Summary
Descrevemos o procedimento para a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias do rato em células neuronais usando o método de queda de suspensão. Além disso, realizamos uma análise fenotípica abrangente através do RT-qPCR, imunofluorescência, RNA-seq e citometria de fluxo.
Abstract
Descrevemos o procedimento passo-a-passo para cultivar e diferenciar células-tronco embrionárias do camundongo em linhagens neuronais, seguido por uma série de ensaios para caracterizar as células diferenciadas. As células-tronco embrionárias do rato E14 foram usadas para formar corpos embrionários através do método de queda suspensa, e então induzidas a se diferenciar em células progenitoras neurais por ácido retinóico, e finalmente diferenciadas em neurônios. A reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR) e os experimentos de imunofluorescência revelaram que os progenitores e neurônios neurais exibem marcadores correspondentes (nestin para progenitores neurais e neurofilamento para neurônios) nos dias 8 e 12 pós-diferenciação, respectivamente. Experimentos de citometria de fluxo em uma linha E14 expressando um repórter gfp orientado pelo promotor Sox1 mostraram que cerca de 60% das células no dia 8 são GFP positivas, indicando a diferenciação bem sucedida das células progenitoras neurais nesta fase. Finalmente, a análise do RNA-seq foi utilizada para traçar o perfil das alterações transcriômicas globais. Esses métodos são úteis para analisar o envolvimento de genes e caminhos específicos na regulação da transição da identidade celular durante a diferenciação neuronal.
Introduction
Desde sua primeira derivação da massa celular interna dos blastocistos do camundongo em desenvolvimento1,2, as células-tronco embrionárias do rato (mESC) têm sido usadas como ferramentas poderosas para estudar a autoconexão e diferenciação das células-tronco3. Além disso, estudar a diferenciação do MEESC leva a uma tremenda compreensão dos mecanismos moleculares que podem melhorar a eficiência e a segurança na terapia baseada em células-tronco no tratamento de doenças como distúrbios neurodegenerativos4. Em comparação com os modelos animais, este sistema in vitro oferece muitas vantagens, incluindo simplicidade na prática e avaliação, baixo custo na manutenção de linhas celulares em contraste com os animais e relativa facilidade em manipulações genéticas. No entanto, a eficiência e a qualidade dos tipos de células diferenciadas são frequentemente afetadas por diferentes linhas de mESCs, bem como pelos métodos de diferenciação5,6. Além disso, os ensaios tradicionais para avaliar a eficiência de diferenciação dependem do exame qualitativo de genes marcadores selecionados que carecem de robustez e, portanto, não conseguem compreender as mudanças globais na expressão genética.
Aqui pretendemos usar uma bateria de ensaios para avaliação sistemática da diferenciação neuronal. Utilizando ambas as análises in vitro tradicionais em marcadores selecionados e RNA-seq, estabelecemos uma plataforma para medição da eficiência de diferenciação, bem como as alterações transcriômicas durante este processo. Com base em um protocolo previamente estabelecido7,geramos corpos embrionários (EBs) através da técnica de queda suspensa, seguidos pela indução usando quantidade suprafisiológica de ácido retinóico (RA) para gerar células progenitoras neurais (NPCs), que foram posteriormente diferenciadas aos neurônios com meio de indução neural. Para examinar a eficiência da diferenciação, além dos ensaios tradicionais de RT-qPCR e imunofluorescência (IF), realizamos RNA-seq e citometria de fluxo. Essas análises fornecem uma medição abrangente da progressão da diferenciação específica do estágio.
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Protocol
1. cultura mESC
- Cubra uma placa tratada com 10 cm de tecido com gelatina de 0,1% e deixe que a gelatina se estafina por pelo menos 15-30 minutos antes de aspirar.
- Sementes γ camundongos embrionários (MEFs) um dia antes de cultivar os mESCs no meio mESC pré-aquecido (médio águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 15% de soro bovino fetal (FBS), aminoácidos não essenciais, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato de sódio, LIF, PD0325901 (PD) e Chir99021 (CH)).
- Permita que os MEFs irradiados de γ se acomodem e se anexem à superfície da placa antes de estancar as células E14.
- Descongele E14 ESCs em banho-maria de 37 °C e transfira rapidamente as células em um tubo cônico de 15 cm com meio mESC quente. Pelota as células a 200 x g por 3 min e remova o supernasce.
