Summary
吊り下げドロップ法を用いて、マウス胚性幹細胞を神経細胞に分化する手順について説明する。また、RT-qPCR、免疫蛍光、RNA-seq、フローサイトメトリーを通して包括的なフェノミック解析を行っています。
Abstract
マウス胚性幹細胞を神経系統に分化し、次に分化した細胞を特徴付ける一連のアッセイを行うステップバイステップの手順について述べています。E14マウス胚性幹細胞を使用して吊り下げドロップ法を介して胚体を形成し、次にレチノイン酸によって神経前駆細胞に分化し、最終的にニューロンに分化した。定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)および免疫蛍光実験により、神経前駆物質およびニューロンが、8日目と12日目の分化後に対応するマーカー(神経前駆物質用のネチンとニューロンの神経フィラメント)をそれぞれ示すことが明らかになった。 Sox1 プロモーター主導のGFPレポーターを発現するE14ラインでのフローサイトメトリー実験は、8日目の細胞の約60%がGFP陽性であることを示し、この段階で神経前駆細胞の分化が成功したことを示した。最後に、RNA-seq分析を使用して、世界的な転写変化をプロファイリングしました。これらの方法は、神経細胞の分化中の細胞の同一性遷移を調節する際の特定の遺伝子および経路の関与を分析するのに有用である。
Introduction
開発中マウス胚盤胞1,2の内細胞塊からの初の導出以来、マウス胚性幹細胞(mESC)は幹細胞自己再生と分化を研究する強力なツールとして用いられてきた3。さらに、mESC分化を研究することは、神経変性疾患などの疾患の治療における幹細胞ベース療法における効率と安全性を向上させる可能性のある分子機構の多大な理解につながる4。動物モデルと比較して、このin vitroシステムは、実際と評価におけるシンプルさ、動物とは対照的に細胞株を維持する際の低コスト、および遺伝子操作における相対的な容易さなど、多くの利点を提供する。しかし、分化された細胞タイプの効率と品質は、多くの場合、mESCの異なるラインと分化方法5、6の影響を受けます。また、分化効率を評価する従来のアッセイは、堅牢性に欠ける選択されたマーカー遺伝子の定性的検査に依存しているため、遺伝子発現の世界的な変化を把握することができません。
ここでは、神経分化の系統的評価にアッセイの電池を使用することを目指しています。選択したマーカーとRNA-seqに対する従来のインビトロ分析を用いて、分化効率とこのプロセス中の転写変化を測定するためのプラットフォームを確立します。既に確立されたプロトコル7に基づいて、吊り下げ低下技術を通じて胚体(EB)を生成し、続いて上端菌量のレチノイン酸(RA)を用いて神経前駆細胞(NPC)を生成し、その後神経誘導培地でニューロンに分化した。分化の効率を調べるために、従来のRT-qPCRおよび免疫蛍光(IF)アッセイに加えて、RNA-seqおよびフローサイトメトリーを実施した。これらの分析は、ステージ固有の分化の進行を包括的に測定します。
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Protocol
1. mESC文化
- 10 cmの組織培養処理プレートに0.1%のゼラチンをコーティングし、ゼラチンを少なくとも15〜30分間セットしてから吸い出します。
- 種子γ照射マウス胚性線維芽細胞(MEF)は、予め温めたmESC培地(Dulbeccoの改変イーグル培地(DMEM)に15%の胎児ウシ血清(FBS)、非必須アミノ酸を含むMESCを培養する前日に、 β-メルカプトエタノール、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、LIF、PD0325901(PD)、およびChir99021(CH))
- e14細胞を培養する前に、γ照射されたMEFをプレート表面に沈着させます。
- 37 °Cの水浴でE14 ESCを解凍し、すぐに暖かいmESC媒体と15 cmの円錐形の管の細胞を移す。細胞を200xgで3分間ペレットし、上清を取り除きます。
- 細胞をmESC培地の10mLに再懸濁し、先に播種したγ照射されたMEFを含む培養プレート上の細胞をプレートに入れた。5%CO2未満の37°Cインキュベーターで細胞培養をインキュベートする。
