Summary
Этот протокол использует флуоресцентные промоутер-репортеры, живая микроскопия клеток, и индивидуальное включение экстракции в направленном вперед генетический подход для выявления и изоляции развития мутантов Chlamydia trachomatis.
Abstract
Внутриклеточный бактериальный патоген Chlamydia trachomatis проходит цикл развития, состоящий из двух морфологически дискретных форм развития. Невоспроизводимое элементарное тело (EB) инициирует заражение хозяина. Оказавшись внутри, EB дифференцирует в тело срешы (RB). ЗАТЕМ RB проходит несколько раундов репликации, прежде чем дифференцировать обратно в инфекционную форму EB. Этот цикл имеет важное значение для выживания хламидий, так как неспособность переключаться между типами клеток предотвращает вторжение или репликацию хозяина.
Ограничения в генетических методах из-за обязательного внутриклеточного характера хламидиоза препятствовали идентификации молекулярных механизмов, участвующих в развитии клеточного типа. Мы разработали новую двойную систему плазмидного промоутера-репортера, которая в сочетании с 7-клеточной микроскопией позволяет осуществлять визуализацию переключения типа клеток в режиме реального времени. Для выявления генов, участвующих в регуляции развития клеточного типа, живая система промоутера-репортера была использована для развития передового генетического подхода путем объединения химического мутагенеза двойного штамма репортера, визуализации и отслеживания хламидиоза с измененной кинетикой развития, за которой последовала клональная изоляция мутантов. Этот передний генетический рабочий процесс является гибким инструментом, который может быть изменен для направленного допроса в широкий спектр генетических путей.
Introduction
Chlamydia trachomatis (Ctr) является обязательным внутриклеточным патогеном, который прогрессирует через двухфазный цикл развития, который необходим для его выживания и распространения1. Этот цикл состоит из двух форм развития, элементарного тела (EB) и тела сгностика (RB). EB является репликация некомпетентным, но посредни в средствах клеточного вторжения через эффектор индуцированного эндоцитоза2. Оказавшись в хосте, EB созревает до репликационого RB. РБ проводит несколько раундов репликации до преобразования обратно в EB для того, чтобы инициировать последующие раунды инфекции.
Ограниченный спектр генетических инструментов ограничил большинство хламидийных исследований биохимическими исследованиями или использованием суррогатных систем. Как следствие, выяснение регуляции генов и контроля цикла развития было трудно3,4. Одной из наиболее важных проблем в хламидийной области является временное отслеживание хламидийного цикла развития с высоким разрешением и выявление белков, участвующих в его регулировании. Выражение гена во время цикла развития хламидий традиционно выполняется разрушительными методами «конечной точки», включая RNAseq, qPCR и фиксированную клеточную микроскопию5,,6. Хотя эти методы предоставили бесценную информацию, используемые методы являются трудоемкими и имеют низкое временное разрешение5,6.
В течение последнего десятилетия, генетические манипуляции Ctr прогрессировала с введением плазмидной трансформации и методы для мутагенеза7,8,9. Для этого исследования была разработана плазмидная система для мониторинга развития хламидий в отдельных включениях в режиме реального времени в течение инфекции. Хламидиальный трансформант был создан, что выразил как РБ и EB ячейки типа конкретных промоутер-репортер. RB конкретных репортер был построен путем слияния промоутер раннего гена РБ euo вверх по течению флуоресцентного белка клевера. EUO является транскрипционного регулятора, который подавляет подмножество поздних ЕБ связанных генов10. Промоутер hctB, который кодирует гистоноподобный белок, участвующий в конденсации Э.Б. нуклеоида, был клонирован непосредственно вверх по течению mKate2 (RFP) для создания специального репортераEB 11. Основой для hctBвыпускного-mKate2/euoprom-Clover был p2TK2SW27. Промоутеры HCTB и euo были усилены геномной ДНК Ctr-L2. Каждая последовательность промоутеров состояла из 100 базовых пар вверх по течению от прогнозируемого места начала транскрипции для указанного хламидиального гена плюс первые 30 нуклеотида (10 аминокислот) соответствующего ORF. Флуоресцентные варианты FP были коммерчески получены как Ctr codon оптимизированные блокы гена и клонированы в кадре с первыми 30 нуклеотидами каждого хламидиального гена и промотора. Терминатор incD был клонирован непосредственно вниз по течению от mKate2. Второй промоутер-репортер был вставлен вниз по течению от incD терминатора. Ген резистентности ампициллина(bla)в p2TK2SW2 был заменен геном аада (Сопротивление Spectinomycin) от pBam4. Это привело к окончательной конструкции p2TK2-hctBвыпускного вечера-mKate2/euoprom-Clover(рисунок 1A),которая была преобразована в Ctr-L27. Это РБ / EB репортер штамм позволил для наблюдения цикла развития в рамках одного включения с использованием живоклеточной микроскопии (Рисунок 1B,C).
Используя наш промоутер-репортер построить в сочетании с химическим мутагенезом, протокол был разработан для отслеживания и изоляции отдельных клонов, которые выставлены отклонения развития от мутагенизированных популяций Ctr serovar L2. Этот протокол позволяет осуществлять прямой мониторинг отдельных хламидийных включений, отслеживать профили экспрессии генов с течением времени, выявлять хламидидиальные клоны, выражаюющие измененную модель экспрессии генов развития, и клональную изоляцию хламидиоза от отдельных включений.
