して各プロモーターの半最大発現までの時間を視覚化し、euoprom時間をhctBpromの表現に対して半最大式にグラフ化します。ボケインタラクティブトラックIDエクスプローラを使用して、モック処理された散乱雲の外に落ちる変異体集団から包含を識別します。対象物の含点の FOV 座標と XY 座標をメモします (図 2)。
注: 各クローンの検証と統計的評価が後で実行されるように、コントロール クラウドの外に視覚的に含める候補を選択します。 - アニメーションプロットセル内では、プロットツールPlotly16を使用してhctBプロムに対するユーオプロムの発現強度をグラフ化することによって、プロモーター発現キネティクスの変化を時間を経て動的に視覚化します。プロットリーの散乱関数は、時間の経過に応えて遺伝子発現をアニメーション化するために使用されます (ビデオ 1)。
- 包含ロケーターセルのプロットアニメーション グラフからスナップショットを視覚化し、bokeh パッケージを使用して特定の時点 (28 HPI) でユーオプロムとhctBprom 式をプロットします (図 3)。ステップ 3.3.8 で説明したように、変異体集団から包含を識別する。
注:この分析は、インクルージョンがまだ拡大しており、感染後に宿主細胞を約48時間にライセし始めるので、迅速に実行する必要があります(<4 h)。
- 発達変異体を対象物から分離する
注: クラミジア を遺伝子調節の変化を表示すると決定されたインクルージョンから単離するために、毛細血管針を有するマイクロマニピュレータが採用された。関心のある包含のウェルID、FOVおよびX、Y座標は、セクション3.3のデータ可視化を使用して決定された。- 毛細管の中央を炎にかざし、毛細管の両端を引っ張って毛細管の両端を分離して準備します。引っ張られた毛細血管の針に、引っ張られた先端を顕微鏡のスライドで壊して開口を作ります。針を壊すために、閉じた先端を顕微鏡スライドの曇った部分に斜めで置き、圧力をかける。
注:キャピラリーチューブの仕様は1.0 mm O.D.、0.5 mmのI.D.でした。 - 針の開口部が顕微鏡の下での包含の大きさ、20xの目的であることを確認してください。
- 候補包物の分離のためのプレプル〜25-30毛細血管針(含まれる1針あたり1本)。
- マイクロインジェクターに鉱物油を充填して、気泡が存在しない。
- マイクロインジェクターにガラスの毛細血管針を取り付け、針の先端に油を吐き出し、気泡を取り除きます。毛細血管の針を完全な媒体に入れ、途中でメディアを描きます。毛細血管の針を媒体で満たすことは井戸のオイル汚染を防ぐ。
- ステップ 2.3.5 から μManager で保存された位置リストを使用して、Python ビジュアライゼーション ノートブックで特定された関心のある対象を含む井戸と FOV に移行します。
- マイクロマニピュレーターのジョイスティックを使用して、毛細血管を対象物の XY 座標に局在します。
- 595 nmの励起チャネルを使用して、抽出用のEBと、針の視覚化のための位相/DIC白色光チャネルを視覚化します。キャピラリー針を介してインクルージョンに導き、封入を破裂させ、マイクロインジェクターを使用してEBを毛細血管に引き込みます。
- ステップ2.1.2で調製した24ウェルポリスチレンプレートの単一のウェルに毛細血管針からEBを排出します。毛細血管の針を取り外し、次の包含抽出のために新鮮な毛細血管の針と交換します。すべての候補の対象について、セクション 3.4 を繰り返します。
注:拡張のために、そして再イメージングのための十分な高いチターを確保するために、変異体分離株を5%CO2、37°Cインキュベーターで、宿主細胞の大部分が感染するまで(〜1週間)。2異なる分離株が異なる成長率を示す可能性があるため、井戸は注意深く監視する必要があります。
- 毛細管の中央を炎にかざし、毛細管の両端を引っ張って毛細管の両端を分離して準備します。引っ張られた毛細血管の針に、引っ張られた先端を顕微鏡のスライドで壊して開口を作ります。針を壊すために、閉じた先端を顕微鏡スライドの曇った部分に斜めで置き、圧力をかける。
- 収穫変異株
- 氷上では、1 mLマイクロピペットチップで掻き取ることによって感染した単層を破壊する。培地、細胞デブリ、クラ ミジア を1.5mLマイクロ遠心分離チューブに放出します。
- 4 °Cで30分間の遠心分離によるペレット クラミジア , > 14,000 x g.上清を取り除き、氷冷1x SPGの75 μLでペレットを再懸濁します。アリコートを3本の1.5 mLスクリューキャップマイクロ遠心分離チューブに入る。-80°Cで保管してください。
4. 変異型分離型の検証
- 変異原性分離株をイメージングするための宿主細胞培養
- 96ウェルガラス底板に1.6 x 104 Cos-7セル(ATCC)を1ウェルあたり100μLの完全な媒体でシードします。5%CO2、372°Cでインキュベートする。 細胞は約24時間で合流に達するはずです。細胞がコンフルエントになった後、培地を1μg/mLシクロヘキシミドで補った完全な培地に置き換え、一晩インキュベートする。
- フェノールチ検証のための候補分離株で細胞を感染させる