- Resuspengem as células em 10 mL de mESC médio e emplaque as células na placa de cultura contendo os MEFs irradiados γ anteriormente. Incubar a cultura celular em uma incubadora de 37 °C abaixo de 5% de CO2.
- Para a passagem de cultura, aspire e o médio e lave a placa com 1x PBS estéril. Adicione 0,05% de trippsina suficiente para cobrir a superfície da placa e incubar a 37 °C por 3 min.
- Neutralizar a trippsina com mESC médio e pipeta para gerar suspensão unicelular. Centrifugar as células a 200 x g por 3 min e remover o supernante.
- Conte as células com um hemótmetro ou contador de células e sementes cerca de 5,0 x 105 células em uma placa de cultura de 10 cm.
- Resuspenque as células em 10 mL de mESC médio, plaque as células na placa de cultura de tecido revestida de gelatina e incuba culturas como descrito anteriormente.
NOTA: Recomenda-se que os mESCs sejam aprovados a cada 2 dias para evitar que as células se diferenciem em suas colônias. O fenol vermelho no médio funciona apenas como um indicador de pH e dependendo da densidade celular, pode ficar amarelado (mais ácido), mais cedo do que 2 dias. Portanto, pode ser necessário mudar o meio todos os dias. Os MEFs irradiados γ acabarão morrendo depois de algumas passagens.
2. EB, NPC e diferenciação de neurônios
- Executar o protocolo de passagem de cultura mencionado anteriormente e contar as células (etapas 1.7-1.10).
- Método de queda de suspensão(dia 0)
- Para uma placa de cultura celular de 10 cm, contar cerca de 2,5 x 104 células onde 5,0 x 10 2 célulasserão suspensas em 20 μL de diferenciação (DMEM com 15% de FBS, aminoácidos não essenciais, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina e pirudo de sódio). Cerca de 50 gotículas de 20 μL contendo as células podem ser banhadas em uma placa de 10 cm.
- Alíquotar o número apropriado de células, e então centrifugar as células a 200 x g por 3 min e remover o supernante.
- Resuspenncie as células no volume adequado do meio de diferenciação para uma densidade celular de 5,0 x 102 células por 20 μL (por exemplo, 2,5 x 104 células em 1 mL de meio de diferenciação).
- Usando uma micropipette ou uma pipeta repetidora, coloque 20 gotículas de μL da suspensão celular na tampa da placa de cultura tecidual. Certifique-se de que as gotículas não estão muito próximas umas das outras para evitar que elas se fundam.
NOTA: As gotículas podem ser banhadas em uma placa de fixação tratada com cultura tecidual ou placa de suspensão, pois serão colocadas na tampa e não na placa em si. Para uma abordagem mais viável e estéril, plaque as gotículas em uma placa de cultura tecidual de fixação e transfira-as para uma placa de suspensão como descrito abaixo. - Encha a placa com 5-10 mL de 1x PBS e coloque cuidadosamente a tampa de volta na placa. Incubar a cultura na incubadora de 37 °C.
NOTA: O PBS é adicionado à placa de cultura para evitar que as gotículas sequem.
- No dia 2,use uma micropipette para coletar as gotículas da tampa e colocá-las em uma placa de suspensão de cultura celular de 10 cm preenchida com 10 mL de meio de diferenciação. Incubar a cultura em um agitador orbital tremendo em baixa velocidade na incubadora.
- No dia 4, para colher os EBs, coletar as células, centrífugas a 200 x g por 3 min, e remover o sobrenante.
NOTA: Os EBs também podem ser lavados com 1x PBS de acordo com os requisitos dos experimentos subsequentes. - Para continuar o procedimento e induzir a diferenciação do EB em células progenitoras neurais (NPCs), prepare o meio de diferenciação com ácido retinóico de 5 μM (RA).
- Remova o meio antigo pelo menos os EBs a 100 x g por 3 min ou deixe que os EBs se acomodem antes de aspirar o meio antigo. Adicione 10 mL do meio de diferenciação contendo RA de 5 μM à placa de cultura.
- No dia 6,substitua pelo menos metade do meio por meio fresco contendo RA de 5 μM, inclinando a placa e pipetando o meio como descrito acima.
NOTA: Recomenda-se que pelo menos metade do meio seja substituída por um meio fresco contendo RA nos dias 5 e 7. Tome nota do indicador vermelho fenol; se ficar amarelado, é melhor substituir todo o meio. - No dia 8,colhe os NPCs coletando as células, centrifugando a 200 x g por 3 min, e removendo o sobrenante.
