Summary
Vi beskriver proceduren for in vitro differentiering af mus embryonale stamceller i neuronale celler ved hjælp af hængende dråbe metode. Derudover udfører vi en omfattende fænotypisk analyse gennem RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq og flowcytometri.
Abstract
Vi beskriver den trinvise procedure for dyrkning og differentiering af museembrystiske stamceller i neuronale slægter, efterfulgt af en række analyser for at karakterisere de differentierede celler. E14 mus embryonale stamceller blev brugt til at danne embryonale organer gennem hængende drop metode, og derefter induceret til at differentiere sig til neurale stamfader celler ved retinsyre, og endelig differentieret i neuroner. Kvantitative reverse transskription polymerase kædereaktion (RT-qPCR) og immunofluorescence eksperimenter viste, at de neurale forfædre og neuroner udviser tilsvarende markører (nestin for neurale forfædre og neurofilament for neuroner) på dag 8 og 12 post-differentiering, henholdsvis. Flow cytometri eksperimenter på en E14 linje udtrykker en Sox1 promotor-drevet GFP reporter viste, at omkring 60% af cellerne på dag 8 er GFP positive, hvilket indikerer en vellykket differentiering af neurale stamfader celler på dette stadium. Endelig blev RNA-seq-analysen brugt til at profilere de globale transskriptomiske ændringer. Disse metoder er nyttige til at analysere inddragelsen af specifikke gener og veje i reguleringen af celleidentitetsovergangen under neuronal differentiering.
Introduction
Siden deres første afledning fra den indre cellemasse af de udviklende muse blastocyster1,2, mus embryonale stamceller (mESC) er blevet brugt som kraftfulde værktøjer til at studere stamcelle selvfornyelse og differentiering3. Desuden fører undersøgelse af mESC-differentiering til en enorm forståelse af molekylære mekanismer, der kan forbedre effektiviteten og sikkerheden i stamcellebaseret terapi til behandling af sygdomme som neurodegenerative lidelser4. Sammenlignet med dyremodeller giver dette in vitro-system mange fordele, herunder enkelhed i praksis og vurdering, lave omkostninger ved at opretholde cellelinjer i modsætning til dyr og relativ lethed i genetiske manipulationer. Effektiviteten og kvaliteten af differentierede celletyper påvirkes dog ofte af forskellige linjer af mESC'er samt differentieringsmetoderne5,6. Desuden er de traditionelle analyser til evaluering af differentieringseffektivitet afhængige af kvalitativ undersøgelse af udvalgte markørgener, som mangler robusthed, og de forstår derfor ikke globale ændringer i genekspression.
Her sigter vi mod at bruge et batteri af analyser til systematisk vurdering af den neuronale differentiering. Ved hjælp af både traditionelle in vitro-analyser på udvalgte markører og RNA-seq etablerer vi en platform til måling af differentieringseffektiviteten samt de transskriptomiske ændringer under denne proces. Baseret på en tidligere etableret protokol7genererede vi embryonale organer (EBs) gennem den hængende dråbeteknik, efterfulgt af induktion ved hjælp af suprafysiologisk mængde retinsyre (RA) til at generere neurale stamfaderceller (NPC'er), som efterfølgende blev differentieret til neuroner med neural induktion medium. For at undersøge effektiviteten af differentiering, ud over traditionelle RT-qPCR og immunofluorescence (IF) assays, vi udførte RNA-seq og flow cytometri. Disse analyser giver en omfattende måling af udviklingen af den fasespecifikke differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mESC kultur
- Coat en 10 cm vævskulturbehandlet plade med 0,1% gelatine og lad gelatinen indstilles i mindst 15-30 minutter, før du aspireerer den ud.
- Frø γ-bestrålet mus embryonale fibroblaster (MEFs) en dag før dyrkning af mESC'erne i det forvarmede mESC-medium (Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med 15% fosterkvægsserum (FBS), ikke-essentielle aminosyrer, β-mercaptoethanol, L-glutamin, penicillin/streptomycin, natrium pyruvat, LIF, PD0325901 (PD) og Chir99021 (CH)).