- 氷の上に変異クローンと野生型 クラミジア を解凍します。
- 準備された96ウェルプレートにおいて、分離株当たり1カラム(11カラム)を用いて、変異型分離株の2倍の連続希釈を行う。100 μl HBSS で 1:20 の初期希釈から始めます。
メモ: クラミジア のシリアル希釈は、変異体サンプルがMOI < 1で画像化されることを保証するために行われます。 - 残りの(12番目の)カラムをMOI〜0.5で野生型 クラミジア に感染させる。
注意:ワイルドタイプ クラミジア は、変異原性分離株との比較のためのコントロールとして使用されます。 - 37 °Cで15分間のロッキングをインキュベートします。
- 感染した宿主細胞を、セクション2.2で規定されているように、ヘパリンおよびHBSSの1mg/mLで前温(37°C)HBSSで洗浄する。
- プリウォーム(37°C)イメージングメディアのウェルあたり200 μLに交換してください。
- 温め込まれた(37°C)脱イオンH2Oでインターウェルスペースを充填します。
- 5%CO2、37°Cで10時間インキュベートする。2
- 顕微鏡のセットアップ
注: 顕微鏡のセットアップについてはセクション 2.3 を参照してください、このセクションは必要なセットアップの変更のみを含みます。- HCSプラグインから96 ウェルプレートテンプレートを選択します。
- MOI<1に対応するウェルを各変異体分離物について経験的に決定する。ユープロモーターの制御下でクローバー発現は、含包の早期可視化を可能にする〜10 HPIで観察可能である(図1B)。
- MOI<1に対応する変異株ごとに3つのウェルを選択し、ウェル当たり2つのFOVからなるイメージング位置リストを生成する。
注: ハードウェアの制約により、1時間間隔で撮影できる画像は 72 個のみで、12 サンプルの場合は 12 個のサンプルがイメージ化された場合、1 回の場合に 2 つのイメージング サイトを使用して、1 株当たり 3 つの希釈 (ウェル) に相当します。 - 各変異体の発達サイクルを、12 HPIから30分の時間間隔で36時間に分離して記録する。
- [取得コメント] ボックスに、実験の詳細 を記録 します。i. e., まあABC1: 野生型制御.まあABC2:変異株1、ABC3:変異株2など.イメージング:12-48 HPI。
- 12 HPIで画像取得を開始します。
5. 分離検査のためのデータ分析
- インフォーカス画像スタックを作成し、個々のインクルージョンで蛍光表現を定量化する
- セクション3.1から3.2で規定されているように、各インクルージョンの蛍光強度トレースを生成します。
- Ctr変異原性分離株を確認する
注: 変異型分離物の発達プロファイルの変化を検証するために、式プロファイルは Python ノートブックを使用してワイルドタイプ式プロファイルと比較されます。開発プログラミングを変更した変異クローンの検証に使用されるPythonノートブックは、補足データ(clone_check-Markdown)に提供されています。- セクション 3.3 で行ったように、clone_checkマークダウン Python ノートブックに含めるトレース データをインポートしてフィルター処理します。
- [平均と STD の計算] セルを使用して、各分離型および野生型コントロールの母集団のトレースから 平均と標準偏差 (STD) を計算します。
- グラフIso対WT細胞プロットでは、各変異クローンの平均値(SEM)の平均値と標準誤差をワイルドタイプコントロールに対してプロットし、変異式キネティクスが野生型サンプルから発散しているかどうかを判定する(図4)。
- セクション3.3で行われた散布図を用いて変異型の痕跡をプロットし、それらを野生型包含トレースと比較することによって、分離された突然変異体集団がクローン型であるかどうかを判断する(ステップ3.3.7-3.3.10) (図2、図3)。分離体が混合母集団である場合、プロットは野生型でオーバーレイする1つの集団と野生型散乱雲の外側の2番目の異なる集団を示します。母集団が混合して見える場合、変異体はセクション3.4で説明した元の手順を使用して再分離することができます。
注: 分離株の発達プロファイルが野生型と統計的に異なるかどうかを判断するには、各分離株の曲線を ANOVA を使用して野生型と比較する必要があります。
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Representative Results
私たちのプロモーターレポータークラミジア株の直接EMS突然変異誘発は、感染性の〜75%の減少をもたらした。記載された生細胞イメージングプロトコルを用いて、〜600個のインクルージョンを24時間にわたって画像化および追跡した。各インクルージョンにおける両方のレポーターの蛍光発現キネティクスを、カスタムPythonノートブックスクリプトを使用して可視化しました。分離のための変異原性クラミジア候補を同定するために2つの視覚化アプローチが実装された。第1の方法論(ステップ3.3.8)は、インタラクティブな散乱プロットで個々のクラミジア分離物からのユーオおよびhctBプロモーターの半最大発現までの時間を視覚化する(図2)。模倣された散乱雲の外に落ちた場合、インクルージョンは隔離のために特定されました。候補のクローンは、視覚的にコントロール クラウドの外に落ちた選択されました。各クローンの検証は、その後行った。クローンA3-6-67およびB3-8-58は、ユープロモーターから半最大発現までの短い時間とhctBの時間の長い時間を生成するので、分離のために選択された(図2)。