Хотя этот протокол был создан специально для выявления генов, участвующих в развитии хламидий, он может быть легко адаптирован для допроса любого количества хламидийных генетических путей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все скрипты Python, используемые в этом протоколе, доступны на Github https://github.com/SGrasshopper/Live-cell-data-processing
1. Мутагениз Репортер Хламидиоз
ПРИМЕЧАНИЕ: Ctr-L2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EBs были непосредственно мутагенизованы с использованием этилового метана (EMS) в axenic media CIP-1, поскольку это средство поддерживает обмен EB и поддержание инфекционной способностиЕБ 12.
- Оттепель хламидиальный запас на льду, содержащий 3 х 107 EBs преобразованы с p2TK2-hctBвыпускного вечера-mKate2/euoprom-Clover репортер плазмид и гранулы на йgt;14,000 х г в течение 30 мин при 4 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хламидиоз организмов, используемых для этих экспериментов были 30% плотности ренографина очищены и заморожены при -80 градусов в 1x сахарозы-фосфат-глютамат буфер (SPG). - Отбросьте супернатант и переотверните гранулы EB в 100 мл буфера CIP-1 с звуковой на льду при 10% мощности в течение 10 с. Разделите 100 МЛ eb подвески на два 50 l aliquots для мутагенизированных и макет обработанных образцов.
- Приготовьте 20 мг/мл раствора EMS-CIP-1 в отдельной трубке микроцентрифуги 1,5 мл. Для этого добавьте 6,8 МЛ EMS в общем объеме 375 МЛ.
- Добавьте 50 МЛ раствора EMS-CIP-1 в один из хламидиальных аликоктов для мутагенеза и 50 МЛ CIP-1 только к другому хламидиаю аликоту для макета мутагенеза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация EMS составляет 10 мг/мл. Хламидиальный титр, концентрация EMS и время воздействия, используемое в этом протоколе, приводят примерно к 60-80% снижению инфекционного потомства. Этот уровень сокращения соответствует 5-20 поражениям ДНК на хламидийный геном8. - Инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре. Мутагенизированные ЭБ будут использоваться непосредственно для заражения монослой в разделе 2.
ВНИМАНИЕ: EMS является известным канцерогеном. Все оборудование и материалы, которые вступают в контакт с EMS должны быть пропитаны в 1 M NaOH за 24 ч до удаления, перчатки должны быть использованы в любое время во время протокола и очистки материалов EMS.
2. Изображение мутанта Ctr
- Культура клеток-хозяев для визуализации и изоляции мутагенизированного Ctr
- Семя 6 хорошо стекла нижней пластины с 6 х 105 Cos-7 клеток (ATCC) на хорошо в 2 мл полного носителя (RPMI-1640 дополнен 10% плода бычьей сыворотки и 10 мг / мЛ гентамицин). Используйте эту стеклянную нижнюю пластину для изображения мутагенизированной Ctr.
- Семя 24 хорошо полистирол пластины с 1 х 105 Cos-7 клетки (ATCC) на хорошо в 1 мл полной связи. Используйте эту полистирол пластины для повторного заражения изолированных хламидиоз интересов.
- Инкубировать обе пластины при 5% CO2, 37 градусов по Цельсию примерно на 18 ч. Как только клетки достигают слияния, замените средства массовой информации полными носителями, дополненными 1 мкг/мл циклохексимида и инкубировать в одночасье.
- Заражение культуры ячейки хозяина мутагенизированным Ctr
- Заразить 5 колодцев стеклянной нижней пластины с 6 х 105 мутагенизированных EBs в 1,5 м/хорошо ледяной HBSS. Это приведет к МВД в размере 0,3, как 70% смертности, как ожидается, из-за мутагенеза.
- Заразите оставшуюся скважину с помощью макета mutagenized EBs 2х 10 5 в 1,5 м/хорошо ледяной HBSS. Без мутагенеза, ожидать меньше смертности, таким образом, одна треть инокулум используется для достижения МВД в размере 0,3.
ПРИМЕЧАНИЕ: MOI 0,3 гарантирует, что клетки-хозяина инфицированы одним ЕБ и позволяет достаточное разделение между инфицированными клетками для клональной изоляции. - Обузуте пластину в течение 15 мин, с качалкой, при 37 градусов по Цельсию.
- Вымойте инфицированные клетки-хозяина с предварительно нагревается (37 кк/ С) HBSS, содержащих 1 мг / мЛ гепарин следуют сразу же HBSS полоскания. Повторите промывание гепарина, немедленно промыть 2x с HBSS, чтобы обеспечить гепарин удаляется.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гепарин ингибирует и может обратить вспять ранние электростатические взаимодействия между клеткой-хозяином и EBs13. Гепарин моет удалить ЭБ, которые еще не вошли в клетки-хозяина, синхронизации инфекции. При стирке клетки делают это осторожно, чтобы предотвратить вытеснение клеток с поверхности колодцев. HBSS и гепарин решения содержат остаточные EMS и должны быть помещены в стакан, содержащий 1 M NaOH на 24 ч до удаления. - Замените HBSS с 4 мл/хорошо предварительно обтеплученных (37 градусов по Цельсию) средств массовой информации (полный медиа, 1 мкг/мл циклохексимид, 20 мМ HEPES и не фенол красный).
- Заполните межплеоченные пространства с предварительно нагревается (37 градусов по Цельсию) deionized H2O, чтобы помочь в контроле температуры и уменьшить испарение. Инкубировать пластину при 37 кк инкубатор с 5% CO2 на 10 ч.