- 培養パスケージングの場合、培地を吸引し、滅菌1xPBSでプレートを洗浄する。プレート表面を覆うのに十分な0.05%のトリプシンを加え、37°Cで3分間インキュベートします。
- mESC培地とピペットでトリプシンを中和し、単一細胞懸濁液を生成します。細胞を200xgで3分間遠心し、上清を取り除きます。
- 血球計または細胞カウンターで細胞を数え、10cm培養プレートに約5.0 x105個 の細胞を播種します。
- 細胞をmESC培地の10mLに再懸濁し、先に述べたようにゼラチンコーティングされた組織培養プレート上の細胞をプレートし、培養をインキュベートする。
注: 細胞がコロニー内で分化するのを防ぐために、mESC を 2 日ごとに通過させることが推奨されます。フェノール赤は、pHインジケーターとしてのみ機能し、細胞密度に応じて、2日よりも早く黄色(より酸性)に変えることができます。したがって、毎日培地を変更する必要があるかもしれません。γ照射されたMEFは、いくつかの通路の後に最終的に死ぬでしょう。
2. EB、NPC、およびニューロンの分化
- 前述のカルチャパスパサイジング プロトコルを実行し、セルをカウントします (手順 1.7 ~ 1.10)。
- ぶら下げ方法 (日 0)
- 10cmの細胞培養プレートの場合、5.0 x 102細胞が20μL分化培地(15%FBS、非必須アミノ酸、βメルカプトエタノール、L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピロビン酸を含むDMEM)に懸濁する約2.5 x 104細胞を数えます。細胞を含む約502μLの液滴は、10cmのプレートにメッキすることができる。
- 適切な数の細胞をアリコートし、次いで細胞を200xgで3分間遠心し、上清を除去する。
- 細胞密度5.0 x 102細胞 /20μL(例えば、分化培地1mLの2.5 x104細胞 )の適切な分化培地の細胞を再懸濁する。
- マイクロピペットまたはリピータピペットを使用して、細胞懸濁液の20μL液滴を組織培養プレートの蓋上に置く。液滴が互いに近すぎないようにして、液滴がマージされないようにします。
注:液滴は、プレート自体ではなく蓋の上に置かれるので、組織培養処理された取り付けプレートまたはサスペンションプレートのいずれかにメッキすることができます。より実現可能で無菌のアプローチのために、液滴を付着組織培養プレートにプレートし、以下に説明するように懸濁液プレートに移します。 - 1x PBSの5~10 mLでプレートを満たし、蓋を慎重にプレートに戻します。培養液を37°Cインキュベーターで培養します。
注:PBSは、液滴が乾燥するのを防ぐために培養プレートに添加されます。
- 2日目には、マイクロピペットを使用して蓋から液滴を回収し、10mLの分化培地で満たされた10cmの細胞培養懸濁液板に入れます。インキュベーターで低速で揺れる軌道シェーカー上の培養物をインキュベートします。
- 4日目に、EBを収穫し、細胞を採取し、200xgで3分間遠心分離し、上清を取り除く。
注: その後の実験の要件に従って、1x PBS で EJB を洗浄することもできます。 - 処置を継続し、EB分化を神経前駆細胞(NPC)に誘導し、5μMレチノイン酸(RA)で分化培地を調製する。
- 100 x g で 3 分間のエブをペレットにして古い培地を取り除くか、古い培地を吸い出す前に EB が沈着するようにします。培養プレートに5μM RAを含む分化培地10mLを加えます。
- 6日目に、プレートを傾けて上記のように培地をピペットアウトして、培地の少なくとも半分を5μM RAを含む新鮮な培地に置き換えます。
注:5日目と7日目には、少なくとも半分の媒体を新鮮なRA含有培地に置き換えるのが推奨されます。フェノール赤いインジケータのメモを取る;黄色がかった場合は、すべての媒体を置き換えるのが最善です。 - 8日目に、細胞を採取し、200xgで3分間遠心し、上清を取り除いてNPCを収穫する。