NOTA: Os NPCs também podem ser lavados com 1x PBS de acordo com as necessidades de experimentos subsequentes. Se necessário, os NPCs podem ser congelados e descongelados novamente para cultura e análise posteriores. Se os NPCs forem cultivados, a accutase também pode ser usada como alternativa à trippsina. - Para continuar o procedimento e diferenciar os NPCs em neurônios, colete NPCs em um tubo cônico de 15 mL por centrifugação, dissociá-los com trippsina e incuba-los a 37 °C por 3 min. Pipetar os NPCs para garantir que todos os agregados de NPC sejam dissociados e neutralizar o trypsin com o meio.
- Filtre as células com coador de células de nylon de 40 μm e conte as células antes de emplacar-as a uma densidade de 1,5 x 105/cm2 em n2 médio (médio DMEM/F12 + 3 mg/mL de glicose + 3 mg/mL rico em lipídios albumina de soro bovino (LBSA) + 1:100 Suplemento N2 + 10 ng/mL bFGF + 50 U/mL pen/strep + 1 mM L-glutamine) em uma placa tratada de cultura tecidual para experimentos subsequentes de PCR e blot ocidental; ou em uma câmara de cultura de tecidos para experimentos de imunofluorescência.
- No dia 9,substitua o antigo meio por um novo meio N2.
- No dia 10,troque o n2 médio com n2/B27 médio (50% DMEM/F12 e 50% basal neural, 3 mg/mL LBA, 1:200 N2 suplemento, 1:100 B27 suplemento, 50 U/mL caneta/estreptococos, e 1 mM L-glutamina).
- Nos dias 11-12,colhe os neurônios da seguinte forma. Lave as células com 1x PBS, adicione trippsina e incuba a cultura na incubadora de 37 °C por 3 minutos antes de neutralizar a trippsina com média e centrífuga a 200 x g por 3 min.
3. Caracterização de mESCs e células diferenciadas
- Ensaio de fosfatase alcalina (AP)
- Use um kit para avaliar a atividade de fosfates alcalina (ver tabela de materiais).
- Retire o meio da placa de cultura e lave os ESCs com 1x PBS.
- Adicione 1 mL da solução fixa (consiste em formaldeído e metanol) fornecido com o kit à placa e incuba-o à temperatura ambiente por 2-5 min.
NOTA: A super incubação na solução de correção pode comprometer a atividade AP. - Remova a solução de correção, lave os ESCs com 1x PBS e deixe alguma quantidade de PBS na placa.
NOTA: Mantenha os ESCs úmidos no PBS para não comprometer a atividade ap. - Prepare a solução AP misturando as soluções de substrato A, B e C na proporção 1:1:1. Misture primeiro as soluções A e B e incubar a mistura à temperatura ambiente por 2 minutos antes de adicionar a solução C.
- Remova o PBS 1x e adicione a solução AP preparada anteriormente.
- Incubar os ESCs por cerca de 15 minutos no escuro, embrulhando a placa de cultura com papel alumínio ou realizando o passo 3.5 em uma sala escura.
- Monitore a reação e remova a solução de reação quando a solução ficar brilhante para evitar manchas não específicas.
- Lave os ESCs duas vezes com 1x PBS.
- Evite que a amostra seque, cobrindo os ESCs com 1x PBS ou meio de montagem.
NOTA: Uma mancha vermelha ou roxa aparecerá para a expressão AP. A placa pode ser armazenada em uma geladeira de 4 °C.
- RT-qPCR
- Coletar células em vários estágios seguindo as etapas 1.6-1.7 e 2.4 para ESCs e EBs e NPCs, respectivamente.
- Isolar o RNA usando solução de RNA, DNA e extração de proteínas (ver Tabela de Materiais).
- Gerar cDNA com um kit de transcriptase reversa (ver a Tabela de Materiais) e seguir o manual do fabricante.
- Fixação e incorporação
- Colher EBs e NPCs conforme descrito acima (passo 2.6) e corrigi-los com solução de paraformaldeído (PFA) de 4% em 1x PBS por 30 minutos à temperatura ambiente.
- Retire o PFA e lave a amostra com 1x PBS por 5 minutos.
- Coloque a amostra em uma diluição serial de 1x PBS, 10%-, 20%-, e 30% de soluções de sacarose a 25\u201228 °C onde a amostra é transferida para a próxima solução após 30 minutos de incubação.