- Lad de γ bestrålede MEF'er afregne og fastgøres til pladeoverfladen, før de kulttede E14-celler.
- Optø E14 EECs i 37 °C vandbad og overfør hurtigt cellerne i et 15 cm ledningsrør med varmt mESC-medium. Pellet cellerne ved 200 x g i 3 min og fjern supernatanten.
- Brug cellerne i 10 mL mESC-medium og plader cellerne på kulturpladen, der indeholder de γ bestrålede MEF'er, der er sået tidligere. Inkuberes cellekulturen i en inkubator på 37 °C under 5 % CO2.
- Til kulturpassaging, aspirere e mediet og vask pladen med steril 1x PBS. Der tilsættes nok 0,05 % trypsin til at dække pladeoverfladen og inkuberes ved 37 °C i 3 min.
- Neutralisere trypsin med mESC medium og pipette til at generere enkeltcellet suspension. Centrifugere cellerne ved 200 x g i 3 min og fjerne supernatanten.
- Tæl cellerne med et hæmocytometer eller celletæller og frø omkring 5,0 x 105 celler i en 10 cm kulturplade.
- Resuspend cellerne i 10 ml mESC medium, plade cellerne på gelatine-belagt væv kultur plade og inkubere kulturer som beskrevet tidligere.
BEMÆRK: Det anbefales, at mESC'er passeres hver anden dag for at forhindre cellerne i at differentiere sig i deres kolonier. Phenol rød i mediet fungerer udelukkende som en pH-indikator, og afhængigt af den cellulære tæthed kan det blive gulligt (mere surt), før end 2 dage. Derfor kan det være nødvendigt at ændre mediet hver dag. De γ bestrålede MEF'er vil i sidste ende dø ud efter et par passager.
2. EB, NPC og neurondifferentiering
- Udfør tidligere nævnte kulturpasagingprotokol, og tæl cellerne (trin 1.7-1.10).
- Hængende dråbemetode (dag 0)
- For en 10 cm cellekulturplade tælles ca. 2,5 x 104 celler, hvor 5,0 x 102 celler vil blive suspenderet i 20 μL differentieringsmedium (DMEM med 15% FBS, ikke-essentielle aminosyrer, β-mercaptoethanol, L-glutamin, penicillin /streptomycin og natrium pyruvat). Omkring halvtreds 20 μL dråber, der indeholder cellerne kan belagt på en 10 cm plade.
- Aliquot det passende antal celler, og derefter centrifugere cellerne ved 200 x g i 3 min og fjerne supernatant.
- Brug cellerne igen i det relevante differentieringsmedium for en celletæthed på 5,0 x 102 celler pr. 20 μL (f.eks. 2,5 x 104 celler i 1 minut differentieringsmedium).
- Placer 20 μL-dråber af celleophænget på låget på vævskulturpladen ved hjælp af en mikropipette eller en repeaterpipette. Sørg for, at dråberne ikke er for tæt på hinanden for at forhindre dem i at flette.
BEMÆRK: Dråberne kan belagt på enten en vævskulturbehandlet fastgørelsesplade eller affjedringsplade, da de vil blive placeret på låget og ikke selve pladen. For en mere mulig og steril tilgang, plade dråberne på en vedhæftet fil væv-kultur plade og overføre dem til en suspension plade som beskrevet nedenfor. - Fyld pladen op med 5-10 mL 1x PBS og læg forsigtigt låget tilbage på pladen. Inkuber kulturen i 37 °C-inkubatoren.
BEMÆRK: PBS tilsættes til kulturpladen for at forhindre dråberne i at tørre ud.
- På dag 2skal du bruge en mikropipette til at samle dråberne fra låget og placere dem i en 10 cm cellekulturaffjedringsplade fyldt med 10 mL differentieringsmedium. Inkuber kulturen på en orbital shaker ryster ved lav hastighed i inkubatoren.