変化した動態を伴う包含物を同定するための第2の可視化方法(ステップ3.3.9-10)は、2つのプロモーターからの動的遺伝子発現の可視化に基づいて個々の包含物を同定する(Video 1)。繰り返しますが、コントロールインクルージョンとは著しく異なる動的包含表現パターンを持つ候補クローンが選ばれました。B3-6-62は、23と29 HPIの間の ユーオ プロモーターからの蛍光蓄積の増加のために選ばれた(ビデオ1)。対象の包含の位置を特定するために、アニメーション化されたグラフのスナップショットが作成されました (図 3)。
2 つの視覚化方法を使用して、分離のために合計 24 個の包含が特定されました。24の全隔離株のうち、10は再テスト時に差動態を示した。これらの分離株は3つのフェーチのカテゴリーに分類された。8個の分離株は、クローンA3-6-67によって示されるように、RB-EB変換の時間に対応する、〜24 HPIでの減少したユーオウエウプロウ発現を示した(図4A)。残りの2つのクローンは独特の表現型プロファイルを示し、B3-8-58分離株も〜24 HPIでのユーオウエマー発現の減少を示したが、hctBprom発現の全体的な増加(図4B)、B3-6-62は、両方のプロモーターから蛍光の増加レベルを発現させた(図4C)。変異型B3-6-62の生細胞顕微鏡写真の分析は、宿主細胞のライシスが野生型感染細胞よりもずっと早くこの変異体に感染した細胞で起こったことを明らかにした(ビデオ2)。
図1 Ctrプロモーターレポーターによる細胞型の開発をモニタリングする
()プロモーターレポーター構築物の模式図, p2TK2-hctBプロム mKate2/euoプロムクローバー.(B) Ctrにおける ユーオプロムクローバーと hctBprom-mKate2発現のライブセル顕微鏡写真 10 HPI (C) 36 HPIで エウオプロムクローバーと hctBプロムmKate2を発現するCtrのライブセル顕微鏡写真。スケールバー:20 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:各プロモーターの発現の半分までの時間を可視化してA3-6-67およびB3-8-58の代表的な分離株の同定。
インタラクティブグラフは、模擬処理された制御散乱雲とは異なる発現プロファイルを示す変異原性クラミジアを識別するために使用されます。グラフ上の各スポットは、1 つの包含を表します。包含スポットA3-6-67およびB3-8-58は、それらが模擬処理された雲の外に落ちるように強調され、両方ともhctBの半分最大発現に長い時間と組み合わせてユープロモーターの半分の最大発現に短い時間を示す。ユーオプロム:X軸、hctBプロム:y軸。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 包含場所の識別のための対話型スナップショット。
提示されたグラフは、アニメーション化された散布図(ビデオ1)からの28 HPIのスナップショットであり、対象物の含点のFOVとXY座標位置を特定するために使用された。B3-6-62は、アニメーションの散布図からの分離のために選択されたとおりに示されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:代表的変異株の検証
変異原性分離株A3-6、B3-8、およびB3-6の発達プロファイル。(A)A3-6変異体は、約24 HPIでのユーオウエディング発現の低下を示す。(B) B3-8変異体分離株は、約24 HPIでのユーオウエウ発現の低下を示すが、hctBのウエディング発現の全体的な増加を示す。(C)B3-6分離株は、約40 HPIで両方のプロモーターで発現の突然の損失に続いて、ユーオウエウプロウ発現の増加レベルを示す。各サンプルは、指定された母集団の平均である n > 25 です。クラウドはSEMを表します。
図5 プロモーターレポーターCtrの指示的な前方遺伝子解析のためのワークフロー:
Ctr-L2-p2TK2-hctB prom-mKate2/euo prom-クローバーEBは、無菌培地CIP-1においてEMSと直接変異体化された。hctBeuo変異体化されたEBを用いて、画像化および蛍光発現解析のためにCos-7細胞単層に感染した。変化した発達力学を表現するクラミジアは、インタラクティブグラフで視覚化することによって同定された。発達プロファイルが変化したインクルージョンは、マイクロマニピュレータを使用して分離されました。分離株の型は再感染時に検証された。変異株は、型素型に関連するDNA病変を同定するためにWGSに供される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:動的遺伝子発現プロットを用いた異なる発現運動を示す変異原生 クラミジア の同定。 個々の包含に対する ユーオ および hctB のプロモーター発現をプロットし、変化した発現ダイナミクスを有する変異原発 クラミジア を同定するために時間をかけて可視化した。B3-6-62は、野生型雲と比較してより高い ユーオウエウプロン発現を示すため、分離のために選ばれました。 ユーオプロム:X軸 、hctBプロム:y軸。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
ビデオ2:代表的変異体B3-6-62は、早期の宿主細胞のリシスを引き起こす。 B3-6-62感染宿主細胞のタイムラプス生細胞顕微鏡写真は、早期のリシス(〜40 HPI)を受ける。 こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。
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Discussion
クラミジア発達サイクルを制御するメカニズムを解剖することは、現在利用可能な遺伝的ツールの限界によって妨げられています。プロモーターレポーターのクラミジアを生細胞自動顕微鏡と組み合わせて、24時間にわたって個々のインクルージョンにおける細胞型の発達を監視できるシステムが構築されました。このシステムは、化学的変異誘発と直接包含分離との組み合わせにより、変化した発達プロファイルを発現するクラミジアを迅速かつクローン的に選択する方法を確立した(図5)。
クラミジア性脳は、細胞内イオン条件およびエネルギー源55,1212を備えた場合、宿主の外で代謝的に活性である。このEBアキセニック代謝を利用して、宿主細胞外の精製EBを変異させる。このプロトコルでは、EB を代謝して EMS を使用して直接変異した。EMS治療はEBの生存率を効果的に低下させ、予測通り可変発生性運動を生み出すEBを生成することが観察された。
記載されたEMS変異生成プロトコルは、〜5〜20個のDNA変化/EBを生成すると推定される。記載された生細胞顕微鏡のワークフローは、30分間隔で、視野(FOV)および72 FOVごとに〜8個の包含物をイメージングすることが可能です。したがって、1回の実行で〜3000〜10,000個の突然変異の影響を可視化できると推定される。複数の実行(3-5)は、9,000-50,000突然変異の効果の可視化をもたらす。Ctr-L2ゲノムは、約850個の遺伝子をコードし、このプロトコルが遺伝子当たり10個の突然変異の可視化をもたらすことを示唆している。これらの推定値は、ゲノムカバレッジは完全ではないが、十分であるべきであることを示している。
このプロトコルの強みは、ほぼリアルタイムで単一の包含解像度で複数のプロモーターレポーターの発現運動を追跡し、記録する能力です。フォワード遺伝学は、観察可能なフェノタイプとクローン分離に依存しています。 クラミジア の前方遺伝学の過去の方法は、静的な観察と寒天オーバーレイ8で飾るに依存していました.我々の方法論により、動的プロモーター活性は、発達サイクルを通して記録され、その後可視化され、遺伝子発現キネティクスが変化した クラミジア を含むインクルージョンを同定する。複数のパラメータを使用して候補包含を同定する(すなわち、一定の時点で半最大発現および全蛍光強度までの時間)は、異なる発達運動を示す異なる突然変異プールをもたらす。これらの クラミジア は、別々の遺伝的経路の調節に影響を与えるユニークな突然変異を有する可能性が高い。これらのプロファイルがライブで記録され、数時間後に視覚化することができるという事実は、感染した単層から関心のある包含物を見つけて分離する時間を可能にする。開発中の遺伝子発現ダイナミクスに焦点を当てましたが、代替遺伝子レポーターを使用して他の調節経路をプローブすることができます。
尋問されている遺伝的経路に応じて、宿主細胞にシクロヘキシミドを加えて注意する必要があります。シクロヘキシミドによるインキュベーションは、宿主細胞の複製を遮断することによって単層のイメージング特性を改善するが、;この効果は、宿主タンパク質合成を阻害することによって達成される。デノボ宿主タンパク質合成の阻害は、尋ねられた質問に応じて、遺伝的スクリーンの結果に影響を与える可能性があります。
光毒性と光漂白は、長期のタイムラプス顕微鏡における大きなハードルです。これらの問題を克服するために、各蛍光タンパク質の特定の特性を実験前に考慮する必要があります。クローバーとmKate2は短い成熟時間(20〜30 m)がフォトテーブルであり、比較的大きな量子収率17,18,18を示す。これらの性質により、励起強度と露光時間の短縮が可能となり、発生する光毒性および光漂白の量を減少させます。この光のスペクトルはクラミジアに対する光毒性が低かったので、位相/DIC白色光チャネルは自動焦点に使用された。