- Настройка микроскопа и визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Многоцветная многопозиционная автоматизированная флуоресцентная визуализация живых клеток используется для сбора временных изображений для выявления хламидийных мутантов, которые отличаются в динамике экспрессии гена развития. В этом протоколе используется пакет программного обеспечения с открытым исходным кодом «Manager» для автоматизированного управления микроскопом14.- Начните установку микроскопа 10 ч после инфекции. Установите микроскоп этап инкубатора до 5% CO2, 37 градусов по Цельсию. Поместите зараженную 6 скважин стекла нижней пластины в стадию инкубатора и вставьте образец термистора в interwell H2O.
- Калибровать этап XY с помощью плагина High Content Screening(HCS). Нажмите Плагины Инструменты приобретения Генератор сайта HCS в программном обеспечении для управления микроскопом «Manager»(JoVE61365_screenfile1, JoVE61365_screenfile2).
- Выберите шаблон 6-хорошо пластины и создайте список позиций изображений, состоящий из 12 полей зрения (FOV) на скважину в плагине HCS (JoVE61365_screenfile3, JoVE61365_screenfile4). Откройте список позиций stage и вручную сосредоточьтесь и установите исходное положение для каждого FOV с помощью плагина Stage Control(JoVE61365_screenfile5, JoVE61365_screenfile6). Отрегулируйте координаты XY любого FOV, который имеет недостающие клетки или не содержит единого монослойного.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за времени, которое требуется для каждого изображения, чтобы быть захвачены, максимальное количество 72 FOV может быть принято в 30 мин интервал. - Используйте 20-х объектив для визуализации. Это увеличение позволяет изображениям 8 включений в FOV, обеспечивая при этом желаемое разрешение.
- Сохранить список позиций, как это будет использоваться для поиска включений, представляющих интерес после анализа данных(JoVE61365_screenfile7).
- Используйте опцию Auto Focus в программном обеспечении для визуализации, чтобы установить фокус для автоматизированной визуализации(JoVE61365_screenfile8).
- Используйте следующие выделения и значения для получения наиболее согласованных результатов фокусировки с помощью автофокуса на основе изображений в «Manager». В окне свойств Autofocus выберите OughtaFocus из высадивого меню и используйте следующие настройки. OughtaFocus-SearchRange_м: 350, OughtaFocus-Tolerance_м: 0.5, OughtaFocusCropFactor: 0.3, OughtaFocus-Exposure: 20, OughtaFocus-FFTLowerCutoff (%): 2.5, OughtaFocus-FFTUpperCutoff (%): 14, OughtaFocus-ShowImages: Да, OughtaFocus-Maximize: SharpEdges, OughtaFocus-Channel: DIC.
ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшение окна автоматического фокусировки изображения за счет уменьшения фактора урожая позволяет более последовательной автоматической фокусировки. Выбор Yes для OughtaFocus-ShowImages позволяет пользователю просматривать изображение автофокуса. - Захват кинетики цикла развития путем изображения в течение 24 ч с интервалами времени 30 мин(JoVE61365_screenfile9). Изображение между 12-36 HPI гарантирует, что Хламидиоз завершает цикл развития, но не lyse клетки-хозяина.
- Изображение сотовых монослой с 250 мс воздействия на 4% и 18% интенсивности в каналах GFP и RFP, соответственно(JoVE61365_screenfile10). Обнаружить сигнал Clover (GFP) путем возбуждения на 470 нм с 514/30 нм фильтр выбросов диапазона. Обнаружить сигнал mKate2 (RFP) путем возбуждения на 595 нм и с 641/75 нм фильтра выбросов диапазона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизация интенсивности возбуждения имеет решающее значение для минимизации флюорофор фотоблего и фототоксичность хламидиоза. Минимальная интенсивность возбуждения для создания разрешенного изображения с воздействием 200-300 мс должна быть эмпирически определена в экспериментальных исследованиях. - Захват нескольких ломтиков с диапазоном фокусировки, которая заканчивается по обе стороны от среза фокуса. В этом эксперименте, при 20-кратное увеличение, это было достигнуто с 4 ломтиками на 10 мкм шаги(JoVE61365_screenfile11).
- Выберите Относительное q для изображения нескольких срезов в окне приобретения. В качестве отправной точки для следующего интервала времени в варианте «относительное» используется местоположение плоскости , сохраненное в списке положения изображения. Ввод соответствующих значений для каналов флуоресценции(JoVE61365_screenfile12).
ПРИМЕЧАНИЕ: Система фокусировки на основе изображения несовершенна, и в течение 24-часового периода визуализации это приводит к дрейфу фокуса. Было установлено, что, захватив 3-4 - координационных плоскостей для каждой точки времени в фокусе изображение было сохранено. Для устранения различий в фокусных плоскостях между флуоресцентными каналами изображения и каналом DIC необходимо смещение. Эмпирическая решимость этого сбавок будет необходима. - Сохранить изображения, выбрав корневой каталог и назвав эксперимент. Используйте опцию файла стека изображений «Manager» для сохранения изображений в виде файлов tiff стека(JoVE61365_screenfile13).
- Запишите экспериментальные детали в поле Комментарии о приобретениях в окне Multi-D Acquisition(JoVE61365_screenfile13). т.е., Ну A1: Необработанный контроль. Ну A2-3 и B1-3: EMS мутантов. Изображение: 12-36HPI. Начните приобретение изображения с 12 HPI.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании «Manager» оставьте программу, экспериментальную установку и микроскопное оборудование, работающую после завершения эксперимента. После завершения анализа мутагенизированной популяции участки изображений будут вновь рассмотрены для изоляции включения.