- På dag 4, for at høste EBs, indsamle cellerne, centrifuge ved 200 x g i 3 min, og fjerne supernatant.
BEMÆRK: EB'erne kan også vaskes med 1x PBS i henhold til kravene i efterfølgende forsøg. - For at fortsætte proceduren og fremkalde EB-differentiering i neurale stamfaderceller (NPC'er) forberede differentieringsmediet med 5 μM retinosyre (RA).
- Fjern det gamle medium ved at pelleting EBs på 100 x g i 3 min eller lad EBs at bosætte sig, før aspirating ud det gamle medium. Der tilsættes 10 mL af differentieringsmediet, der indeholder 5 μM RA, til kulturpladen.
- På dag 6skal mindst halvdelen af mediet udskiftes med frisk medium, der indeholder 5 μM RA, ved at vippe pladen og pipettere mediet som beskrevet ovenfor.
BEMÆRK: Det anbefales, at mindst halvdelen af mediet udskiftes med frisk RA-holdige medium på dag 5 og 7. Vær opmærksom på den phenolrøde indikator; hvis det bliver gulligt, er det bedst at udskifte hele mediet. - På dag 8skal NPC'erne høstes ved at opsamle cellerne, centrifugere ved 200 x g i 3 min og fjerne supernatanten.
BEMÆRK: NPC'erne kan også vaskes med 1x PBS i henhold til behovene i efterfølgende eksperimenter. Hvis det er nødvendigt, kan NPC'er fryses ned og optøes igen til senere kultur og analyse. Hvis NPC'erne skal dyrkes, kan accutase også bruges som et alternativ til trypsin. - For at fortsætte proceduren og differentiere NPC'er i neuroner, opsamle NPC'er i et 15 mL konisk rør ved centrifugering, adskille dem med trypsin og inkubere dem ved 37 °C i 3 min. Pipette NPC'erne for at sikre, at alle NPC aggregater er adskilt og neutralisere trypsin med mediet.
- Filtrer cellerne med 40 μm nyloncellesn si og tæl cellerne, før de nedgøres med en massefylde på 1,5 x 105/cm2 i N2 medium (DMEM/F12 medium + 3 mg/mL glukose + 3 mg/mL lipid-rich kvæg serum albumin (LBSA) + 1:100 N2 supplement + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL pen/strep + 1 mM L-glutamin) på en vævskulturbehandlet plade til efterfølgende PCR- og western bloteksperimenter eller på et vævskulturkammer til immunfluorescenceforsøg.
- På dag 9skal du udskifte det gamle medium med et frisk N2-medium.
- På dag 10skal du skifte N2-mediet med N2/B27 medium (50% DMEM/F12 og 50% neural basal, 3 mg/mL LBA, 1:200 N2 supplement, 1:100 B27 supplement, 50 U/mL pen/strep og 1 mM L-glutamin).
- På dag 11-12, høste neuroner som følger. Vask cellerne med 1x PBS, tilsæt trypsin, og inkuber kulturen i 37 °C inkubatoren i 3 min, før trypsin neutraliseres med medium og centrifuge ved 200 x g i 3 min.
3. Karakterisering af mESC'er og differentierede celler
- Alkalisk fosfatase (AP) assay
- Brug et sæt til at vurdere alkalisk fosfataseaktivitet (se materialetabellen).
- Fjern mediet fra kulturpladen og vask EFC'erne med 1x PBS.
- Tilsættes 1 mL af fixopløsningen (består af formaldehyd og methanol), der følger med sættet til pladen og inkuberes ved stuetemperatur i 2-5 min.
BEMÆRK: Overinkubation i fixopløsningen kan kompromittere AP-aktiviteten. - Tag fixløsningen ud, vask EFC'erne med 1x PBS, og efterlad en del PBS i pladen.