注:NPCは、その後の実験のニーズに応じて1倍のPBSで洗浄することもできます。必要に応じて、NPCを凍結して再び解凍して、後で培養および分析することができます。NPCを培養する場合、アキュタスはトリプシンの代替として使用することもできます。 - 手順を継続し、NPCをニューロンに分化するには、遠心分離によって15 mLの円錐管にNPCを収集し、トリプシンで解体し、37°Cで3分間インキュベートします。ピペットNPCは、すべてのNPC凝集体が解別され、トリプシンを培地で中和することを確実にする。
- 40 μmナイロン細胞ストレーナーで細胞をフィルターし、N2培地(DMEM/F12培地+ 3 mg/mLグルコース + 3 mg/mL 脂質豊富なウシ)の密度1.5 x 105/cm2 でめっきする前に細胞を数える 血清アルブミン(LBSA)+1:100 N2サプリメント+ 10 ng/mL bFGF + 50 U/mLペン/ストレップ + 1 mM L-グルタミン) その後のPCRおよびウェスタンブロット実験のための組織培養処理プレート;または免疫蛍光実験のための組織培養室で。
- 9日目に、古い媒体を新鮮なN2培地に交換します。
- 10日目にN2培地をN2/B27培地(50%DMEM/F12および50%ニューラル基底、3mg/mL LBA、1:200 N2サプリメント、1:100 B27サプリメント、50 U/mLペン/ストレップ、1mM L-グルタミン)に切り替えます。
- 11日から12日に、次のようにニューロンを収穫します。細胞を1x PBSで洗浄し、トリプシンを加え、37°Cインキュベーターで3分間培養してから、トリプシンを培地で中和し、遠心分離機を200xgで3分間培養します。
3. mESCと分化セルの特性
- アルカリホスファターゼ(AP)アッセイ
- キットを使用してアルカリホスファターゼの活動を評価します( 材料表を参照)。
- 培養プレートから培地を取り出し、1x PBSでESCを洗います。
- キットに付属の1mLの固定溶液(ホルムアルデヒドとメタノール)をプレートに加え、室温で2〜5分間インキュベートします。
注: 修正ソリューションの過剰インキュベーションは AP アクティビティを危険にさらす可能性があります。 - 修正液を取り出し、1x PBSでESCを洗い、プレートにいくらかの量のPBSを残します。
注: AP アクティビティを損なわないよう、PBS で ESC を湿らせておいてください。 - A、B、Cの基板溶液を1:1:1比で混合してAPソリューションを準備します。最初にAとB溶液を混合し、C溶液を添加する前に2分間室温で混合物をインキュベートします。
- 1x PBS を取り外し、先ほど用意した AP ソリューションを追加します。
- 培養プレートをアルミ箔で包むか、暗い部屋でステップ3.5を行って、暗闇の中で約15分間ESCをインキュベートします。
- 反応を監視し、溶液が明るくなったときに反応液を除去し、非特異的な染色を避けます。
- 1x PBSでESCを2回洗います。
- ESCを1x PBSまたは取り付け媒体で覆うことで、サンプルの乾燥を防ぎます。
注: AP 表現には赤または紫の染色が表示されます。プレートは4°Cの冷蔵庫に収納できます。
- RT-qPCR
- ESC と EB および NPC の手順 1.6 ~ 1.7 と 2.4 に従って、さまざまな段階でセルを収集します。
- RNA、DNA、およびタンパク質抽出溶液を使用してRNAを分離します( 材料表を参照)。
- 逆転写キットを使用して cDNA を生成し( 資料表を参照)、製造元のマニュアルに従います。
- 固定と埋め込み
- 上記のようにEBとNPCを収穫し(ステップ2.6)、室温で30分間1xPBSで4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液で固定します。
- PFAを取り出し、サンプルを1x PBSで5分間洗います。
- サンプルを1x PBS、10%、20%、および30%スクロース溶液を25\u201228 °Cで連続希釈し、30分のインキュベーション後にサンプルを次の溶液に移します。
注:サンプルは、埋め込みステップを続行する前に、4 °Cで30%スクロース溶液に保存することができます。 - サンプルを(積み重ねずに)凍結鋳型の中心に置く前に、スクロース溶液でピペットチップを濡らし、余分な液体をピペットアウトします。