3. Выявление и изоляция мутагенизированного хламидиоза с измененными фенотипами развития
- Создание стека изображений в фокусе
- Извлеките наиболее фокусное изображение из стеков с помощью сохраненных данных изображений, которые содержат 4 срезов на временной момент. Используйте опцию измерения куртоза(Анализ Мера) в ImageJ / FIJI автоматически определить наиболее в фокусе ломтик (самый высокий счет куртоза) и создать новый стек изображений только с этими в фокусе изображения. Скрипт Python включен в качестве дополнительного файла(Reduce_Z_kertosis_2ch_JOVE.py)для автоматизации этого процесса.
- Количественная экспрессия флуоресценции в отдельных включениях
ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественной оценки кинетики выражения двух репортеров использовать приложение для анализа изображений с открытым исходным кодом ImageJ/FIJI и плагин Trackmate15. Trackmate определяет "пятна" (соответствующие включениям в этом случае) и следует за ними через временный стек изображения записи X, Y местоположение и интенсивность сигнала для каждого включения с течением времени(JoVE61365_screenfile14). Эта информация сохраняется в виде файла CSV и будет импортирована в пользовательский ноутбук Python для анализа.- Откройте в фокусе стек изображения в ImageJ/FIJI с помощью биоформатных импортеров, нажав на плагины Био-форматы Биоформатные импортеры. Выберите Hyperstack и Composite (JoVE61365_screenfile15, JoVE61365_screenfile16).
- Вычесть фон изображения, нажав на процесс Вычесть фон, используя радиус Rolling ball 50,0 пикселей и повысить контраст изображения до 0,3% для насыщенных пикселей(Процесс Улучшение контрастности). Умножьте значения изображения на 10.0(Процесс Математика Умножьте)(JoVE61365_screenfile17 - JoVE61365_screenfile22).
- В Trackmate(Плагины Отслеживание Trackmate), выберите предполагаемый диаметр капли 48 пикселей (эмпирически определяется на основе размера включения в конце изображения). Производить не-фрагментированные инклюзивные треки, выбрав максимальное расстояние Linking и максимальную дистанцию закрытия разрыва 8,0 пикселей и максимальный разрыв кадра Gap 1(JoVE61365_screenfile23 - JoVE61365_screenfile25).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения способности Trackmate для идентификации и отслеживания включений в течение всего цикла создается отдельный канал изображения, добавляя euoprom и hctBвыпускной каналы вместе, используя функцию математики изображения в ImageJ/FIJI. Этот канал затем используется Trackmate для идентификации и отслеживания включений с течением времени. Флуоресцентные значения каналов euoprom и hctBprom затем записываются в каналах 2 и 3. - Запись треков, которые отвечают минимальной непрерывной продолжительности: Продолжительность трека: 20(JoVE61365_screenfile26). Проанализируйте треки и сохраните пятна в статистике треков в виде файла CSV(JoVE61365_screenfile27).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс был автоматизирован с помощью пользовательского скрипта Python, который предоставляется в дополнительных данных(TrackMate_Zreduced_JOVE.py).
- Определить пути включения с измененными профилями развития
ПРИМЕЧАНИЕ: Для выявления включений, содержащих Chlamydia с измененными профилями развития, каждый трек включения был визуализированы с помощью ноутбука Python. Эти визуализации позволяют идентифицировать включения с кинетической генерации генов профилей, которые отличаются от макета обработанной популяции. Ноутбук Python, используемый для идентификации включений с измененным программированием развития, содержится в дополнительных данных (EMS_Screen-Маркдаун).- Импортируйте данные отслеживания включения из Пятен в статистике треков CSV файлы в кадр данных Pandas с помощью ячейки импорта в EMS_Screen-Markdown Python ноутбук.
- Базовый уровень корректирует каждый трек, вычитая минимальное значение каждого трека из остальных значений трека с помощью базовых вычитающихся ячеек. Сохраните полученные значения в виде файла маринованных с помощью ячейки Сохранить как маринованные. Это навсегда сохранит значения канала после вычитания базового уровня для последующего поиска.
ПРИМЕЧАНИЕ: Базовая вычитание устанавливает начальную флуоресцентную интенсивность каждого включения к нулю. - Устранить следы от включений вблизи краев FOV с помощью ячейки Фильтр Edges, как их флуоресцентные профили не могут быть полностью захвачены; эти следы могут привести к ложноположительных профилей развития.
- Калибровка кадра(totalFrames)значения от изображения к времени(startTime, интервал)значения с time-lapse калибровочной ячейкой с использованием экспериментального времени начала и интервала времени изображения. Исключите частичное включение считывает, отфильтровывая следы, которые не распространяются в течение последних 20 ч эксперимента (16-36 HPI) с помощью ячейки фильтра длительности трека.
- Отдельные треки в отдельные кадры данных экспериментальным состоянием с клеткой назначения лечения. Фильтр для включений, которые демонстрируют достаточный рост с помощью фильтра для ячейки роста. В ячейке Фильтр для роста эмпирически установите порог интенсивности флуоресценции для канала euoprom, изменив значения в течение последних двух строк кода. Это будет отфильтровысый хламидиоз, который не растет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны при установке пороговых фильтров, если фильтр слишком низок, в результате участков рассеяния будет шумно, но если фильтрация установлена слишком высоко важные мутанты могут быть устранены. - Рассчитайте процентную смертность, вызванную EMS, разделив количество мутагенизированных треков/хорошо на количество макет-обработанных треков/хорошо. Умножьте количество макет-обработанных треков на первоначальный коэффициент разбавления 3, чтобы вычислить количество макет обработанных треков / хорошо. Используйте треки включения графа и рассчитайте клетки смертности процента для выполнения этой задачи.