このプロトコルでは、EMSを化学ミュータゲンとして使用した。EMS は G:C から A:T への遷移をグアニン アルキル化19で起こします。しかし、このプロトコルは、他の種類のゲノム突然変異を誘発することができる代替変異原を含むように拡張することができる。例えば、アクリジンは、インデルを誘導するDNAインターカロリング化合物のクラスであり、フレームシフトの可能性が高まり、したがってヌル突然変異20である。
クラミジア性形質転換技術の進歩に伴い、表現型相補基に関連する変異遺伝子は、遺伝子型・表現型リンケージ9の検証のために挿入遺伝子破壊および遺伝的相補を介してノックアウトすることができる。RBをEBにブロックする突然変異体を回復することは、目的の突然変異が宿主細胞を再感染させることができないクラミジアを産生する可能性があるため、問題となる可能性がある。この技術は、統計的会合(GWAS)によって発達遺伝子を同定するように改変することができる。単離されたインクルージョンからのクラミジアのゲノムは、拡張および検証なしに直接配列することができる。この手法の高スループットの性質により、統計的な関連付けが可能になります。繰り返しますが、これらの関連の検証は、遺伝子の破壊と補完9を介してテストすることができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
CIP-1無数のメディアを供給してくれたワシントン州立大学のアンダース・オムズランド博士に感謝します。この作業は、NIH助成金R01AI130072、R21AI135691およびR21AI113617によって支えられた。追加のサポートは、彼らのNIH助成金P20GM104420を通じてアイダホ大学とモデリング複雑な相互作用センターからのスタートアップ資金によって提供されました.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
References
- AbdelRahman, Y., Belland, R.
- Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).
- Yu, H. H. Y., Tan, M. σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia. Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).
- Koo, I., Stephens, R. A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).
- Grieshaber, S., et al. Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity. Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065 (2018).
- Belland, R., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Nguyen, B., Valdivia, R. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. MBio. 7 (1), 01817 (2016).
- Rosario, C. J., Tan, M. The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes. Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).
- Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).
- Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).
- Su, H., et al. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).
- Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14-20 (2010).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Plotly Technologies Inc. Collaborative data science. , Montréal, QC. https://plot.ly (2015).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).
- Sega, G. A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate. Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).
- Ferguson, L., Denny, W. Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands. Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).