NOTA: A amostra pode ser armazenada na solução de sacarose de 30% a 4 °C antes de continuar com a etapa de incorporação. - Molhe a ponta da pipeta com solução de sacarose antes de colocar a amostra (sem empilhá-las) no centro do molde crio-mold e pipeta para fora do excesso de líquido.
NOTA: O papel do filtro também pode ser usado para remover a solução em excesso. Molhar a ponta da pipeta com solução de sacarose é importante para evitar que os EBs e NPCs grudem nas paredes da ponta. - Adicione cuidadosamente a solução de temperatura de corte (OCT) ideal ao molde sem reutilizar as amostras e remova bolhas em excesso com uma pipeta.
- Coloque o molde com a amostra em uma batedeira de laboratório em baixa velocidade para agitar levemente a amostra por 15 minutos. Isso ajuda a resolver os EBs e NPCs até o fundo se eles forem resuspensados na solução OCT.
- Congele rapidamente a amostra colocando o molde em nitrogênio líquido ou em gelo seco.
NOTA: As amostras podem ser armazenadas em um congelador de -70 °C antes de continuar para o próximo passo.
- Criocendo
- Defina o criostat para esfriar para -20 a -18 °C antes de transferir a amostra para o instrumento.
- Retire o bloco OCT congelado do molde e fixe-o no suporte com uma pequena solução oct colocada na superfície do suporte.
- Alinhe o bloco OCT para que os EBs e NPCs estejam mais próximos da lâmina para garantir que a amostra não seja perdida durante a secção.
- Seção cuidadosa 10 μm do bloco e preste muita atenção às fatias que contêm a amostra.
- Coloque rapidamente a fatia OCT contendo a amostra no slide de vidro de incorporação de tecido e permita que as fatias de OCT sequem ao ar por 1 h à temperatura ambiente.
NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -70 °C para uso posterior.
- Imunofluorescência (IF)
- Bloco de seções OCT ou câmaras de cultura contendo neurônios em soro de burro 10% normal/0,1% Triton X-100 em 1x PBS por 1 h à temperatura ambiente.
- Incubar as amostras em anticorpo primário diluído em 5% de soro de burro normal/0,05% Triton X-100 em 1x PBS durante a noite a 4 °C.
- Lave amostras em 1x PBS/0,1% Triton X-100 três vezes por 5 min cada lavagem.
- Incubar as amostras com anticorpo secundário diluído em 5% de soro de burro normal/0,05% Triton X-100 em 1x PBS por 1h à temperatura ambiente.
- Lave amostras em 1x PBS/0,1% Triton X-100 três vezes por 5 min cada lavagem e incubar as amostras em 1 μg/mL DAPI.
- Monte as amostras com um deslizamento de tampa e algum meio de montagem e deixe secar.
- Observe as amostras sob um microscópio de fluorescência.
- Análise de RNA-seq
- Recolher as células em vários estágios e realizar a extração de RNA (ver passo 3.2).
- Preparar as bibliotecas cDNA, realizar sequenciamento profundo e análise de dados de acordo com o protocolo descrito em Wang et al.8.
- Execute a análise de Ontologia genética (GO) usando o pacote R, clusterProfiler.
- Citometria de fluxo
- Colete ESCs seguindo as etapas 1.6-1.7 e resuspenque as células em médio. Colete os EBs e NPCs seguindo o passo 2.4 e resuspenque as células em médio.
- Filtre a suspensão celular usando o coador de células de nylon de 40 μm em um novo tubo cônico de 15 mL.
- Meça o sinal de GFP das amostras utilizando o citômetro de fluxo (realizado pela instalação central da instituição).