- Рассчитайте время полумемиалального выражения для ранних и поздних репортеров для каждого трека с помощью ячейки Calculate. Эти значения будут использоваться для сравнения мутагенизированных и макетов популяций для выявления мутантов развития.
- В клетке Half-Max Plot используйте пакет построения bokeh, чтобы визуализировать время до полуместа выражения каждого промоутера, график времени выпускного вечера эуодо полумамалеального выражения против того, что из выпускного вечера hctB. Определите включения из популяции мутантов, которые выходят за пределы макета обработанного облака рассеяния, используя интерактивный исследователь id-track bokeh. Обратите внимание на FOV и XY координаты включений интересов(рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите включений кандидатов, которые визуально выходят за пределы облака управления, поскольку проверка и статистическая оценка каждого клона будут выполняться впоследствии. - В анимированных Участок ячейки визуализировать изменения в промоутер выражения кинетики динамически во времени, график выражения интенсивности euoвыпускного вечера против выпускного вечера HCTBс помощью инструмента построения Участок16. Функция рассеяния Plotly используется для анимации экспрессии гена с течением времени (Видео 1).
- Визуализируйте снимок с плотоястного графика в ячейке Inclusion Locator, прокладывая эвовыпускной и hctBвыпускной бал в определенный момент времени (т.е. 28 HPI) с помощью пакета bokeh(рисунок 3). Определите включения из популяции мутантов, описанные в шаге 3.3.8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ должен быть выполнен быстро (Зтт;4 ч), так как включения все еще расширяются и начнут лисе-клетки хозяина 48 ч после заражения.
- Изолировать мутантов развития от включения интересов
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изоляции хламидиоза от включений, которые были определены для отображения измененной регуляции генов микроманипулятор с капиллярными иглами был использован. Ну ID, FOV и X, Y координаты включений, представляющих интерес были определены с помощью визуализации данных в разделе 3.3.- Подготовка капиллярных игл, удерживая центр капиллярной трубки в пламени и потянув оба конца капиллярной трубки, пока он не отделился. Создайте отверстие в вытягиваемой капиллярной игле путем ломать вытягиваемый кончик на скольжении микроскопа. Чтобы сломать иглу, поместите закрытый наконечник на матовый размер микроскопа слайд под углом и применить давление.
ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристики капиллярной трубки были 1,0 мм O.D., 0,5 мм I.D. - Убедитесь, что отверстие иглы примерно размером с включение под микроскопом, 20x цели.
- Прекулл 25-30 капиллярных игл для изоляции кандидатов включений (одна игла за включение).
- Заполните микроинкектор с минеральным маслом, гарантируя, что нет пузырьков воздуха присутствуют.
- Прикрепите стеклянную капиллярную иглу к микроинжектору и изгоните масло к кончику иглы, выталкивая любые пузырьки воздуха. Поместите капиллярную иглу в полные средства массовой информации и привлечь средства массовой информации на полпути. Заполнение капиллярной иглы средствами предотвращения загрязнения масла в скважине.
- Используя список сохраненных позиций в «Manager» с шага 2.3.5, мигрировать в колодец и FOV включения интереса, указанного в блокноте визуализации Python.
- Используйте джойстик микроманипулатора для локализации капиллярной иглы к координатам XY включения интереса.
- Используйте 595 нм возбуждения канала для визуализации EBs для извлечения и фазы / DIC белый световой канал для визуализации иглы. Маневр капиллярной иглы для включения, разрыв включения, а затем обратить EBs в капиллярной иглы с помощью микроинкектора.
- Изгоните EBs из капиллярной иглы в единый колодец подготовленной 24 хорошо полистироловой пластины, подготовленной в шаге 2.1.2. Снимите капиллярную иглу и замените свежей капиллярной иглой для следующего включения. Повторите раздел 3.4 для всех кандидатов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для расширения и для обеспечения достаточно высокого титера для повторного изображения, инкубировать мутант изоляты в 5% CO2, 37 КК инкубатора до тех пор, пока большинство клеток-хозяев инфицированы (1 неделя). Скважины должны внимательно контролироваться, поскольку различные изоляты могут демонстрировать различные темпы роста.
- Подготовка капиллярных игл, удерживая центр капиллярной трубки в пламени и потянув оба конца капиллярной трубки, пока он не отделился. Создайте отверстие в вытягиваемой капиллярной игле путем ломать вытягиваемый кончик на скольжении микроскопа. Чтобы сломать иглу, поместите закрытый наконечник на матовый размер микроскопа слайд под углом и применить давление.
- Урожай мутантов изолятов
- На льду, нарушить зараженный монослой, соскоб с 1 ML микропипетт отзыв. Перенесите средства массовой информации, клеточный мусор, и выпустила Хламидиоз в 1,5 мл микроцентрифуги трубки.
- Пеллет Chlamydia центробежием в течение 30 мин при 4 градусах x gЦельсия, Удалите супернатант и реuspend гранулы в 75 мл льда холодной 1x SPG. Aliquot в три 1,5 мл винт-крышка микроцентрифуги труб. Хранить при -80 градусов по Цельсию.
4. Проверка фенотипов мутантов изолируют
- Культура клеток-хозяев для изображений мутагенизированных изолятов
- Семя 96 хорошо стекла нижней пластины с 1,6 х 104 Cos-7 клетки (ATCC) на хорошо в 100 МЛ полных средств массовой информации. Инкубировать при 5% CO2, 37 градусов по Цельсию. Клетки должны достичь слияния примерно в 24 ч. После слияния клеток замените средства массовой информации полными носителями, дополненными 1 мкг/мл циклохексимида, инкубировать в одночасье.