BEMÆRK: Hold EFC'erne fugtige i PBS for ikke at kompromittere AP-aktiviteten. - Ap-opløsningen forberedes ved at blande A-, B- og C-substratopløsningerne ved 1:1:1-forholdet. Bland først A- og B-opløsninger, og inkuber blandingen ved stuetemperatur i 2 min, før C-opløsningen tilføjes.
- Fjern 1x PBS og tilsæt AP-opløsningen, der er forberedt tidligere.
- Inkuber EFC'erne i ca. 15 minutter i mørke ved at pakke kulturpladen ind med aluminiumsfolie eller udføre trin 3.5 i et mørkt rum.
- Overvåg reaktionen, og fjern reaktionsopløsningen, når opløsningen bliver lys for at undgå ikke-specifik farvning.
- Vask EFC'erne to gange med 1x PBS.
- Undgå, at prøven tørrer ved at dække EFC'erne med 1x PBS eller monteringsmedium.
BEMÆRK: Der vises en rød eller lilla plet for AP-udtrykket. Pladen kan opbevares i et køleskab på 4 °C.
- RT-qPCR
- Indsamle celler på forskellige stadier ved at følge trin 1.6-1.7 og 2.4 for EFC'er og EBs og NPC'er, henholdsvis.
- Isoler RNA ved hjælp af RNA-, DNA- og proteinudvindingsopløsning (se Materialetabel).
- Generer cDNA med et omvendt transskriptasesæt (se materialetabellen), og følg producentens manual.
- Fiksering og integrering
- Høst EBs og NPC'er som beskrevet ovenfor (trin 2.6) og fastgør dem med 4% paraformaldehydopløsning (PFA) i 1x PBS i 30 min ved stuetemperatur.
- Fjern PFA og vask prøven med 1x PBS i 5 min.
- Prøven anbringes i en seriel fortynding af 1x PBS,10%-, 20% -og 30% saccharoseopløsninger ved 25\u201228 °C, hvor prøven overføres til den næste opløsning efter 30 minutters inkubation.
BEMÆRK: Prøven kan opbevares i 30 % saccharoseopløsningen ved 4 °C, før indlejringstrinnet fortsættes. - Våd pipettespidsen med saccharoseopløsning, før prøven placeres (uden at stable dem) i midten af kryoformen og pipetten ud af den overskydende væske.
BEMÆRK: Filterpapir kan også bruges til at fjerne den overskydende opløsning. Befugtning af pipettespidsen med saccharoseopløsning er vigtig for at forhindre, at EBs og NPC'er klæber til spidsens vægge. - Tilføj forsigtigt optimal skæretemperatur (OCT) løsning til formen uden at genoplive prøverne og fjerne overskydende bobler med en pipette.
- Placer formen med prøven på en laboratorieblander ved lav hastighed for at omrøre prøven i 15 min. Dette hjælper med at afvikle EBs og NPC'er til bunden, hvis de er suspenderet igen i OLT-løsningen.
- Fastfryse hurtigt prøven ved at placere formen i flydende nitrogen eller på tøris.
BEMÆRK: Prøver kan opbevares i en -70 °C-fryser, før de fortsætter til næste trin.
- Cryosectioning
- Indstil kryostat til at køle ned til -20 til -18 °C, før prøven overføres til instrumentet.
- Tag den frosne OCT-blok ud af formen, og fastgør den på holderen med en lille OCT-opløsning placeret på holderens overflade.
- Juster OCT-blokken, så EBs og NPC'er er tættest på klingen for at sikre, at prøven ikke går tabt under indsnitningen.
- Del forsigtigt 10 μm af blokken, og vær meget opmærksom på de skiver, der indeholder prøven.
- Placer hurtigt OKT-skiven, der indeholder prøven, på vævsintegreringsglassliden, og lad OKTskiverne lufttørre i 1 time ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Prøverne kan opbevares ved -70 °C til senere brug.