メモ: フィルター ペーパーを使用して、余分なソリューションを削除することもできます。チップチップをスクロース溶液で濡らすと、先端の壁にEBやNPCが付着するのを防ぐことができます。 - サンプルを再中断することなく、最適な切削温度(OCT)溶液を慎重に金型に追加し、ピペットで余分な気泡を除去します。
- サンプルを用いてラボのミキサーに低速で金型を置き、サンプルを軽く攪拌して15分間温かく攪拌します。これは、OCT ソリューションで再中断された場合に、EB と NPC を最下位に解決するのに役立ちます。
- 液体窒素またはドライアイスに金型を入れることで、サンプルを素早く凍結します。
メモ:サンプルは、次のステップに進む前に-70°Cの冷凍庫に保管することができます。
- 凍結切断
- クライオスタットを -20 ~ -18 °C に冷却してから、サンプルを器具に移します。
- 凍結したOCTブロックを金型から取り外し、ホルダーの表面に少しOCT溶液を置いてホルダーに固定します。
- 切り離し中にサンプルが失われないように、EB と NPC がブレードに最も近いように OCT ブロックを位置合わせします。
- 慎重にブロックの10 μmをセクションし、サンプルを含むスライスに細心の注意を払います。
- サンプルを含むOCTスライスを組織埋め込みガラススライドに素早く置き、OCTスライスを室温で1時間空気乾燥させます。
メモ:サンプルは、後で使用するために-70°Cで保存することができます。
- 免疫蛍光(IF)
- OCTセクションまたは培養チャンバーは、ニューロンを10%正常ロバ血清/0.1%トリトンX-100で1x PBSで1時間室温で1時間ブロックします。
- サンプルを5%正常ロバ血清/0.05%トリトンX-100で希釈した一次抗体で、4°Cで一晩1x PBSでインキュベートする。
- 1回の洗浄でサンプルを1x PBS/0.1%トリトンX-100で洗浄します。
- サンプルを5%正常ロバ血清/0.05%トリトンX-100で1時間室温で1時間希釈した二次抗体でインキュベートします。
- 1x PBS/0.1% トリトンX-100でサンプルを洗浄し、各洗浄を5分間洗浄し、1 μg/mL DAPIでサンプルをインキュベートします。
- カバースリップといくつかの取り付け媒体でサンプルを取り付け、乾燥させます。
- 蛍光顕微鏡でサンプルを観察します。
- RNA-セクの分析
- 様々な段階で細胞を収集し、RNA抽出を行う(ステップ3.2参照)。
- cDNAライブラリを準備し、Wangら8に記載されているプロトコルに従って深いシーケンシングとデータ分析を行う。
- R パッケージ、クラスタープロファイルを使用して遺伝子オントロジー (GO) 分析を実行します。
- フローサイトメトリー
- 手順 1.6 ~ 1.7 に従って ESC を収集し、セルを培地で再中断します。手順 2.4 に従って、EB と NPC を収集し、セルをメディアで再中断します。
- 40 μm ナイロンセルストレーナーを使用して、新しい 15 mL 円錐チューブにセルサスペンションをフィルターします。
- フローサイトメーター(施設のコア施設によって実行される)を使用してサンプルのGFP信号を測定します。
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Representative Results
この方法の表現として、E14細胞に対してEB、NPC、およびニューロン分化実験を行いました。E14細胞は、γ照射されたMEF集団が希釈されるまでγ照射MEF(図1A)で培養した。E14細胞の多能性を確認した結果、ナノグおよびOct4マーカーに対してアルカリホスファターゼ(AP)染色(図1B)および後述のRT-qPCR(下記参照)を行うことで、E14細胞の多能性を確認した。 γ照射されたMEFフリーE14細胞を、図2Aに示すプロトコルを用いて分化のために誘導した。簡単に言えば、500個の細胞を含む20μLの分化培地液滴を培養板の蓋に播種した(詳細はプロトコルセクション2参照)。その後、形成されたEJBを回収し、新鮮な分化媒体に懸濁液に入れた。分化の4日目から8日目にかけて、5μM RAを培養プレートに加え、NPCを誘導し、分化されたEBsは円形形状を示し、そのサイズは分化中も増加し続けた(図2B)。8日目に、NPCを収穫し、トリプシン化し、次いで得られた単細胞懸濁液を、N2サプリメントを用いてDMEM/F12培地中の組織培養チャンバーにめっきし、後にB27サプリメントでメッキした。10日目までに、ニューロンに分化するNPCは、細長い細胞形状を有するように見える(図2B)。