- Инфекционная клетка с изолятами кандидата для фенотипической проверки
- Оттепель мутантов клонов и дикого типа хламидиоза на льду.
- В подготовленной 96 скважинной пластине выполните двукратное серийное разбавление мутантных изолятов, используя одну колонку на изоляцию (11 столбцов). Начните с первоначального разбавления 1:20 в 100 мл HBSS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Серийное разбавление хламидиоза выполняется для обеспечения того, чтобы образцы мутантов были изображены на МОИ и lt; 1. - Заразить оставшуюся (12-ю) колонну диким типом Хламидиоза в МВД No0,5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дикий хламидиоз используется в качестве контроля для сравнения с мутагенизированными изолятами. - Инкубация в течение 15 мин качания при 37 градусов по Цельсию.
- Вымойте инфицированные клетки-хозяина с предварительно разогевшей (37 градусов по Цельсию) HBSS с 1 мг/мЛ гепарина и HBSS, как указано в разделе 2.2.
- Замените 200 мл на колодец предварительно обогновенной (37 градусов по Цельсию) носителяей миок.
- Заполните межвелл пространства с предварительно нагревается (37 градусов по Цельсию) deionized H2O.
- Инкубировать при 5% CO2, 37 градусов по Цельсию на 10 ч.
- Настройка микроскопа
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к разделу 2.3 для установки микроскопа, этот раздел будет содержать только необходимые изменения настройки.- Выберите шаблон 96 хорошо пластины из плагина HCS.
- Эмпирически определяющие скважины, соответствующие МВД, 1 для каждого мутантного изолята. Выражение клевера под контролем euo промоутер наблюдается на й 10 HPI делает раннюю визуализацию включений возможно (Рисунок 1B).
- Выберите три скважины на мутантный изолят, которые соответствуют MOI й lt; 1 и создайте список позиций изображений, состоящий из двух FOV на скважину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Только 72 изображения могут быть приняты в интервале времени из-за аппаратных ограничений, это приравнивается к трем разбавления (колодцы) на штамм с использованием двух сайтов изображений на скважину, если 12 образцов изображены. - Запишите цикл развития каждого мутантного изолята на 36 ч при интервалах 30 мин, начиная с 12 HPI.
- Запишите экспериментальные детали в поле Комментарии к приобретениям. т.е., Ну ABC1: дикий контроль. Ну ABC2: Мутант штамм 1, ABC3: Мутант штамм 2, и т.д. ... Изображение: 12-48 HPI.
- Начните приобретение изображения с 12 HPI.
5. Анализ данных для проверки изоляции
- Создание в фокусе стеков изображений и количественное выражение флуоресценции в отдельных включениях
- Создавайте флуоресцентные следы интенсивности для каждого включения, указанные в разделе 3.1 - 3.2.
- Проверить Ctr мутагенизированных изолятов
ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки измененных профилей развития мутантных изолятов их профили выражения сравниваются с профилем выражения дикого типа с помощью ноутбука Python. Ноутбук Python, используемый для проверки клонов-мутантов с измененным программированием развития, содержится в дополнительных данных(clone_check-Markdown).- Импорт и фильтрация данных о следах включения в ноутбуке clone_check-Markdown Python, как это делается в разделе 3.3.
- Рассчитайте среднее и стандартное отклонение (STD) от следов каждой популяции изолята и дикого контроля с помощью расчетной средней и ЗППП-клетки.
- С Графиком Iso против WT участок ячейки средняя и стандартная ошибка среднего (SEM) каждого клона мутанта против контроля wildtype для определения, если мутант выражения кинетики расходятся с образцом дикого типа (Рисунок 4).
- Определите, является ли изолированная популяция мутантов клональной, спланируя следы мутантов и сравнивая их с следами включения дикого типа, используя участок рассеяния, как это делается в разделе 3.3 (шаги 3.3.7-3.3.10)(Рисунок 2, Рисунок 3). Если изоляция является смешанной популяцией, участок покажет одну популяцию, наложенную с диким типом, и вторую отдельную популяцию за пределами облака рассеяния дикого типа. Если популяция выглядит смешанной, мутант может быть повторно изолирован с помощью первоначальной процедуры, описанной в разделе 3.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения того, статистически ли профиль развития изоляции отличается от дикого типа, кривые для каждого изолята следует сравнивать с диким типом с помощью ANOVA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Прямой МУТагенез EMS нашего промоутера-репортера хламидиального штамма привел к снижению инфекционности на 75%. Используя описанный протокол изображения живых клеток, 600 включений были изображены и отслеживаются в течение 24 ч периода. Флуоресцентное выражение кинетики обоих репортеров в каждом включении было визуализирован с помощью пользовательских скриптов ноутбука Python. Были реализованы два подхода к визуализации для определения кандидата мутагенизации хламидиоза для изоляции. Первая методология (шаг 3.3.8) визуализирует время до полумаметалного выражения euo и hctB промоутеров от отдельных хламидиальных изолятов в интерактивном участке рассеяния (Рисунок 2). Включения были идентифицированы для изоляции, если они выпали за пределы макета обработанного облака рассеяния. Были выбраны клоны-кандидаты, которые визуально выпали за пределы облака управления. Проверка каждого клона была проведена впоследствии. Клоны A3-6-67 и B3-8-58 были выбраны для изоляции, поскольку они произвели более короткое время до полу максимального выражения от euo промоутер и больше времени для hctB (Рисунок 2).