- Immunfluorescence (HVIS)
- Blok OCT sektioner eller kulturkamre, der indeholder neuroner i 10% normal æsel serum/0,1% Triton X-100 i 1x PBS i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuberes prøverne i primær antistof fortyndet i 5% normalt æselserum/0,05% Triton X-100 i 1x PBS natten over ved 4 °C.
- Vask prøver i 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre gange i 5 min hver vask.
- Inkuberes prøverne med sekundært antistof fortyndet i 5% normalt æselserum/0,05% Triton X-100 i 1x PBS i 1 time ved stuetemperatur.
- Vaskeprøver i 1x PBS/0,1% Triton X-100 tre gange i 5 min hver vask derefter inkubere prøverne i 1 μg/mL DAPI.
- Monter prøverne med en coverlip og nogle montering medium og lad det tørre.
- Overhold prøverne under et fluorescensmikroskop.
- RNA-seq analyse
- Saml cellerne på forskellige stadier, og udfør RNA-ekstraktion (se trin 3.2).
- Forbered cDNA-bibliotekerne, udfør dyb sekventering og dataanalyse i henhold til den protokol, der er beskrevet i Wang et al.8.
- Udfør GO-analysen (Gene Ontology) ved hjælp af R-pakken, clusterProfiler.
- Flowcytometri
- SPC'er opsamles ved at følge trin 1.6-1.7 og genbruge cellerne i medium. Indsaml EBs og NPC'er ved at følge trin 2.4 og genbruge cellerne i medium.
- Filtrer celleaffjedringen ved hjælp af 40 μm nyloncelles si i et nyt 15 mL konisk rør.
- Mål GFP-signalet på prøverne ved hjælp af flowcytometeret (udført af instituttets kernefacilitet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som en repræsentation af vores metode udførte vi et EB-, NPC- og neurondifferentieringseksperiment på E14-celler. E14-celler blev kultiveret på γ bestrålede MEF'er (figur 1A),indtil den γ bestrålede MEF-population udvandede. Vi bekræftede pluripotency af E14 celler ved at udføre alkaliske Fosphatase (AP) farvning (Figur 1B) og senere RT-qPCR (se nedenfor) for Nanog og Oct4 markører. De γ bestrålede MEF-fri E14-celler blev derefter induceret til differentiering ved hjælp af den protokol, der er beskrevet i figur 2A. Kort sagt blev der sået mellemdæmningsmediedråber på 20 μL indeholdende 500 celler på kulturpladens låg (se protokolafsnit 2 for nærmere oplysninger). De 50000, der blev dannet, blev derefter indsamlet og sat i suspension i nye differentieringsmedier. Fra dag 4 til dag 8 af differentiering blev der tilføjet 5 μM RA til kulturpladerne for at fremkalde NPC'er. Differentierede EBs viste rund form, og deres størrelse fortsatte med at stige under differentiering (figur 2B). På dag 8 blev NPC'erne høstet og trypsiniseret, og derefter blev den resulterende enkeltcelleophæng forgyldt i et vævskulturkammer i DMEM/F12 medium med N2-tillæg og senere i B27-tillæg. Ved dag 10 synes NPC'er, der adskiller sig i neuroner, at have langstrakt celleform (Figur 2B).