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Representative Results
Como representação do nosso método, realizamos um experimento de EB, NPC e diferenciação de neurônios em células E14. As células E14 foram cultivadas em MEFs irradiados γ(Figura 1A)até que a população de MEF irradiada γ diluída. Confirmamos a pluripotência das células E14 realizando coloração de Fosfattase Alcalina (AP)(Figura 1B)e posteriormente RT-qPCR (veja abaixo) para marcadores Nanog e Oct4. As células E14 sem MEF γ foram então induzidas para diferenciação usando o protocolo descrito na Figura 2A. Resumidamente, as gotículas de mídia de diferenciação de 20 μL contendo 500 células foram semeadas na tampa da placa de cultura (ver protocolo seção 2 para detalhes). Os EBs formados foram então coletados e colocados em suspensão em novos meios de diferenciação. Do dia 4 ao 8 do dia 8 de diferenciação, 5 μM RA foi adicionado às placas de cultura para induzir NPCs. Os EBs diferenciados mostraram forma redonda e seu tamanho continuou a aumentar durante a diferenciação(Figura 2B). No dia 8, os NPCs foram colhidos e experimentados, e então a suspensão de célula única resultante foi banhada em uma câmara de cultura de tecido no meio DMEM/F12 com suplemento N2 e posteriormente em suplemento B27. Até o dia 10, os NPCs diferenciados em neurônios parecem ter forma de célula alongada(Figura 2B).
Para avaliar ainda mais nosso experimento de diferenciação, realizamos experimentos de imunofluorescência (IF) em NPCs E14 nos neurônios 8 e E14 no dia 12. Observou-se coloração positiva para nestin em NPCs e sinal de neurofilamento (NF) para neurônios(Figura 3A). Alternativamente, o RT-qPCR e o RNA-seq confirmaram a indução de genes marcadores NPC e a perda de genes de pluripotência em NPCs(Figura 3B,D,F). Como um método quantitativo para testar o sucesso da diferenciação do ESC, diferenciamos uma linha ESC de mouse expressando um repórter GFP orientado pelo promotor Sox1 9,seguido pela análise de citometria de fluxo em ESCs e NPCs. Verificou-se que 58,7% do total de células no estágio NPC são GFP-positivo, enquanto o sinal GFP é 0,0% no estágio ESC(Figura 3C). Para traçar o perfil das alterações transcriômicas durante a diferenciação, foram realizados experimentos de RNA-seq para ESCs, EB dia 3 e NPC dia 8 e agrupamentos genéticos associados às respectivas etapas (Figura 3D). Os genes do mapa térmico RNA-seq foram classificados com base em seus níveis de expressão para identificar genes expressos diferencialmente nos diferentes estágios durante a diferenciação. A análise da Ontologia Genética (GO) para os quatro aglomerados genéticos mostrou que esses aglomerados correspondem a funções ou vias celulares distintas indicando que os três estágios celulares da diferenciação neuronal mESC cada um tem um grupo de genes altamente expressos em seu respectivo estágio, mas não outros(Figura 3E). Por exemplo, os genes do Cluster 3 são altamente expressos em NPCs E14 em comparação com outros estágios e correspondem a caminhos relacionados ao desenvolvimento neuronal. Os clusters 1, 2 e 4 não contêm genes altamente expressos relacionados a quaisquer especificações de linhagem de camadas de germes, mas estão relacionados ao crescimento e proliferação celular. Assim, a análise RNA-seq e acompanhando GO mostrou que as células E14 se diferenciaram na linhagem neuronal até o dia 8 de diferenciação.
Figura 1: E14 ESCs em cultura. (A) As imagens do microscópio de luz mostram células E14 (seta preta) crescendo em colônias no topo dos MEFs irradiados por γ. As colônias E14 continuam a proliferar como visto na diferença de tamanho da colônia entre as culturas do dia 1 e do 3º dia. (B) Confirmação da pluripotência dos ESCs E14 pela mancha alcalina fosfatase (AP). Setas roxas indicam os mESCs que deram positivo para a mancha DE AP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Diferenciação do E14 em EBs, NPCs e neurônios. (A) O esquema resume os principais passos para diferenciar células E14 em EBs, NPCs e neurônios. (B) ESCs E14 cultivados em médio sem LIF e 2i em placa de suspensão formam esferas individuais de EBs visíveis no dia 2 onde continuam a crescer e expandir em tamanho nos dias subsequentes. A RA é adicionada no 4º dia de diferenciação para induzir a diferenciação em NPCs. Após 4 dias de indução, esses NPCs são banhados para diferenciação em neurônios, que são mostrados no painel inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Caracterização de células diferenciadas. (A) Imagens de imunofluorescência no painel superior mostram EBs contendo NPC no dia 8 sondados para nestin (verde) e núcleos (DAPI, azul). O painel inferior mostra imagens de imunofluorescência para neurônios no dia 12 