分化実験をさらに評価するため、8日目のE14 NPCと12日目のE14ニューロンに対する免疫蛍光(IF)実験を行いました。NPCのネスチンと神経線維(NF)シグナルの陽性染色を観察した(図3A)。あるいは、RT-qPCRおよびRNA-seqはNPCマーカー遺伝子の誘導とNPCにおける多能性遺伝子の喪失を確認した(図3B,D,F)。ESC分化の成功をテストする定量的方法として 、Sox1 プロモーター駆動GFPレポーター9を発現するマウスESCラインを分化し、続いてESCおよびNPCのフローサイトメトリー分析を行った。NPCステージのセル全体の58.7%がGFP陽性、GFP信号がESCステージで0.0%であることがわかりました(図3C)。分化中の転写変化をプロファイリングするために、E14 ESC、EB 3、およびNPC 8に対するRNA-seq実験を実施し、それぞれの段階に関連する遺伝子クラスターを明らかにした(図3D)。RNA-seqヒートマップの遺伝子は、その発現レベルに基づいて分類され、分化中の異なる段階で異なる発現遺伝子を同定しました。4つの遺伝子クラスターに対する遺伝子オントロジー(GO)分析は、これらのクラスターが、mESCニューロン分化の3つの細胞段階がそれぞれそれぞれの段階で高度に発現しているが、他の段階では発現していない遺伝子群を有することを示す、別個の細胞機能または経路に対応することを示した(図3E)。例えば、クラスター3の遺伝子は、他の段階と比較してE14 NPCで高発現しており、ニューロンの発達に関連する経路に対応しています。クラスター1、2、および4には、生殖層系統の指定に関連する高度に発現した遺伝子は含まれていませんが、細胞の成長と増殖に関連しています。このように、RNA-seqおよびそれに付随するGO分析は、E14細胞が分化の8日目までにニューロン系統に分化したことを示した。
図1:文化におけるE14 ESC(A)光顕微鏡画像は、γ照射されたMEFの上のコロニーで成長しているE14細胞(黒矢印)を示す。E14コロニーは、コロニーサイズ差の1日目と3日目の培養物に見られるように増殖し続けている。(B) アルカリホスファターゼ(AP)染色によるE14 ESCの多能性の確認紫色の矢印は、AP染色に陽性であったMESCを示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:E14のE14分化は、EBs、NPC、およびニューロンに対する 。(A) E14細胞をEB、NPC、ニューロンに分化するための主要なステップを要約する。(B) LIFを使用せずに培地で培養したE14 ESCとサスペンションプレート2iは、2日目に見える個々のエブ球を形成し、その後も成長し、拡大し続ける。RAは、NPCへの分化を誘導するために分化の4日目に添加される。誘導の4日後、これらのNPCは、下部パネルに示されているニューロンへの分化のためにメッキされる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:分化された細胞の特性(A)トップパネルの免疫蛍光画像は、ネスチン(緑色)および核(DAPI、青)について調査された8日目のNPC含有EBを示す。下のパネルは、ニューロフィラメント(緑色)について調査された12日目のニューロンの免疫蛍光画像を示しています。合成した画像の赤いボックスは、見やすくするために 3 倍に拡大されます。(B) E14 ESCおよびNPCの多能性マーカー (NanogおよびOct4)およびNPCマーカー (Pax6、NeuroD1、およびNes)を示すRT-qPCR分析.誤差範囲はSD±平均値である。 8日目のESCとNPCの両方を、フローサイトメトリーを用いた陽性GFP蛍光シグナルについて定量化した。(D) ヒートマップは、ESC、EB、およびNPCステージで発現される遺伝子の決定されたFPKMのZスコアを示す。ESC、EB、またはNPCステージのいずれかで異例発現している遺伝子の4つの異なる遺伝子クラスターが同定された。