Второй метод визуализации для идентификации включений с измененной кинетикой (шаги 3.3.9-10) определяет индивидуальные включения на основе визуализации динамической экспрессии генов от двух промоторов(Видео 1). Опять же, были выбраны клоны кандидатов с динамическими шаблонами выражения включения, которые заметно отличались от включения элементов управления. B3-6-62 был выбран из-за увеличения флуоресцентного накопления от euo промоутер между 23 и 29 HPI (Видео 1). Снимок анимированного графика был сделан для определения местоположения включения интересов(рисунок 3).
Используя два метода визуализации, было выявлено в общей сложности 24 включения для изоляции. Из 24 полных изолятов 10 показали дифференциальную кинетику при повторном тестировании. Эти изоляты делятся на три фенотипические категории; 8 изолятов выставлены снижение эуоэкспресс выражение на 24 HPI, что соответствует времени преобразования RB-EB, как показано на клон A3-6-67 (Рисунок 4A). Остальные два клона отображается уникальные фенотипические профили, B3-8-58 изолировать также выставлены снижение эуовыпускного вечера выражение на 24 HPI, но общее увеличение в HCTBэкспрессии (Рисунок 4B), в то время как B3-6-62 выразил повышенный уровень флуоресценции от euo промоутер следуют внезапной потерей выражения в обоих промоутеров (Рисунок 4C). Анализ живут-клеточных микрографов для мутантов B3-6-62 показал, что лизис клеток-хозяев происходил в клетках, инфицированных этим мутантом гораздо раньше, чем в инфицированных клетках дикого типа(Видео 2).
Рисунок 1: Мониторинг развития сотового типа с Ctr промоутер-репортеров.
()Схема промоутер-репортер построить, p2TK2-hctBвыпускного вечера-mKate2/euoвыпускной-Кловер. (B) Live-клеточный микрограф euoprom-Clover и hctBprom-mKate2 выражение в Ctr на 10 HPI(C) Live-клеточный микрограф Ctr, выражающих euoprom-Clover и hctBprom-mKate2 на 36 HPI. Масштабная планка: 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Идентификация репрезентативных изолирует A3-6-67 и B3-8-58 путем визуализации времени до полу максимального выражения для каждого промоутера.
Интерактивный график используется для определения мутагенизованных хламидиозных профилей выражения, отличающихся от макетно-обработанного облака рассеяния управления. Каждое пятно на графике представляет собой одно включение. Включение пятна A3-6-67 и B3-8-58 выделены, как они попадают за пределы макета обработанных облако, как экспонирование короче время до полу максимиального выражения euo промоутер в сочетании с более длительное время до полу максимального выражения HCTB. euoвыпускной: x-ось, выпускной hctB:y-оси. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Интерактивный снимок для идентификации местоположения включения.
График представлен снимок на 28 HPI из анимированных рассеяния участка (Видео 1) и был использован для определения FOV и XY координировать местоположение включений, представляющих интерес. B3-6-62 показан, как он был выбран для изоляции от анимированных рассеяния участка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Проверка репрезентативных изолятов мутантов.
Профили развития мутагенизированных изолятов A3-6, B3-8 и B3-6. (A) A3-6 мутант экспонатов снижение эуовыпускного вечера выражение на 24 HPI. (B) B3-8 мутант изолировать экспонатов снижение эуовыпускного вечера выражение на 24 HPI, но общее увеличение в HCTBвыпускного вечера выражение. (C) B3-6 изолировать экспонатов повышенный уровень выражения euoвыпускного вечера с последующим внезапной потерей выражения в обоих промоутеров на 40 HPI. Каждая выборка является средним из указанной популяции, n qgt; 25. Облако представляет SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Рабочий процесс для направленного вперед генетического анализа промоутер-репортер Ctr:
Ctr-L2-p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover EBs были непосредственно мутагенизированы с EMS в топорных носителях, CIP-1. Мутагенизированные EBs были использованы для заражения colayers клетки Cos-7 для визуализации и флуоресцентного анализа выражения. Хламидиоз, выражаюющий измененную динамику развития, был идентифицирован визуализацией в интерактивных графиках. Включения с измененными профилями развития были изолированы с помощью микроманипулятора. Фенотипы изолятов были проверены при повторной инфекции. Мутантные изоляты подвергаются WGS для выявления поражений ДНК, связанных с фенотипами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1: Идентификация мутагенизированного хламидиоза, проявляющего дивергентную кинетику экспрессии с использованием динамического графика экспрессии генов. Промоутер выражение euo и hctB для отдельных включений был построен и визуализирован во времени, чтобы определить мутагенизированный хламидиоз с измененной динамикой выражения. B3-6-62 был выбран для изоляции, поскольку он демонстрирует более высокое выражение эуовыпускного вечера по сравнению с облаком дикого типа. euoвыпускной: x-ось, выпускной hctB:y-оси. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Видео 2: Представитель мутант B3-6-62 вызывает преждевременный лизис клетки-хозяина. Временной живоклеточный микрограф B3-6-62 инфицированных хост-клеток подвергается преждевременному лизу (40 HPI). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Дополнительные файлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рассечение механизмов, контролирующих цикл развития хламидий, было затруднено ограничениями имеющихся в настоящее время генетических инструментов. Используя наш промоутер-репортер Chlamydia в сочетании с живой клеткой автоматизированной микроскопии, система была построена, которая позволяет мониторинга развития клеточного типа в отдельных включений в течение 24 ч периода. Эта система, в сочетании с химическим мутагенезом и прямой изоляции включения создал метод быстро и клонально выбрать хламидиоз, выражающих измененные профили развития (Рисунок 5).