For yderligere at evaluere vores differentieringseksperiment udførte vi immunfluorescence (IF) eksperimenter på E14 NPC'er på dag 8 og E14 neuroner på dag 12. Vi observerede positiv farvning til nestin i NPC'er og neurofilament (NF) signal til neuroner (Figur 3A). Alternativt bekræftede RT-qPCR og RNA-seq induktion af NPC-markørgener og tab af pluripotencygener i NPC'er (figur 3B,D,F). Som en kvantitativ metode til at teste succesen af ØSU differentiering, vi differentieret en mus ESC linje udtrykker en Sox1 promotor-drevet GFP reporter9, efterfulgt af flow cytometri analyse på EFC'er og NPC'er. Vi konstaterede, at 58,7 % af de samlede celler i NPC-stadiet er GFP-positive, mens GFP-signalet er 0,0 % i ØSU-stadiet (figur 3C). For at profilere de transskriptomiske ændringer under differentiering blev RNA-seq-eksperimenter for E14 EÆK'er, EB dag 3 og NPC dag 8 udført og afslørede genklynger forbundet med de respektive faser (Figur 3D). Generne i RNA-seq varmekortet blev sorteret ud fra deres udtryksniveauer for at identificere differentierede gener i de forskellige stadier under differentiering. Gene Ontology (GO) analyse for de fire genklynger viste, at disse klynger svarer til forskellige cellulære funktioner eller veje, der angiver, at de tre cellestadier af mESC neuronal differentiering hver har en gruppe af gener, der er stærkt udtrykt i deres respektive fase, men ikke andre (Figur 3E). For eksempel er gener i klynge 3 stærkt udtrykt i E14 NPC'er sammenlignet med andre stadier og svarer til veje relateret til neuronal udvikling. Klynger 1, 2 og 4 indeholder ikke stærkt udtrykte gener relateret til nogen kimlag afstamning specifikationer, men de er relateret til cellulære vækst og spredning. RNA-seq og den ledsagende GO-analyse viste således, at E14-cellerne har differentieret sig i den neuronale afstamning efter dag 8 af differentiering.
Figur 1: E14 E ESC'er i kultur. (A) De lette mikroskopbilleder viser E14-celler (sort pil), der vokser i kolonier oven på de γ bestrålede MEF'er. E14 kolonier fortsætter med at formere sig som set i koloni størrelse forskel mellem dag 1 og dag 3 kulturer. (B) Bekræftelse af pluripotency af E14 EFC'er ved alkalisk fosfatase (AP) plet. Lilla pile angiver de mESC'er, der var positive for AP-pletten. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: E14 differentiering i EBs, NPC'er og neuroner. (A) Skemaet opsummerer de vigtigste trin til at differentiere E14-celler i EB' er, NPC'er og neuroner. (B) E14 E ESC'er, der dyrkes i medium uden LIF og 2i i en suspensionsplade, danner individuelle kugler af EBs, der er synlige på dag 2, hvor de fortsætter med at vokse og udvide sig i størrelse i de efterfølgende dage. RA tilføjes på dag 4 af differentiering for at fremkalde differentiering i NPC'er. Efter 4 dages induktion er disse NPC'er belagt til differentiering i neuroner, som er vist i bundpanelet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Karakterisering af differentierede celler. (A) Immunofluorescence billeder i det øverste panel viser NPC-holdige EBs på dag 8 undersøgt for nestin (grøn) og kerner (DAPI, blå). Det nederste panel viser immunofluorescence billeder for neuroner på dag 12 undersøgt for neurofilament (grøn). Den røde boks i de flettede billeder zoomes ind i 3x for bedre visning. (B) RT-qPCR-analyse, der viser pluripotency markører (Nanog og Oct4) og NPC markører (Pax6, NeuroD1,og Nes) af E14 ECS og NPC'er. Fejl barer er ± SD. (C) E14 celler udtrykker en Sox1 promotor-drevet GFP reporter blev differentieret i NPC'er. Både EPC'er og NPC'er på dag 8 blev kvantificeret for positivt GFP fluorescerende signal med flowcytometri. (D) Heatmap viser z-scorer for den bestemte FPKM af de gener udtrykt i ØSU, EB og NPC faser. Fire forskellige genklynger blev identificeret, der betyder grupper af gener, der er differentieret udtrykt i enten ESC, EB eller NPC fase. (E) GO-analysen blev udført ved hjælp af R-pakken clusterProfiler på de fire klynger, der er identificeret i RNA-seq. (F) Grafen viser FPKM værdier for tre andre pluripotency markører, Sox2, Klf4, og Myc samt neurale markører, NeuN, Map2, og Tubb3 for E14 celler på ESC, EB dag 3, og NPC dag 8 faser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden til neural differentiering af museememinnale stamceller er blevet etableret i årtier , og forskere har fortsat med at ændre de tidligere protokoller eller skabe nye til forskellige formål7,10,11. Vi brugte en række analyser til omfattende at analysere effektiviteten og fremskridtene af differentieringsstadierne af mESCs til neuroner, som kan bruges til analyse af andre slægtsdifferentiering af mus eller menneskelige EFC'er. Desuden har vores tilgange vist sig at være nyttige værktøjer til at evaluere virkningen af specifikke gener eller veje på neuronal differentiering in vitro8.