(E)GO解析は、RNA-seqで同定された4つのクラスター上のRパッケージ、clusterProfilerを用いて行った。(F) グラフには、他の 3 つの多能性マーカー、Sox2、Klf4、Myc、および ESC、EB Day 3、および NPC 8 の E14 セルに対するニューラルマーカー 、NeuN、Map2、およびTubb3の FPKM 値が表示されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マウス胚性幹細胞の神経分化の方法は何十年も確立されており、研究者は以前のプロトコルを変更したり、様々な目的のために新しいプロトコルを作成し続けています7,10,11.一連のアッセイを用いて、マウスやヒトESCの他の系統分化の解析に用いることができるニューロンへのmESCの分化段階の効率と進捗状況を総合的に分析しました。さらに、我々のアプローチは、vitro 8における神経分化に対する特定の遺伝子または経路の影響を評価するのに有用なツールであることが証明された。
我々の方法により、多能性非コミットESCは、レチノイン酸(RA)で処理され、高効率で神経系統にコミットし、ニューロン7をさらに生成するように誘導される。ES細胞の神経細胞への分化を改善し、異質性を低下させるためには、ES細胞を未分化状態12に保つことが重要である。不拡散性MEFは、γ照射またはマイトマイシンCで治療し、ESCの多能性を維持し、その成長13、14に足場を提供する機能を有する。一貫した結果を得るために、γ照射されたMEFで培養されたmESCを用いて各分化実験を開始する。数回の経過の後、γ照射されたMEFは死に、培養は最終的にmESC細胞にとって均質になる。あるいは、mESCは、γ照射されたMEFが次の通路でそれらを除去するために播種される前に、約45分間ゼラチンにプレプレートすることができます。白血病抑制因子(LIF)は、JAK/STAT経路15,16,17を活性化することにより、培養マウスES細胞の多能性状態を維持するために長い間用いられてきた。さらに最近では、PD0325901(PD、MEK阻害剤)およびCHIR99021(CH、GSK阻害剤)が、ES細胞3,18の追加の多能性維持を提供することが分かった。我々のプロトコルでは、これらの阻害剤を用いたMESCsをLIFと一緒に培養し、mESCsの高い多能性を維持する。
分化を成功させるためのもう1つの重要な要素は、EJB の品質です。他の研究者5、19、20によって適用された吊り下げ法によってE14細胞の分化を行う。この方法では、単一のES細胞が分化媒体液滴中で2日間中断し、そこで自発的に骨を凝集させて、EBを形成する。結果として生じる EB は、一般に、分離された mESCs を培地で中断する方法と比較して、その形態 (図 2B)の点で明確に定義され、その結果、EB サイズは我々の経験においてはるかに広い範囲で得られます (データは示しません)。プレートに EJB が付着しないようにするには、3 日目から分化プロセスを継続して低速回転を行うことが重要です。これらのEBは、RAで処理することでNPCに分化するように誘導される。EB Day 4におけるRA処理から得られたNPCは、典型的には、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイト21などの神経細胞に対して異種である。RT-qPCRまたは免疫蛍光を使用して、NPC集団は、アストロサイトのGfapおよびオリゴデンドロサイトのOlig2のようなニューロンおよび他の神経系線マーカーについて調査することができる。さらにニューロンにNPCの分化を誘導するために、NPCは、最も重要な成分がN2およびB27サプリメントである最適なニューロン培地で培養される。N2 は主に NPC がニューロンの長寿を維持するために機能する一方で、NPC がニューロンの系統にコミットするのに役立つ機能を補います。