sondados para neurofilamento (verde). A caixa vermelha nas imagens mescladas são ampliadas em 3x para uma melhor visualização. (B) Análise RT-qPCR mostrando os marcadores de pluripotência (Nanog e Oct4) e marcadores NPC (Pax6, NeuroD1e Nes) de E14 ESCs e NPCs. As barras de erro são médias ± células SD. (C) E14 expressando um repórter GFP orientado pelo promotor sox1 foram diferenciadas em NPCs. Tanto os ESCs quanto os NPCs no dia 8 foram quantificados para sinal fluorescente GFP positivo com citometria de fluxo. (D) O mapa de calor mostra os escores z para o FPKM determinado dos genes expressos nas etapas ESC, EB e NPC. Quatro aglomerados genéticos distintos foram identificados significando grupos de genes que são expressos diferencialmente no estágio ESC, EB ou NPC. (E) A análise go foi realizada utilizando-se o pacote R, clusterProfiler, nos quatro clusters identificados no RNA-seq. (F) O gráfico mostra os valores FPKM para três outros marcadores de pluripotência, Sox2, Klf4e Myc, bem como marcadores neurais, NeuN, Map2e Tubb3 para células E14 nos estágios ESC, EB dia 3 e NPC 8. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método de diferenciação neural de células-tronco embrionárias do camundongo foi estabelecido há décadas e os pesquisadores continuaram a modificar os protocolos anteriores ou criar novos para vários propósitos7,10,11. Utilizamos uma série de ensaios para analisar de forma abrangente a eficiência e o progresso das etapas de diferenciação dos mESCs aos neurônios, que podem ser utilizados na análise de outras diferenciações de linhagem de ESCs de camundongos ou humanos. Além disso, nossas abordagens têm se mostrado ferramentas úteis para avaliar o impacto de genes ou caminhos específicos na diferenciação neuronal in vitro8.
Com nossos métodos, ESCs não comprometidos pluripotentes tratados com ácido retinóico (RA) comprometem-se com a linhagem neural com alta eficiência e são ainda mais induzidos a gerar neurônios7. Para melhorar a diferenciação bem sucedida das células ES em células neurais e reduzir a heterogeneidade, é importante manter as células ES em um estado indiferenciado12. Mefs não proliferativos, tratados com γ-irradiação ou mitomicina C, funcionam para manter a pluripotência dos ESCs e fornecer um andaime para seu crescimento13,14. Para obter resultados consistentes, iniciamos cada experimento de diferenciação com meFs cultivados em MEFs irradiados γ. Depois de algumas passagens, os MEFs irradiados γ morrem e a cultura eventualmente se torna homogênea para células mESC. Alternativamente, os mESCs podem ser pré-banhados em gelatina por cerca de 45 minutos antes que mefs irradiados γ sejam semeados para removê-los melhor na próxima passagem. O fator inibidor da leucemia (LIF) tem sido usado há muito tempo para manter o estado de pluripotência das células ES cultivadas do camundongo, ativando a via JAK/STAT15,16,17. Mais recentemente, PD0325901 (PD, um inibidor mek) e CHIR99021 (CH, um inibidor GSK) foram encontrados para fornecer manutenção adicional de pluripotência das células ES3,18. Em nosso protocolo, culturamos mESCs com esses inibidores junto com o LIF para manter alta pluripotência de mESCs.
Outro fator crítico para alcançar uma diferenciação bem sucedida é a qualidade dos EBs. Realizamos a diferenciação das células E14 pelo método de queda suspensa, que tem sido aplicado por outros investigadores5,19,20. Com este método, as células ES únicas podem suspender na gotícula média de diferenciação por 2 dias onde agregam espontaneamente e formam EBs. Os EBs resultantes são tipicamente mais bem definidos em termos de sua morfologia (Figura 2B) em comparação com o método de suspensão de mESCs isolados em médios, o que resulta em tamanhos de EB em uma faixa muito mais ampla em nossa experiência (dados não mostrados). Para evitar que os EBs se conectem às placas, é importante fazer uma rotação de baixa velocidade a partir do 3º dia continuando através do processo de diferenciação. Os EBs são induzidos a se diferenciar em NPCs, tratando-os com RA. Os NPCs resultantes do tratamento de RA no eB dia 4 são tipicamente heterogêsos para células neurais como oligodenrócitos e astrócitos21. Usando RT-qPCR ou imunofluorescência, a população de NPC pode ser sondada para neurônios e outros marcadores de linhagem neural, como Gfap para astrócitos e Olig2 para oligodendrocitos. Para induzir ainda mais a diferenciação de NPCs em neurônios, os NPCs são cultivados em meio neurônio ideal onde os componentes mais importantes são os suplementos N2 e B27. O suplemento N2 funciona principalmente para ajudar os NPCs a se comprometerem com a linhagem neuronal, enquanto o suplemento B27 funciona para manter a longevidade dos neurônios.