Chlamydial EBs метаболически активны вне хозяина, когда предоставляется внутриклеточные ионные условия и источник энергии5,12. Этот еб топорический метаболизм был использован для mutagenize очищенных EBs за пределами клеток-хозяев. В этом протоколе, метаболизация EBs были непосредственно mutagenized с EMS. Было отмечено, что лечение EMS эффективно снижает жизнеспособность ЕБ и генерируется ЭБ, которые производят переменную кинетику развития, как ожидалось.
Подсчитано, что описанный протокол МУТагенеза EMS генерирует изменения ДНК 5-20/EB. Описанный рабочий процесс микроскопии в реальном времени способен изображения 8 включений в поле зрения (FOV) и 72 FOVs каждый в 30 минут интервал. Таким образом, по оценкам, эффекты 3000-10000 мутаций можно визуализировать за один запуск. Несколько запусков (3-5) приведут к визуализации эффектов 9000-50 000 мутаций. Геном Ctr-L2 кодирует 850 генов, предполагая, что этот протокол приведет к визуализации мутаций на ген. Эти оценки показывают, что охват генома, хотя и не является полным, должен быть достаточным.
Сила этого протокола является способность отслеживать и записывать выражение кинетики нескольких промоутер-репортеров на одно разрешение включения в почти в режиме реального времени. Передняя генетика опирается на наблюдаемые фенотипы и клональную изоляцию. Прошлые методы передовой генетики в хламидиозе опирались на статические наблюдения и plaquing с агар накладками8. С нашей методологией, динамическая активность промоутера регистрируется на протяжении всего цикла развития, а затем визуализирована для выявления включений, содержащих хламидиоз с измененной кинетикой экспрессии генов. Определение включений кандидатов с использованием нескольких параметров (т.е. времени полуметалального выражения и общей интенсивности флуоресцентного в заданном момент времени) приводит к определенным пулам мутантов, которые отображают различные экетики развития. Эти хламидиоз, вероятно, имеют уникальные мутации, которые влияют на регулирование отдельных генетических путей. Тот факт, что эти профили могут быть записаны в прямом эфире и визуализированы через несколько часов, позволяет время найти и изолировать включения, представляющие интерес, от зараженного монослойного. Хотя мы сосредоточились на динамике экспрессии генов во время разработки, альтернативные генные репортеры могут быть использованы для зондирования других регуляторных путей.
В зависимости от генетических путей допрашивается, следует соблюдать осторожность с добавлением циклохэксимида к клеткам-хозяинам. Хотя инкубация циклохексимидом улучшает характеристики изображения монослой, блокируя репликацию клеток-хозяев; этот эффект достигается путем ингибирования синтеза белка хозяина. Ингибирование синтеза белка de novo-хозяина может повлиять на результаты генетического экрана в зависимости от заданного вопроса.
Фототоксичность и фотосъемка являются основными препятствиями в долгосрочной временной микроскопии. Чтобы преодолеть эти проблемы, специфические характеристики каждого флуоресцентного белка должны быть рассмотрены до экспериментов. Клевер и mKate2 имеют короткие времена созревания (20-30 м) являются фотостабильными, и демонстрируют относительно большие квантовые урожаи17,,18. Эти качества позволяют уменьшить интенсивность возбуждения и время экспозиции, тем самым уменьшая количество фототоксичности и фотосъемки. Фаза / DIC белый световой канал был использован для автофокусирования, как этот спектр света был менее фототоксичным для хламидиоза.
Для этого протокола, EMS был использован в качестве химического мутагена. EMS вызывает G:C к переходам A:T через гуанин алкилирование19. Однако этот протокол может быть расширен, включив в него альтернативные мутагены, которые могут вызывать другие виды геномных мутаций. Например, акридины представляют собой класс ДНК межкалибуционных соединений, которые вызывают indels, увеличивая вероятность сдвигов кадра и, следовательно, нулевые мутации20.
С достижениями в методах хламидийной трансформации, мутировавшие гены, которые связаны с фенотипическими группами дополнения могут быть выбиты через вставленное нарушение гена и генетическое дополнение для проверки генотипа-фенотипа связи9. Восстановление мутантов, которые блокируют RB для развития EB может быть проблематичным, как мутации интереса может производить Хламидиоз, который не может повторно ввести клетки-хозяина. Этот метод может быть изменен для определения генов развития статистическими ассоциациями (GWAS). Геномы хламидиоза из изолированных включений могут быть непосредственно секвенируются без расширения и проверки. Высокая пропускная способность этого метода позволит сделать возможными статистические ассоциации. Опять же, проверка этих ассоциаций может быть проверена путем нарушения гена и дополнения9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Андерса Омсленда из Университета штата Вашингтон за поставку CIP-1 axenic средств массовой информации. Эта работа была поддержана грантом NIH R01AI130072, R21AI135691 и R21AI113617. Дополнительная поддержка была оказана стартап-фондами из Университета Айдахо и Центра моделирования комплексных взаимодействий через их грант NIH P20GM104420.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
References
- AbdelRahman, Y., Belland, R.
- Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).
- Yu, H. H. Y., Tan, M. σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia. Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).
- Koo, I., Stephens, R. A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).
- Grieshaber, S., et al. Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity. Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065 (2018).
- Belland, R., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Nguyen, B., Valdivia, R. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. MBio. 7 (1), 01817 (2016).
- Rosario, C. J., Tan, M. The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes. Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).
- Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).
- Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).
- Su, H., et al. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).
- Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14-20 (2010).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Plotly Technologies Inc. Collaborative data science. , Montréal, QC. https://plot.ly (2015).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).
- Sega, G. A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate. Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).
- Ferguson, L., Denny, W. Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands. Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).