サンプルは、分化期間(例えば、ESCステージ、EB Day 2、EB Day 4、NPC Day 6、NPC 8、ニューロン10日目、およびニューロン12日目)にわたって収集し、多能性および外皮マーカーに対してRT-qPCRを行うことにより分化プロセスを追跡することができる。異なるセル段階間で、Oct4、Nanog、Sox2、Klf4、Mycなどの多能性マーカーを比較すると、mESCの多能性が検証されます(図3B,F)。 神経分化の効率を調べるため、Hand1 、Snai1 、Tbxtなどの中層のマーカー 。EomesやGata4などの内皮層もプローブすることができる(データは示されていない)。さらに、NPCまたは神経マーカーの免疫蛍光(IF)プローブを用いて、さらに検証を行うことができる(図3A)。しかし、これらの方法は定量的ではなく、選択したマーカーに偏っています。これらの制限を克服するために、フローサイトメトリーとRNA-seq分析を組み込んでいます(図3C\u2012F)。フローサイトメトリー実験で使用される細胞株は、Sox1-GFPE14細胞株であり、この実験では特にNPC分化手順の品質を評価するために用いた。 Sox1は神経切除の発達22の間に最も初期の特異的神経マーカーの1つであり、それゆえNPC系統のための優れたマーカーとなる。Sox1は、NPC の母集団を評価するために RT-qPCR またはウェスタン ブロットを使用する場合にプローブできます。これらの分析は、遺伝子操作や化学処理によって引き起こされる分化欠陥を調べるのに特に有益である。
ここで紹介するプロトコルにはいくつかの制限があることに注意することが重要です。まず、1つの野生型mESC細胞株に対する包括的な分析を提示するだけである。マウスやヒトから発生する他のESCラインは、正常かつ効率的なニューロン分化を確実にするために、プロトコルの変更とさらなる最適化を必要とする可能性があります。第二に、我々は自然に限界のセットを負担するインビトロニューロン分化方法を提示する。前に述べたように、EBは、NPC系統に向かってそれらを駆動するためにRAの上の生理学的レベルで扱われます。その結果、NPCは、生理学的条件を模倣し、ニューロン系統のコミットメント、成長、および長寿を奨励するためにニューロン最適培地に入れられます。ここで, N2 と B27 サプリメントは、培養ニューロンに使用されますが、他のサプリメントは、同様の目的のためにNS21 23なども利用できます, ニューロンの分化の成功と効率を変更する可能性があります。.これらの条件は、細胞培養アッセイにおいて合成的に再構成され、これは生理学的条件を完全に表さない場合がある。EB、NPC、ニューロンの品質は、開始mESCに大きく依存します。何度も通過し、1週間以上培養に保存されたmESCは、通常、多能性を失い始め、正常に分化を受けなくなる可能性があります。したがって、MESCを最適な状態で維持することは、それらが効果的にEB、NPC、およびニューロンに区別できることを保証する上で重要です。3Dモデルのような他のニューロン培養法も、時にはスループットと実現可能性27、28を犠牲にして、生理学的条件24、25、26をより良く模倣するために提案されている。私たちのプロトコルは、これらの3D文化モデルを特徴付けるために有用であると考えています。
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Disclosures
著者は、競合する財政的利益はないと宣言しています。
Acknowledgments
この研究は、NIH(1R35GM133496-01)からZ.ガオへの助成金によって支えられた。ライアン・ホッブス博士の切り離し支援に感謝します。ペン州立医科大学の中核施設(ゲノム科学とバイオインフォマティクス、先端光顕微鏡イメージング、フローサイトメトリーなど)に感謝します。また、今村有香先生のRNA-seq解析のお手伝いに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| - Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| - Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| - Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| - Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
References
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