Med vores metoder forpligter pluripotente uindtøjede EFC'er behandlet med retinosyre (RA) sig til den neurale afstamning med en høj effektivitet og induceres yderligere til at generere neuroner7. For at forbedre den vellykkede differentiering af ES-celler i neurale celler og reducere heterogeniteten er det vigtigt at holde ES-cellerne i en udifferentieret tilstand12. Ikke-proliferative MEF'er, der behandles med γ-bestråling eller mitomycin C, fungerer til at opretholde ESC'ernes pluripotency og give et stillads for deres vækst13,14. For at opnå ensartede resultater starter vi hvert differentieringseksperiment med mESC'er, der dyrkes på γ bestrålede MEF'er. Efter et par passager dør de γ bestrålede MEF'er ud, og kulturen bliver til sidst homogen for mESC-celler. Alternativt kan mESC'erne forgyldes på gelatine i ca. 45 minutter, før γ bestrålede MEF'er er seedet for bedre at fjerne dem på den næste passage. Leukæmihæmningsfaktor (LIF) har længe været anvendt til at opretholde den pluripotency tilstand af kultiverede mus ES celler ved at aktivere JAK / STAT vej15,16,17. For nylig blev PD0325901 (PD, en MEK-hæmmer) og CHIR99021 (CH, en GSK-hæmmer) fundet at give yderligere pluripotency vedligeholdelse af ES-cellerne3,18. I vores protokol, vi kultur mESCs med disse hæmmere sammen med LIF at opretholde høj pluripotency af mESCs.
En anden afgørende faktor for at opnå en vellykket differentiering er kvaliteten af EB'er. Vi udfører differentiering af E14 celler ved hængende drop metode, som er blevet anvendt af andre efterforskere5,19,20. Med denne metode har enkelte ES-celler lov til at suspendere i differentiering medium dråbe i 2 dage, hvor de spontant aggregere og danne EBs. De resulterende EBs er typisk mere veldefinerede med hensyn til deres morfologi (Figur 2B) sammenlignet med metoden til at suspendere isolerede mESC'er i medium, hvilket resulterer i EB-størrelser i et meget bredere interval i vores erfaring (data ikke vist). For at forhindre, at EBs fastgøres til pladerne, er det vigtigt at lave en lavhastighedsrotation fra dag 3, der fortsætter gennem differentieringsprocessen. EB'erne induceres til at differentiere sig til NPC'er ved at behandle dem med RA. De resulterende NPC'er fra RA-behandling på EB dag 4 er typisk heterogene for neurale celler som oligodendrocytter og astrocytter21. Ved hjælp af RT-qPCR eller immunofluorescence, NPC befolkning kan undersøges for neuron og andre neurale afstamning markører såsom Gfap for astrocytter og Olig2 for oligodendrocytter. For yderligere at fremkalde differentiering af NPC'er i neuroner, NPC'erne er kultiveret i optimal neuron medium, hvor de vigtigste komponenter er N2 og B27 kosttilskud. N2 supplement primært funktioner til at hjælpe NPC'er til at forpligte sig til neuronal afstamning, mens B27 supplement funktioner til at opretholde levetiden af neuroner.