As amostras podem ser coletadas em todo o período de diferenciação (por exemplo, estágio ESC, EB dia 2, EB dia 4, NPC dia 6, NPC dia 8, neurônios dia 10 e neurônios dia 12) para acompanhar o processo de diferenciação realizando RT-qPCR para marcadores de pluripotência e encitoderme. Comparando os marcadores pluripotência como Oct4, Nanog, Sox2, Klf4e Myc entre os diferentes estágios celulares verificará a pluripotência dos mESCs(Figura 3B,F). Para investigar a eficiência da diferenciação neural, marcadores para a camada de mesoderme como Hand1, Snai1e Tbxt; e camada de endoderme como Eomes e Gata4 também podem ser sondadas para (dados não mostrados). Outra verificação pode ser realizada com a sondagem de imunofluorescência (IF) para NPC ou marcadores neuronais(Figura 3A). No entanto, esses métodos não são quantitativos e tendenciosos em relação aos marcadores selecionados. Para superar essas limitações, incorporamos as análises de citometria de fluxo e RNA-seq(Figura 3C\u2012F). A linha celular utilizada no experimento de citometria de fluxo é uma linha celular Sox1-GFP E14, que foi usada especificamente neste experimento para avaliar a qualidade do procedimento de diferenciação do NPC. Sox1 é um dos primeiros marcadores neuronais específicos durante o desenvolvimento de neuroectoderme22, tornando-o um excelente marcador para a linhagem NPC. O Sox1 pode ser sondado para usar RT-qPCR ou mancha ocidental para avaliar a população de NPC. Essas análises são particularmente benéficas para investigar o defeito de diferenciação causado pela manipulação genética ou tratamento químico.
É importante ressaltar que existem algumas limitações ao nosso protocolo aqui apresentados. Em primeiro lugar, estamos apresentando apenas a análise abrangente para uma linha celular mESC tipo selvagem. Outras linhas ESC originárias de camundongos ou humanos podem exigir mudanças e maior otimização no protocolo para garantir uma diferenciação de neurônios bem-sucedida e eficiente. Em segundo lugar, apresentamos um método de diferenciação in vitro de neurônios, que naturalmente carrega seu próprio conjunto de limitações. Como mencionado anteriormente, os EBs são tratados com um nível suprafisiológico de RA para levá-los em direção à linhagem NPC. Os NPCs resultantes são então colocados em mídias ótimas para neurônios para imitar as condições fisiológicas e incentivar o comprometimento, o crescimento e a longevidade da linhagem de neurônios. Aqui, suplementos N2 e B27 são usados para cultivar neurônios, mas outros suplementos também estão disponíveis, como ns2123 para fins semelhantes, o que pode alterar o sucesso e a eficiência da diferenciação de neurônios. Essas condições são sinteticamente reconstituídas nos ensaios da cultura celular, que podem não representar totalmente as condições fisiológicas. A qualidade dos EBs, NPCs e neurônios depende muito dos mESCs iniciais. os mESCs que foram aprovados por muitas vezes e mantidos na cultura por mais de 1 semana normalmente começam a perder pluripotência e podem não sofrer com sucesso na diferenciação. Assim, manter os mESCs em uma condição ideal é fundamental para garantir que eles possam efetivamente se diferenciar em EBs, NPCs e neurônios. Outros métodos de cultura de neurônios, como modelos 3D, também foram propostos para melhor imitar as condições fisiológicas24,25,26 às vezes em detrimento do throughput e da viabilidade27,28. Acreditamos que nossos protocolos são úteis para caracterizar esses modelos de cultura 3D.
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Disclosures
Os autores declaram que não há interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do NIH (1R35GM133496-01) para Z. Gao. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Ryan Hobbs pela ajuda na secção. Agradecemos as instalações principais da Penn State College of Medicine, incluindo as Ciências do Genoma e Bioinformática, a Imagem Avançada de Microscopia de Luz e a Citometria de Fluxo. Agradecemos também ao Dr. Yuka Imamura pela assistência na análise do RNA-seq.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| - Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| - Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| - Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| - Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
References
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