Prøverne kan indsamles på tværs af differentieringsperioden (f.eks. ESC-fase, EB-dag 2, EB-dag 4, NPC-dag 6, NPC-dag 8, neuroner dag 10 og neuronerdag 12) for at spore differentieringsprocessen ved at udføre RT-qPCR for pluripotency og ectoderm markører. Hvis du sammenligner pluripotencymarkørerne som Oct4, Nanog, Sox2, Klf4og Myc mellem de forskellige cellestadier, kontrolleres pluripotency af mESC'erne (Figur 3B,F). For at undersøge effektiviteten af den neurale differentiering, markører for mesodermlaget som Hand1, Snai1og Tbxt; og endoderm lag såsom Eomes og Gata4 kan også undersøges for (data ikke vist). Yderligere verifikation kan udføres med immunfluorescence (IF) sondering for NPC eller neuronale markører (Figur 3A). Disse metoder er dog ikke kvantitative og forudindtagede over for de valgte markører. For at overvinde disse begrænsninger inkorporerer vi flowcytometri- og RNA-seq-analyser (Figur 3C\u2012F). Den cellelinje, der anvendes i flowcytometrieksperimentet, er en Sox1-GFP E14-cellelinje, som blev brugt specifikt i dette eksperiment til at vurdere kvaliteten af NPC-differentieringsproceduren. Sox1 er en af de tidligste specifikke neuronale markør under neuroectoderm udvikling22 dermed gør det til en fremragende markør for NPC afstamning. Sox1 kan undersøges for at bruge RT-qPCR eller Western blot til at evaluere NPC befolkning. Disse analyser er særligt gavnlige for at undersøge differentieringsfejlen forårsaget af genmanipulation eller kemisk behandling.
Det er vigtigt at bemærke, at der er et par begrænsninger i vores protokol, der præsenteres her. Først og fremmest præsenterer vi kun den omfattende analyse for en mESC-cellelinje af vild type. Andre ESC-linjer, der stammer fra mus eller mennesker, kan kræve ændringer og yderligere optimering i protokollen for at sikre en vellykket og effektiv neurondifferentiering. For det andet præsenterer vi en in vitro neuron differentieringsmetode, som naturligvis bærer sit eget sæt begrænsninger. Som tidligere nævnt behandles EBs med et suprafysiologisk niveau af RA for at drive dem mod NPC-slægten. De resulterende NPC'er placeres derefter i neuron-optimale medier for at efterligne de fysiologiske forhold og tilskynde til neuron afstamning engagement, vækst og levetid. Her, N2 og B27 kosttilskud bruges til kultur neuroner, men andre kosttilskud er også tilgængelige såsom NS2123 til lignende formål, som kan ændre succes og effektivitet neuron differentiering. Disse betingelser er syntetisk rekonstitueret i cellekultur assays, som ikke kan fuldt ud repræsenterer fysiologiske forhold. Kvaliteten af EBs, NPC'er og neuroner afhænger i høj grad af de begyndende mESC'er. mESC'er, der er blevet vedtaget for mange gange og holdt i kultur i mere end 1 uge, begynder typisk at miste pluripotency og kan muligvis ikke med held gennemgå differentiering. Således er opretholdelse af mESC'erne i en optimal tilstand nøglen til at sikre, at de effektivt kan differentiere sig til EBs, NPC'er og neuroner. Andre neuron kultur metoder såsom 3D-modeller er også blevet foreslået at bedre efterligne fysiologiske forhold24,25,26 undertiden på bekostning af gennemløb og gennemførlighed27,28. Vi mener, at vores protokoller er nyttige til at karakterisere disse 3D-kulturmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere erklærer, at der ikke er nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra NIH (1R35GM133496-01) til Z. Gao. Vi vil gerne takke Dr. Ryan Hobbs for hjælpen i afsnittet. Vi takker Penn State College of Medicine's kernefaciliteter, herunder Genom Sciences og Bioinformatik, Advanced Light Microscopy Imaging, og Flow Cytometri. Vi takker også Dr. Yuka Imamura for hjælpen i RNA-seq analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| - Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| - Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| - Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| - Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
References
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
- Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
- Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
- Park, Y. -G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
- Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
- Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
- Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
- Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
- Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
- Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
- Antill-O'Brien, N., Bourke, J., O'Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).
